Un modèle de souris d’une Obstruction intestinale partielle

Résumé

Occlusions intestinales sont une obstruction partielle ou complète de l’intestin qui peut causer des douleurs abdominales, nausées, vomissements et empêchant le passage des selles. Cette procédure de création intestinales partielles obsructions chez la souris est fiable en étudiant les mécanismes qui sous-tendent la croissance des cellules pathologiques et la mort dans l’intestin.

Résumé

Les occlusions intestinales, qui entravent ou bloquent le mouvement péristaltique, peuvent être causées par des adhérences abdominales et plus gastro-intestinal (GI) maladies, y compris des croissances tumorales. Cependant, transformant des mécanismes cellulaires impliqués dans et causés par, occlusions intestinales sont mal comprises. Plusieurs modèles animaux d’occlusions intestinales ont été développées, mais le modèle murin est la plupart du coût/temps efficace. Le modèle de souris utilise l’implantation chirurgicale d’une obstruction intestinale partielle (PO) qui a un taux de mortalité élevé si elle n’est pas réalisée correctement. En outre, souris recevant la chirurgie PO ne se développent pas hypertrophie si un blocus approprié est employé pas ou pas correctement placé. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la chirurgie de PO qui produit fiables et reproductibles des occlusions intestinales avec un taux de mortalité très faible. Ce protocole utilise un anneau de silicone placé chirurgicalement qui entoure l’iléon qui bloque partiellement les mouvements digestifs dans l’intestin grêle. L’obstruction partielle rend l’intestin deviennent dilatés en raison de l’arrêt du mouvement digestive. La dilatation de l’intestin induit hypertrophie de muscle lisse du côté oral de la bague qui progressivement se développe sur deux semaines jusqu'à ce qu’elle entraîne la mort. Le modèle de souris PO chirurgical offre un modèle in vivo de tissu intestinal hypertrophique utile pour étudier les changements pathologiques des cellules intestinales, y compris les cellules musculaires lisses (SMC), cellules interstitielles de Cajal (CIC), PDGFRα⁺et neuronale cellules lors du développement d’une occlusion intestinale.

Introduction

Occlusions intestinales sont un blocage partiel ou complet dans l’intestin de petite ou grande, qui empêche les aliments digérés, fluides et gaz de se déplacer à travers les intestins¹. En raison de l’obstruction, l’obstruction provoque la paroi intestinale pour devenir épaissi, rétrécissement de la lumière². Une occlusion intestinale peut se produire à la suite de chirurgies abdominales ou pelviennes qui provoquent la formation de tissu d’adhérences abdominales ou de troubles gastro-intestinaux tels que les maladies inflammatoires de l’intestin (maladie de Crohn), hernies, volvulus, diverticulite, sténose, invagination intestinale, constipation, fécalome, pseudo-occlusion, cancers et tumeurs^3,4,5. Les occlusions intestinales dans ces cas entraînent souvent l’hypertrophie de la musculeuse de la tunique de l' intestin⁶.

PO de la lumière provoque une distension intestinale et augmente l’épaisseur de la couche de muscles lisses autour de l’obstruction en réponse à la nécessité de poursuivre le péristaltisme fonctionnelle^{7,8,9,10, 11,12,13}. Modèles animaux de PO intestinale ont été développés pour étudier hypertrophie de muscle lisse au souris⁷rats¹⁰, cochons d’Inde¹¹, chiens¹²et chats¹³ qui constamment se développent une hypertrophie similaire au sein de la couches de muscles intestinaux.

Un modèle murin de PO intestinale est la façon la plus rentable de générer et d’étudier les occlusions intestinales en vivo. Obstruction de l’intestin grêle est effectuées chez la souris à l’aide d’un anneau de silicone placé chirurgicalement entourant l’iléon. Les souris PO a montré une augmentation rapide du nombre de cellules (hyperplasie) et une augmentation dans l’épaisseur de la couche musculaire (hypertrophie) après chirurgie de PO^8,15. SMC sont des cellules primaires en plastique qui sont développent dans les couches musculaires lisses en réponse à des conditions hypertrophique¹⁴, mais autres cellules comme ICC et cellules PDGFRα⁺ qui sont étroitement associées à la SMC, sont également remplis à nouveau. Nous avons déjà signalé que les souris PO développent une hypertrophie dans l’intestin grêle, dans laquelle SMC sont dédifférenciées en cellules PDGFRα⁺ qui sont hautement proliférante^7,15,16. À l’inverse, ICC sont dégénéré et perdu au sein des couches de muscle lisse hypertrophié durant l’élaboration du obsruction intestinal,⁷. Un autre avantage majeur du modèle PO est sa capacité à induire des changements dans le système nerveux entérique et multiplication des patrons moteurs neurogènes. La multiplication majeur neurogène patron moteur dans l’intestin grêle de la souris est le complexe moteur migratoire (MMC), qui est neurogène et ne requiert pas de ICC ou ondes lentes électriques¹⁷. Le modèle PO peut donner un aperçu clair de comment les MMCs et nerfs entériques sont remodelés par une obstruction partielle.

