哺乳动物基因翻译起始复合体形成的 Toeprinting 分析

摘要

Toeprinting 的目的是测量体外转录 RNA 的能力, 在各种条件下形成与核糖体的翻译起始配合物。该协议描述了一种 toeprinting 哺乳动物 RNA 的方法, 可用于研究 cap 依赖和 IRES 驱动的翻译。

摘要

翻译起始是蛋白质合成的速率限制步骤, 是细胞调节蛋白质输出的关键点。调控蛋白质合成是细胞应激反应的关键, 失调是许多疾病状态的中心, 如癌症。例如, 虽然细胞应力导致了全球翻译的抑制, 通过衰减上限依赖性的启动, 某些应力反应蛋白有选择地翻译成与盖帽无关的方式。谨慎的 RNA 调控元素, 如细胞内核糖体进入站点 (IRESes), 允许翻译这些特定的基因。这种基因的识别, 以及它们的调控机制的特性, 一直是分子生物学中的一个关键领域。Toeprinting 是一种研究 RNA 结构和功能的方法, 它与翻译起始有关。toeprinting 的目的是评估体外转录 RNA 在各种条件下与核糖体形成稳定的配合物的能力, 以确定核糖体中涉及的序列、结构元素或辅助因素绑定-一个前游标有效的翻译启动。除了其他技术, 如西方分析和 polysome 分析, toeprinting 允许一个强大的特点的机制, 调整翻译的启动。

引言

由于翻译消耗了大部分的细胞能量, 所以翻译被严格管理的¹是有意义的。相反, 失调的翻译, 以及随之而来的蛋白质输出的改变, 经常被观察到应激反应和疾病状态, 如癌症^1,2。平移控制的一个主要优点是细胞能够改变蛋白质输出的速度, 以响应各种刺激³。因此, 翻译规则是一个重要的机制, 可以影响细胞生存和死亡^1,2,3。在翻译步骤中, 启动是最受高度管制和复杂的³。简单地说, 大多数真核基因包含5是⁷G cap, 几乎总是对他们的翻译至关重要。cap 依赖启动需要真核启动因子 eIF4E, eIF4A 和 eIF4G (cap 识别复合体), 以互动的 5 ' 末端的 mRNA。43S preinitiation 核糖体复合体, 包含 eIF2-bound 引发器 tRNA 和 eIF3, 被招募到 5 ' 末端的 mRNA通过eIF4G 与 eIF3 的相互作用。preinitiation 复合体被认为扫描 mRNA, 由 eIF4A (RNA 旋) 辅助, 直到开始密码子 (AUG) 的位置。48S 起爆复合体随后形成, tRNA 被交付到核糖体的 P 位点。最后, 60S 和40S 核糖体亚基联合形成80S 起始复合体, 后跟翻译伸长^1,3,4。相比之下, 内部核糖体进入站点 (IRESes) 通过将40S 核糖体亚基直接招募到起始密码子³, 绕过 5 ' cap 的要求。由于主要的真核致动因子 (eIFs) 的修饰, 生理应激条件减弱了全球 mRNA 的转化。然而, 非规范的翻译启动机制允许选择性地翻译某些基因经常编码的应力反应蛋白, 和失调的非规范化的翻译启动是牵连到疾病的状态, 如癌症^1,2. 谨慎的 RNA 管理元素, 如蜂窝 IRESes, 允许翻译这样的基因^2,3。

翻译控制的一个特别有趣的方面是了解给定 mRNA 的规范化与非规范化翻译的机制。Toeprinting 是一种技术, 允许详细的机械研究的翻译启动特定 rna在体外。toeprinting 的总体目标是评估一个有兴趣的 RNA 的能力, 以核化在各种条件下与核糖体形成的翻译起始复合体, 以确定哪些序列、结构元素或附件有效的翻译启动需要考虑因素。例如, 核糖体的招募可能会受到阻碍, 因为没有 5 ' 盖帽, 但刺激的存在 IRES。

