Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

Resumen

Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.

Resumen

Iniciación de la traducción es el paso tarifa-limitador de la síntesis de proteínas y representa un punto clave en el cual las células regulan su producción de proteínas. Regulación de la síntesis de proteínas es la clave para la respuesta de estrés celular, y la desregulación es central a muchos Estados de enfermedad, como el cáncer. Por ejemplo, aunque estrés celular conduce a la inhibición de la traducción global de atenuación dependiente de la tapa de iniciación, ciertas proteínas de respuesta al estrés se convierten selectivamente en forma independiente de la tapa. Elementos reguladores discretos de RNA, como sitios de entrada interna del ribosoma celular (IRESes), permiten la traducción de los mRNAs específicos. Identificación de estos mRNAs y la caracterización de sus mecanismos, han sido una zona clave en biología molecular. Toeprinting es un método para el estudio de RNA estructura y función lo que respecta a la iniciación de la traducción. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos estables con los ribosomas en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias, elementos estructurales o factores accesorios participan en ribosoma vinculante, un pre-cursor de iniciación de traducción eficiente. Junto con otras técnicas, como análisis occidental y polysome perfilado, toeprinting permite una sólida caracterización de mecanismos para la regulación de la iniciación de la traducción.

Introducción

Como traducción consume energía celular más, es lógico que la traducción es bien regulada¹. Por el contrario, la desregulación de la traducción- y las consiguientes alteraciones en la producción de proteína-se observa a menudo en Estados de la respuesta de estrés y enfermedad, como cáncer^1,2. Una ventaja importante de control traduccional es la velocidad con que las células pueden alterar su producción de proteína para responder a diferentes estímulos³. Regulación de la traducción representa así un mecanismo importante que puede influir en la supervivencia celular y la muerte^1,2,3. De los pasos de la traducción, la iniciación es la más altamente regulado y complejo³. Brevemente, más eukaryotic mRNAs contiene una 5' m⁷G tapa que casi siempre es esencial para su traducción. Dependiente de la tapa de iniciación requiere eIF4A y eucariótico de iniciación factores eIF4E y eIF4G (el complejo cap-reconocimiento) para interactuar con el extremo 5' del mRNA. 43S preinitiation ribosome complejo, que contiene eIF2-limite iniciador ARNt y eIF3, es reclutado para el extremo 5' de los ARNm a través de una interacción de eIF4G con eIF3. El complejo de preiniciación está pensado para escanear mRNA, ayudados por eIF4A (una RNA helicasa) hasta que encuentra el codón de inicio (AUG). Posteriormente se forma el complejo de iniciación 48S y tRNA se entrega en el sitio P del ribosoma. Finalmente, las subunidades 60S y 40S del ribosoma se unen para formar el inicio de los años 80 complejo, seguido por la traducción elongación^1,3,4. En cambio, sitios de entrada interna del ribosoma (IRESes) eludir el requisito para un casquillo de 5' mediante la contratación de la subunidad ribosómica 40S directamente a la del codón de iniciación³. Condiciones de estrés fisiológico atenúan mundial traducción del mRNA debido a las modificaciones de los factores clave general eucariótico de iniciación (eIFs). Sin embargo, mecanismos de iniciación de traducción no-canónico permiten traducción selectiva de ciertos mRNAs que codifican a menudo proteínas de respuesta al estrés, y la desregulación de la iniciación de la traducción no-canónico está implicada en Estados de enfermedades como el cáncer ^{1 , 2}. elementos reguladores RNA discreto, como IRESes celular, permiten la traducción de estos mRNAs^2,3.

Un aspecto particularmente interesante de control traduccional es entender los mecanismos de la canónica versus no-canónico traducción de un ARNm determinado. Toeprinting es una técnica que permite el estudio detallado de mecanicista de la iniciación de la traducción de ARN específica in vitro. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de un RNA de interés nuclear la formación de una iniciación de la traducción con el ribosoma en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias de elementos estructurales y accesorios factores son necesarios para la iniciación de la traducción eficaz. Por ejemplo, contratación de ribosoma puede obstaculizado en la ausencia de una 5' cap pero estimulado por la presencia de un IRES.