Ici, nous vous proposons un protocole murin pour la chirurgie intestinale PO à l’aide d’un anneau de silicone. Souris recevant la chirurgie PO fiable produisent une hypertrophie de la musculeuse de la tunique de l’intestin grêle. Au sein du muscle hypertrophique, SMC, ICC, PDGFRα⁺et les cellules neuronales sont considérablement remodelées.

Protocole

Le protocole suivant a été approuvé par le Comité utiliser (IACUC) à l’Université du Nevada-Reno (UNR) des ressources animales et d’institutionnels animalier et est conforme à toutes les directives éthiques institutionnelles relatives à l’utilisation des animaux de recherche.

1. les animaux.

1. Obtenir des souris C57BL/6 de maturité (4-6 semaines) pesant entre 20-30 g. maison de la colonie de souris de laboratoire dans une animalerie centralisée à ressources animales de l’UNR.

2 chirurgie de l’Obstruction partielle

NOTE : Les chirurgies sont effectuées dans une salle dédiée aux interventions chirurgicales. Tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés à l’autoclave avant la chirurgie. Gants et blouses stériles doivent être portées par tout le personnel dans la salle de chirurgie en permanence.

1. Préparation pour la souris chirurgicale
   1. Vérifier le système de livraison anesthésique afin d’assurer l’approvisionnement en oxygène et isoflurane est suffisant pour la procédure. Allumez l’alimentation en oxygène. Allumez le débitmètre gaz et ajustez-la à 500-1000 mL/min. Place l’animal dans la chambre de l’induction et sceller la partie supérieure.
   2. Allumez le vaporisateur isoflurane à 5 % et surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il devienne couché. Le système de livraison anesthésique Placez-vous dans le cône de nez.
   3. Vider la chambre d’induction des gaz résiduel avec l’oxygène, puis éteignez la ligne de chambre induction tout en gardant la ligne du cône de nez ouvert.
   4. Retirer l’animal de la chambre et placez-la pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal.
   5. Placez le cône de nez sur un coussin chaud préchauffé lorsque le gaz continue de s’écouler.
   6. Changer le débit d’oxygène à 100-200 mL/min, avec 2-3 % isoflurane. Si l’animal commence à se déplacer, gentlyrestrain l’animal avec le cône de nez sur jusqu'à ce que complètement anesthésiés à nouveau.
   7. Surveiller la respiration et la réponse à la stimulation au cours de la procédure et ajustez le pourcentage d’isoflurane (2-5 %), selon vos besoins. Niveau anesthetization animal est surveillé par le manque de réflexe pincée orteil avant la chirurgie est pratiquée.
   8. Injecter par voie intrapéritonéale médecine de la douleur (buprénorphine, 1 µg/g de poids corporel) loin du lieu de l’incision.
   9. Appliquer lotion d’enlèvement de cheveux sur l’abdomen à l’aide d’un coton-tige. Laissez la se reposer lotion pendant 3-5 min sur la souris, puis enlever les poils à l’aide de tampons de gaze et de coton. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les cheveux a été retiré de l’abdomen de la souris.
   10. Nettoyer la peau avec de l’éthanol 70 % à l’aide de tampons de gaze et de coton. Appliquer la solution antiseptiques ou povidone-iode pour nettoyer l’abdomen.
2. Chirurgie de l’obstruction partielle
   1. Drapez le site chirurgical en utilisant 25 x 50 cm papier stérile avec un 2,5 x 2,5 cm ouverture au milieu pour le domaine de la chirurgie. Fixez le drapé à l’animal en plaçant des bandes stériles aux limites de l’ouverture et la peau.
   2. Faire une incision abdominale de ~3.0 cm, longitudinalement à l’aide d’un scalpel de lame n15, veiller à ce que seule la peau est incisée et en évitant de couper dans la couche musculoperitoneal en ce moment.
   3. À l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux, séparez avec précaution la peau de la couche de musculoperitoneal sans causer aucune incision à la couche musculoperitoneal. Après les couches ont été suffisamment séparés (environ 1 cm x 4 cm), identifiez la linea alba sur la couche musculoperitoneal et la coupe ~ 2 cm le long de la linea alba pour exposer la cavité intrapéritonéale à l’aide de micro-pinces et ciseaux.
   4. Soigneusement, localiser et identifier le caecum. Lentement et délicatement retirer le caecum de la cavité intrapéritonéale avec micro-pinces, ce qui porte le côlon proximal et l’iléon avec le caecum dehors sur le drap stérile. Immédiatement, humidifier le tissu intestinal avec gaze imbibé saline stérile de 0,9 % et garder les tissus exposés humidifié en permanence alors qu’ils sont à l’extérieur de la cavité abdominale.
   5. Localiser et identifier le mésentère entre l’iléon et le côlon proximal. Faire une incision (~ 1 cm) en parallèle et juste en dessous, l’iléon, dans le mésentère et évitez de couper n’importe quel système vasculaire.
   6. Prendre un anneau de silicone autoclavable (6 mm de longueur, diamètre extérieur 4 mm, 3,5 mm de diamètre intérieur). Couper longitudinalement pour ouvrir le tube et l’anneau avec une micro-pince.
   7. Insérez une extrémité de l’anneau ouvert dans l’incision dans le tissu du mésentère. Retourner l’anneau à une forme d’anneau terminé en apportant une extrémité en contact avec un autre, avec l’iléon entouré par l’anneau.
   8. S’assurer que l’anneau de silicone entoure complètement l’iléon, fermer l’anneau avec la suture et replacez soigneusement les intestins dans la cavité intrapéritonéale.
3. Fermeture de la chirurgie
   1. Effectuez un simple suture continue sur la couche de musculoperitoneal le long de la linea alba pour fermer la musculoperitoneal enroulés avec une suture résorbable. Lorsque la suture est terminée, nettoyez tout saignement avec gaze imbibé saline stérile de 0,9 %.
   2. Pour fermer complètement la plaie, avec une suture nylon distinct, effectuer une suture simple continue sur la peau.
   3. Après ont effectué les deux sutures, nettoyer la plaie avec la nouvelle swabstick ou povidone-iode.
   4. Injecter par voie intrapéritonéale des antibiotiques (gentamicine, 150 μL / souris basée sur 20-30 g de poids corporel).
   5. Après l’achèvement de la procédure, éteignez le vaporisateur isoflurane et permettre à l’animal de respirer seulement s’écoulant oxygène jusqu'à ce qu’il commencer prendre conscience.
   6. Une fois l’animal éveillé, placer l’animal dans une zone de récupération distinct avec support thermique jusqu'à ce que complètement guéri.