该技术的原理是体外转录一个感兴趣的 RNA, 在含有翻译成分 (或纯化成分) 的细胞萃取物的存在下孵化它, 以允许起始络合物形成, 并反转转录具有特定底漆的 RNA。稳定的 RNA 核糖体复合物将导致反向转录在核糖体的 3 ' 边缘-所谓的 ' toeprint '^5,6,7。

在本协议中, eIFs 的核糖体亚基、tRNAs 和 IRES反式作用因子 (ITAFs) 由兔网织红细胞裂解 (RRL) 方便地贡献。该协议的另一个优点是使用荧光标记的底漆和荧光凝胶为基础的成像仪, 而不是核素底漆。这消除了额外的步骤, 包括 radiolabeling 底漆, 以及干燥的凝胶和暴露在一个强化的屏幕。荧光带是实时记录, 因为凝胶运行, 允许更大的分辨率。名额 X 链细胞凋亡蛋白 (XIAP) IRES RNA 作为一个例子在这里, 虽然上限基因也可以分析此技术⁸。

与西方分析不同的是, 它测量了细胞裂解物中翻译过程的最终输出, toeprinting 是一种体外方法, 用于测量 RNA 上的翻译起始复杂形成。这种简化方法允许对调节翻译起始的基板或因素进行高度详细的研究 (e. g., 有上限或未覆盖的 mRNA, IRES 结构, 存在或没有聚尾, 提供特定的蛋白质因素,等)。因此, toeprinting 可以用来研究不同的翻译模式⁸或 mRNA 结构的影响, 如 IRESes, 对蛋白质合成^9,10。

研究方案

注意: RNA 极易被 ribonucleases (RNases) 降解。采取标准的预防措施, 保持 RNA 完好无损。经常更换手套。在协议的所有步骤中使用过滤过的吸管提示、无核酸酶 plasticware 和无核酸酶化学品。使用无核酸酶或二乙基焦碳酸 (DEPC) 处理水的所有解决方案。

1. 解决方案的准备工作

1. 准备 Toeprinting 缓冲器:20 毫米三盐酸 (pH 7.6), 100 毫米 KOAc, 2.5 毫米毫克 (华侨)₂, 5% (瓦特/v) 蔗糖, 2 毫米 dithiothreitol (德勤), 0.5 毫米胺。
   1. 在-20 摄氏度的单用途整除数中存储数码和胺, 以避免重复的冻融循环。
      注: 在使用前应立即将胺和 toeprinting 缓冲器添加到该缓冲区中。缺乏胺的解决方案可以存储在-20 摄氏度。
2. 制备整除数85毫米 5 '-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) 和91毫米三磷酸腺苷 (ATP)。把整除数-20 摄氏度。
3. 准备450毫升 6% polyacrylamide-7M 尿素凝胶混合: 67.5 毫升40% 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺 (19:1), 189 克尿素, 112.5 毫升 5x (三/硼酸/thylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)) 和120毫升水。在37摄氏度的水浴或热板上搅拌, 溶解尿素。筛选解决方案 (e. g, 0.2 微米硝化棉真空过滤器)。
   注: 解决方案可存储在4摄氏度, 至少一个月。
   注意: 单体丙烯酰胺是一种可以通过皮肤吸收的神经毒素。小心避免皮肤接触 (i. e), 戴上手套, 实验室大衣, 眼睛保护)。聚丙烯酰胺也应小心处理, 因为聚合可能不会进行100% 完成。
4. 制备甲酰胺负载染料: 95% 甲酰胺, 18 毫米 EDTA, 0.025% (w/v) 月桂酸钠 (SDS), 0.025% (w/v) 溴酚蓝, 0.025% (瓦特/v) 二甲苯蓝。存储在-20 摄氏度。
5. 溶解 1 nmol 底漆 (5 ' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5 ' 末端标记以 IRDye 800) 入 100 ul 水为 10 pmol/ul 的工作集中。存储在-20 °c 在单一使用整除数 (大约10µL), 保护免受光。