El principio de la técnica es en vitro transcribe un RNA de interés, incubar en presencia de extractos celulares que contienen componentes de traducción (o los componentes purificados) permitan transcriben de complejos de iniciación para formar y para invertir el ARN con una imprimación específica. Complejos estables de RNA ribosoma hará transcripción reversa a estancar en el 3' borde del ribosoma, el supuesto 'toeprint'^5,6,7.

En este protocolo, subunidades ribosomales, eIFs, tRNAs y IRES trans-acción (ITAFs) están convenientemente contribuyeron por lisado de reticulocitos de conejo (RRL). Otra ventaja de este protocolo es el uso de una cartilla marcada con fluorescencia y reproductor de imágenes de fluorescencia basada en gel, en lugar de una cartilla radiactiva. Esto elimina pasos adicionales, incluyendo radiolabeling la cartilla, así como el gel de secado y exponerlo a una pantalla de intensificación. Las bandas fluorescentes se registran en tiempo real, como el gel, lo que permite una mayor resolución. Esté sin X-ligado inhibidor de apoptosis (XIAP) la proteína IRES ARN se usa como un ejemplo aquí, aunque tapado mRNAs también puede ser analizada por esta técnica⁸.

A diferencia de los análisis de western, que mide el resultado final del proceso de traducción en los lysates de la célula, toeprinting es un enfoque en vitro para medir la formación de complejos de iniciación traducción en un RNA. Este enfoque reduccionista permite el estudio muy detallado de sustratos o factores que regulan la iniciación de la traducción (ej., con o sin tapón mRNA, IRES estructura, presencia o ausencia de cola poly-A, disposición de los factores de la proteína específica, etcetera). Por lo tanto, toeprinting puede utilizarse para estudiar los diferentes modos de traducción⁸ o los efectos de estructuras de mRNA como IRESes, en síntesis de proteínas^9,10.

Protocolo

Nota: El ARN es altamente susceptible a la degradación por ribonucleasas (RNasas). Tomar las precauciones normales para mantener intacto el ARN. Cambiar guantes con frecuencia. Usar filtrado pipetas, recipientes de plástico libre de nucleasas y productos químicos libre de nucleasas en todas las etapas del protocolo. Uso libre de nucleasas o dietil pirocarbonato (DEPC)-tratamiento de agua para todas las soluciones.

1. preparación de soluciones

1. Preparación de buffer de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)₂, 5% (p/v) de sacarosa, espermidina de Ditiotreitol (DTT) y 0,5 mM de 2 mM.
   1. Tienda TDT y espermidina en alícuotas de un solo uso a-20 ° C para evitar ciclos de congelación y descongelación repetida.
      Nota: TDT y espermidina deben agregarse al búfer de toeprinting inmediatamente antes del uso. Una solución que carecen de TDT y espermidina puede almacenarse a-20 ° C.
2. Preparar alícuotas de 85 mM guanylyl 5' imidodiphosphate (GMP-PNP) y 91 mM adenosín trifosfato (ATP). Almacenar las alícuotas a-20 ° C.
3. Preparar 450 mL de mezcla de gel de urea de poliacrilamida - 7M de 6%: 67,5 mL de 40% acrylamide:bis-acrilamida (19:1), 189 g de urea, 112,5 de 5 x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic ácido (EDTA)) y 120 mL de agua. Disolver la urea por calentamiento en un baño de agua de 37 ° C o en un plato caliente con agitación. Filtrar la solución (por ej., 0,2 μm filtro de vacío de nitrocelulosa).
   Nota: La solución puede almacenarse a 4 ° C durante al menos un mes.
   PRECAUCIÓN: Monómero acrilamida es una neurotoxina que puede ser absorbida por la piel. Tener mucho cuidado para evitar contacto con la piel (es decir., guantes, una bata de laboratorio y protección de los ojos). Poliacrilamida también debe manejarse con cuidado, como polimerización no puede proceder a la terminación de 100%.
4. Preparar formamida colorante de carga: 95% formamida, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) sodio dodecil sulfato (SDS), azul de bromofenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) xileno cyanol. Almacenar a-20 ° C.
5. 1 nmol de primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' extremo marcado con IRDye 800) se disuelven en 100 μL de agua para una trabajo de concentración de 10 pmol/μL. Almacenar a-20 ° C en alícuotas de un solo uso (aproximadamente 10 μl), protegidos de la luz.