3. après les opérations observation.

1. Après l’achèvement de la chirurgie, déplacer les animaux à un incubateur dans une salle de réveil où la température et l’humidité sont réglementés. Surveiller les animaux après l’opération toutes les 15 min pour la première heure, puis toutes les 30 minutes pour la deuxième heure, tandis que les animaux sont dans l’incubateur.
2. Dès que l’observation prescrite est terminée, déplacer les animaux pour leur propre cage individuelle et assurer le suivi quotidien des signes cliniques de la douleur,¹⁸et à veiller à ce que la plaie chirurgicale est la guérison correctement sans aucun signe de complications ( déhiscence) présents.

Résultats

Obstruction partielle (PO) a été chirurgicalement induite chez les souris âgés d’un mois en plaçant un anneau de silicone autour de l’iléon à proximité du sphincter iléo-caecale. Cet anneau a créé une obstruction partielle dans l’iléon. Opérations de Sham (SO) ont aussi été réalisées sans un anneau sur l’âge et le sexe égalé souris et ces souris n’ont pas montré des symptômes similaires à ceux observés chez les souris de PO. Souris se remit rapidement d?...

Discussion

Nous avons démontré que les souris ayant reçu la chirurgie intestinale de PO systématiquement et de façon reproductible développent hypertrophie de muscle lisse intestinal, qui imite une obstruction intestinale humaine. Chirurgies de l’occlusion intestinale ont été développés pour différents animaux dont⁷de la souris, rats¹⁰, cobayes¹¹, chiens chats et^{12 13}. Le modèle murin d’obstruction...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical drape	Medical and veterinary supplies	SMS40	40”X100 yards
Underpad, econ, pro plus	Medical and veterinary supplies	MSC281224	17x24”
Iris scissors	Braintree scientific, Inc	SC-i-130
Iris scissors	Vantage	V95-304
Dumont electronic & jeweler tweezers	Dumont	98-180-3
Braided absorbable suture	Covidien polysorb	SL-5687G	5-0, polyglactin
Nylon non-absorbable mono filament	AD surgical	S-N618R13	6-0, nylon
Surgical blade	Dynarex		No.15
Needle holder	Jacobson microvascular	36-1342TC	8.5 inch
Scalpel handle	Flinn scientific	AB1049
Microsurgical scissor	WPI	503305
Petrolatum ophthalmic ointment	Puralube VET		3.5 g
Fluriso (isoflurane)	Vetone	V1 502017	250 ml
Steri-strip reinforced skin closure	3M	R1547
Surgical gloves	Medline	MSG2270
Ear loop face mask	The safety zone	RS700
Avant gauze non-woven sponges	Caring	PRM25444
Surgical cup	Admiral  craft OYC-2	725-A42	2.5 oz
Swabstick	ChloraPrep	260103	2% w/v Chlorhexidine  Gluconate (CHG) and 70% v/v Isopropyl Alcohol (IPA)
Cotton tipped applicator	Puritan	806-WC
Buprenorphine	Zoo pharm	BZ8069317	1 mg/ml
Gentamycin sulfate	Vetone	G-6336-04	100 mg/ml
Fast acting gel cream remover	Veet	8111002
Syringe	AHS	AH01T2516	1 ml with needle
Silicon ring	VWR	60985-720	6 mm in length, 4 mm exterior diameter, 3.5 mm interior diameter
C57BL/6 mice	The Jackson Laboratory		4-6 weeks old