2. mRNA 的制备

1. 从适当的模板 (i. e、基因组 dna 或质粒 dna) 放大 dna 模板, 以聚合酶链反应 (PCR) 合成 mRNA。使用高保真 DNA 聚合酶根据制造商的指示, 以以下反应条件 (35 个周期): 熔化, 98 °c, 十年代;退火, 53 °c, 二十年代;延伸, 72 °c, 三十年代。
   注: 前底漆 (5 ' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) 包含 T7 启动子序列, 允许 RNA 转录;反向底漆 (5 ' T₅₁GAATTCGGATCCGACCGTGG) 包括51嘧啶残留物, 为转录 RNA 提供一个聚尾。请注意, RNA 也可以从质粒 DNA 中转录为体外。
2. 使用适当的转录试剂盒体外转录含有 IRES 的 rna 或 DNA 模板中的标记 rna。按照制造商的说明进行操作。在标准的 20 ul 反应量中准备 RNA 样品。治疗新合成的 RNA 与2单位的 RNase 无 DNase 30 分钟37摄氏度。
3. 将 DNase 处理的 RNA 稀释至110µL, 核酸酶无水加110µL 酸苯酚, 涡 5 s 和离心机在室温下 2万 x g 的3分钟。去除100µL 的水相到一个新的1.5 毫升离心管, 添加10µL 的3米醋酸钠, 和涡旋 2 s. 添加3容量100% 乙醇, 涡流 5 s, 并在-20 °c 一夜之间沉淀 RNA。
4. 离心机在 > 2万 x g 30 分钟4摄氏度, 并丢弃上清。用500µL 的冰冷 70% (v/v) 乙醇清洗颗粒, 重复离心。吸入尽可能多的上清, 空气干燥的颗粒为 5-10 分钟. 小心不要把球团取出来。
5. 并用重悬 RNA 在适当的容量核酸酶水中产生0.5 微克/ul 的工作浓度。这可以存储在-80 摄氏度或立即使用。

3. Toeprinting 反应

1. 混合 15 ul 的兔子网织裂解 (RRL, 不核酸酶处理), 1 ul (40 单位) 的 RNase 抑制剂, 1 µL 91 毫米 ATP (1.82 毫米最后) 和 1 ul GMP-PNP (85 毫米决赛) 在1.7 毫升离心管。孵育30°c 5 分钟。
   注: RRL 应 aliquoted 用于单一用途, 以避免重复冻融。临界控制是缺乏 RRL 的反应, 为了阐明反向转录的自然停顿由于 RNA 的次要结构。添加 toeprinting 缓冲区以替换此控件的 RRL。
2. 添加0.5 µg (1 µL) RNA 和孵育30°c 5 分钟。
3. 添加22µL 的 Toeprinting 缓冲和孵化在30摄氏度3分钟。
4. 添加0.5 µL (5 pmol) 的 IRDye 标记底漆和孵化在冰上10分钟。
5. 添加2µL 25 毫米 dNTPs (最终浓度: 1 毫米), 2 µL 100 毫米毫克 (华侨)₂, 1 µL 的禽 Myeloblastosis 病毒逆转录酶 (AMV RT) 和3.5 µL Toeprinting 缓冲。最后的音量是 50 ul。
6. 孵育反应在30°c 45 分钟。
7. 添加200µL 的核酸酶水, 并立即提取与250µL 25:24:1 phenol:chloroform:isoamyl 酒精 (pH 约 8.0)。涡流 5 s 和离心机在 2万 x g 在室温下3分钟。去除水相到一个新的1.5 毫升离心管, 增加3容量100% 乙醇, 漩涡 5 s, 并且沉淀在-20 °c 隔夜。
8. 离心机在 > 2万 x g 30 分钟4摄氏度, 并丢弃上清。用500µL 的冰冷 70% (v/v) 乙醇清洗 DNA 颗粒。离心机在 > 2万 x g 15 分钟4摄氏度。吸入尽可能多的上清, 空气干燥颗粒为 5-10 分钟. 小心不要把球团取出来。
9. 在 6 ul 的无核酸酶水中溶解颗粒, 加入3的甲酰胺负载染料 ul。