2. preparación de ARNm

1. Ampliar las plantillas de la DNA para la síntesis de mRNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de las plantillas adecuadas (es decir., ADN genómico o DNA del plasmid, según sea el caso). Uso de una polimerasa de la DNA según las instrucciones del fabricante, de alta fidelidad con las siguientes condiciones de reacción (35 ciclos): derretir, 98 ° C, 10 s; Recueza, 53 ° C, 20 s; extender, 72 ° C, 30 s.
   Nota: El primer forward (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora la secuencia de promotor de T7 para permitir la transcripción de RNA; el primer revés (5' T₅₁GAATTCGGATCCGACCGTGG) incluye 51 residuos de timina para prever una cola poly-A del ARN transcrito. Tenga en cuenta que también puede ser RNA en vitro transcritos del ADN plásmido.
2. Uso un kit apropiado de transcripción in vitro transcribir ARN que contiene IRES o ARN capsulado de la plantilla de la DNA. Siga las instrucciones del fabricante. Preparar la muestra de RNA en volúmenes de reacción μL 20 estándar. Tratar el ARN recién sintetizado con 2 unidades de libre de Rnasa DNasa durante 30 min a 37 ° C.
3. Diluir el ARN tratados con DNasa a 110 μl con agua libre de nucleasa añadir 110 μl ácido fenol, agitarlos durante 5 s y centrifugar durante 3 minutos a 20.000 x g a temperatura ambiente. Quitar 100 μl de la fase acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 10 μl de acetato de sodio de 3 M y s. vortex 2 Agregar 3 volúmenes de etanol al 100%, agitarlos durante 5 s y precipitar el ARN a-20 ° C durante la noche.
4. Centrifugue a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 500 μl de etanol al 70% (v/v) helado y repita la centrifugación. Aspirar tanto el sobrenadante como sea posible y secar el pellet para 5-10 minutos tenga cuidado de no desalojar la pelotilla.
5. Resuspender el RNA en el volumen adecuado de agua libre de nucleasa para producir una concentración de trabajo de 0,5 μg/μL. Esto puede ser almacenado a-80 ° C o utilizar inmediatamente.

3. Toeprinting reacción

1. Mix 15 μL de conejo reticulocitos lisado (RRL, no tratados con nucleasa), (40 unidades) de 1 μL de inhibidor de la Rnasa, 1 μl de 91 mM ATP (1,82 mM final) y 1 μL de 85 mM GMP-PNP (1,7 mM final) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incubar a 30 ° C durante 5 minutos.
   Nota: La RRL debe alícuotas de un solo uso evitar repetidor hielo-deshielo. Control crítico es una reacción falta RRL, para aclarar las pausas naturales de transcripción inversa debido a la estructura secundaria del ARN. Añadir el tampón de toeprinting para reemplazar RRL para este control.
2. Añadir 0,5 μg (1 μl) de ARN e incubar a 30 ° C durante 5 minutos.
3. Agregar 22 μL de tampón de Toeprinting e incubar a 30 ° C por 3 minutos.
4. Añadir 0,5 μl (5 pmol) de primer etiquetado IRDye e incubar en hielo durante 10 minutos.
5. Añadir 2 μl de 25 mM de dNTPs (concentración final: 1 mM), 2 μl de 100 mM de Mg(OAc)₂, 1 μl de aviar Myeloblastosis Virus de la transcriptasa reversa (RT-AMV) y 3,5 μl de tampón de Toeprinting. El volumen final es de 50 μL.
6. Incubar la reacción a 30 ° C por 45 min.
7. Añadir 200 μL de agua libre de nucleasas y extraer inmediatamente con 250 μl de fenol: cloroformo: isoamílico de 25:24:1 alcohol (pH aproximadamente 8.0). Agitarlos durante 5 s y centrifugue a 20.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retirar la fase acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL, agregar 3 volúmenes de etanol al 100%, agitarlos durante 5 s y precipitar a-20 ° C durante la noche.
8. Centrifugue a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet de ADN con 500 μl de etanol al 70% (v/v) helada. Centrifugue a > 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Aspiración flotante tanto como sea posible y seque el precipitado durante 5-10 minutos tenga cuidado de no desalojar la pelotilla.
9. Disolver el precipitado en 6 μL de agua libre de nucleasas y agregar 3 μL de formamida carga del tinte.

4. secuencia de reacciones

1. Utilice la plantilla de la DNA de 2.1 y la cartilla IRDye-etiquetados en el paso 3.4 para las reacciones de secuenciación estándar, utiliza dideoxynucleotides (ddNTPs) como terminadores de cadena. Utilice un kit de secuenciación de ADN adecuado y siga las instrucciones del fabricante.
2. Mezcla 6 μL de cada reacción de secuenciación con 3 μL de formamida carga del tinte.

5. preparación de la secuenciación Gel y electroforesis

Nota: Este protocolo usa un sensor de fluorescencia basada en gel y una 21 cm x 23 cm x 0,2 gel de mm, pero puede ser adaptado para otros secuenciadores o tamaños de gel, si es necesario.

1. Limpie bien los espaciadores de 0,2 mm, así como el corto (23 x 25 cm) y placas de vidrio de largo (30 × 25 cm) con 100% de etanol. Secar al aire.
2. Mezclar 30 mL de gel de urea de 6% poliacrilamida - 7M se mezclan con 200 μL de persulfato de amonio 10% (p/v) (APS) y 20 μL de tetramethylethylenediamine (TEMED). Verter el gel, teniendo cuidado para evitar burbujas e inserte el peine de 'dientes de tiburón' gel. Permita que el gel polimerice durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Montar el aparato de la secuencia y llenar los depósitos con 1 x TBE.
4. Funcionamiento previo durante 15 min a 1500 V hasta alcanzar la temperatura óptima de 55 ° C.
5. Calentar la mezcla de tinte de la muestra/carga (de medidas 3.9 o 4.2) a 85 ° C por 5 min carga 1 μL en el gel de secuenciación.
6. Correr el gel a 1500 V de 8 h. La máquina Lee las bandas en tiempo real.
7. Desmontar el aparato y elimine el gel de acrilamida y buffer de corriente.

Resultados

Anteriormente hemos descrito la capacidad de los IRES XIAP para apoyar la iniciación de la traducción de la casquillo-independiente en vitro^8,10. Toeprinting fue la técnica clave para interrogar los detalles mecanicistas de la iniciación de XIAP IRES complejo. Una construcción de ADN codifican un ARNm que contiene el IRES XIAP (figura 1A) fue en vitro transcrita...

Discusión

Toeprinting es una técnica poderosa para medir directamente la capacidad de un RNA de interés para apoyar la formación de complejos de iniciación de traducción bajo circunstancias muy controladas. Este protocolo describe una técnica simplificada para toeprinting RNAs mamíferos. Lisado de reticulocitos de conejo (RRL) se utilizaban como una fuente conveniente de los ribosomas, eIFs, iniciador ARNt y IRES trans-actuando factores (ITAFs). El experimentador proporciona su RNA de elección y también puede com...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D5758-100ML
TRIS base, Ultrapure	JT Baker	4109-01
KOAc (Potassium acetate)	Bio Basic	PB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)	Bio Basic	MB0326
Sucrose, molecular biology grade	Calbiochem	573113-1KG
Spermidine	Sigma	85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution	Sigma	G0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution	Sigma	A6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%	Bio Basic	A0006
Urea	Bio Basic	UB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µm	Sarstedt	83.1823.101
Formamide	Sigma	F9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)	Bio Basic	EB0185
SDS	Bio Basic	SB0485
Bromophenol blue	Bio Basic	BDB0001
Xylene cyanol FF	Bio Basic	XB0005
MEGAshortscript T7 transcription kit	Ambion	AM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit	Ambion	AM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)	Ambion	AM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Invitrogen	15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.	Green Hectares, USA		Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	Thermo Fisher	E00382
100 mM dNTPs	Invitrogen	56172, 56173, 56174, 56175	Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µL	Promega	M5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit	Thermo Fisher	707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzer	LI-COR		Product has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)	Bio Basic	AB0072
TEMED	Bio Basic	TB0508
Phusion High Fidelity Polymerase	New England Biolabs	M0530
Turbo Dnase	Thermo Fisher	AM2238