4. 测序反应

1. 使用 DNA 模板从2.1 和 IRDye 标记底漆从步骤3.4 的标准排序反应, 使用 dideoxynucleotides (ddNTPs) 作为链终结器。使用适当的 DNA 测序套件, 并按照制造商的指示。
2. 混合 6 ul 的每一个排序反应与 3 ul 的甲酰胺负载染料。

5. 序凝胶和电泳的制备

注: 本协议使用荧光凝胶为基础的成像仪和21厘米 x 23 厘米 x 0.2 毫米凝胶, 但可以适应其他音序器或凝胶大小, 如果需要的话。

1. 彻底清洁0.2 毫米垫片以及短 (23 x 25 厘米) 和长 (30 x 25 厘米) 玻璃板与100% 乙醇。空气干燥。
2. 混合30毫升 6% polyacrylamide-7M 尿素凝胶混合 200 ul 10% (瓦特/v) 过硫酸铵 (APS) 和 20 ul 的 tetramethylethylenediamine (TEMED)。倒入凝胶, 小心避免气泡, 并插入 ' 鲨鱼牙齿 ' 凝胶梳子。允许凝胶在室温下聚合1小时。
3. 装配测序仪, 用1x 填充储层。
4. 在1500伏前运行15分钟, 直到达到55摄氏度的最佳温度。
5. 将样品/负载染料混合 (从步骤3.9 或 4.2) 加热到85摄氏度, 5 分钟. 将 1 ul 加载到排序凝胶上。
6. 用1500伏的凝胶8小时。这台机器将实时读取波段。
7. 拆卸设备, 处理丙烯酰胺凝胶和运行缓冲器。

结果

我们以前描述了 XIAP IRES 支持与 cap 无关的翻译启动的体外^8,10的能力。Toeprinting 是讯问 XIAP IRES 起爆复合体机械细节的关键技术。对包含 XIAP IRES (图 1A) 的 mRNA 进行编码的 DNA 构造是体外转录并受到 toeprinting 分析。此处使用的 XIAP IRES mRNA 的变种变体在图 1

讨论

Toeprinting 是一种强有力的技术, 直接测量一个 RNA 的能力, 以支持在高度控制条件下的翻译起始配合物的形成。该协议描述了一种 toeprinting 哺乳动物 rna 的简化技术。兔网织红细胞裂解剂 (RRL) 是一种方便的核糖体、eIFs、引发 tRNA 和 IRES反式作用因子 (ITAFs) 的来源。实验者提供他们的选择 RNA, 也可以补充 toeprinting 反应与他们选择的特定辅助因子。例如, 48S vs 80S 平移起始配合物可以根据 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D5758-100ML
TRIS base, Ultrapure	JT Baker	4109-01
KOAc (Potassium acetate)	Bio Basic	PB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)	Bio Basic	MB0326
Sucrose, molecular biology grade	Calbiochem	573113-1KG
Spermidine	Sigma	85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution	Sigma	G0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution	Sigma	A6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%	Bio Basic	A0006
Urea	Bio Basic	UB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µm	Sarstedt	83.1823.101
Formamide	Sigma	F9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)	Bio Basic	EB0185
SDS	Bio Basic	SB0485
Bromophenol blue	Bio Basic	BDB0001
Xylene cyanol FF	Bio Basic	XB0005
MEGAshortscript T7 transcription kit	Ambion	AM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit	Ambion	AM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)	Ambion	AM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Invitrogen	15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.	Green Hectares, USA		Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	Thermo Fisher	E00382
100 mM dNTPs	Invitrogen	56172, 56173, 56174, 56175	Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µL	Promega	M5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit	Thermo Fisher	707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzer	LI-COR		Product has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)	Bio Basic	AB0072
TEMED	Bio Basic	TB0508
Phusion High Fidelity Polymerase	New England Biolabs	M0530
Turbo Dnase	Thermo Fisher	AM2238