ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Summary

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

Abstract

תרגום חניכה היא הצעד הגבלת קצב של סינתזת חלבונים והוא מייצג נקודת מפתח שבה תאים לווסת את תפוקתן חלבון. רגולציה של סינתזת חלבונים היא המפתח מתח-תגובת תאי ולאחר dysregulation מקום מרכזי מדינות למחלות רבות, כגון סרטן. למשל, למרות מתח סלולארית מובילה עיכוב של תרגום הכללית על ידי חניכה תלויי-כיפה attenuating, חלבונים מסוימים הלחץ-תגובה סלקטיבית מתורגמים באופן שאינו תלוי-קאפ. דיסקרטי רכיבים רגולטוריות RNA, כגון אתרים כניסה הסלולר ריבוזום פנימית (IRESes), מאפשרים התרגום של אלה mRNAs ספציפיים. זיהוי של mRNAs כזה, אפיון מנגנוני הרגולציה שלהם, היה אזור מפתח בביולוגיה מולקולרית. Toeprinting היא שיטת המחקר של RNA מבנה ותפקוד כפי שהוא נוגע תרגום חניכה. המטרה של toeprinting היא להעריך את היכולת של במבחנה עיבד RNA ליצירת קומפלקסים יציבים עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים מעורבים ריבוזום איגוד — שלפני הסמן לטקס החניכה תרגום יעיל. לצד טכניקות אחרות, כגון ניתוח המערב והגדרת פרופיל polysome, toeprinting מאפשרת אפיון חזקים של מנגנוני ויסות תרגום חניכה.

Introduction

כמו תרגום צורכת אנרגיה תאית ביותר, זה הגיוני כי התרגום הוא מוסדר בחזקה¹. לעומת זאת, dysregulation של תרגום- והשינויים הסוגר בפלט חלבון-נצפית לעיתים קרובות במצבי סטרס-תגובה ומחלות, כגון סרטן^1,2. היתרון העיקרי של שליטה translational הוא המהירות שבה תאים יכולים לשנות תפוקתן חלבון על מנת להגיב לגירויים שונים³. תרגום תקנה ובכך מייצג מנגנון חשוב זה יכול להשפיע על הישרדות cell ומוות^1,2,3. השלבים של תרגום, חניכה הוא רוב מוסדר ומורכבות מאוד³. בקצרה, mRNAs האיקריוטיים להכיל 5' m⁷G כובע חיונית כמעט תמיד את התרגום שלהם. תלוי cap-חניכה דורש חניכה האיקריוטים גורמים eIF4E, eIF4A ו- eIF4G (cap-זיהוי המתחם) כדי לקיים אינטראקציה עם תום 5' של mRNA. 43S preinitiation הריבוזום מורכב, המכיל eIF2 מכורך יוזם tRNA, eIF3, הוא גויס לסוף 5' ה-mRNA דרך אינטראקציה של eIF4G עם eIF3. Preinitiation מורכבים נחשב לסרוק mRNA, שנעזר eIF4A (הליקאז RNA) עד codon ההתחלה (אוגוסט) ממוקם. לאחר מכן נוצרת הקבלה 48S מורכבים, סינתזת מועבר לתוך P-האתר של הריבוזום. בסופו של דבר, subunits ריבוזום בשנות ה-60 וה -40 מאוחדים כדי ליצור את ה-80 חניכה מורכב, ואחריו תרגום התארכות^1,3,4. לעומת זאת, אתרים כניסה ריבוזום פנימית (IRESes) לעקוף את הדרישה כובע 5' על-ידי גיוס של יחידת משנה ribosomal ישירות אל codon חניכה³בשנות ה-40. מצבים פיזיולוגיים מתח להחליש הכללית תרגום mRNA בשל שינויים גורמי מפתח חניכה האיקריוטים כללי (eIFs). עם זאת, התרגום קאנונית חניכה מאפשרים לתרגום סלקטיבי של mRNAs מסוימים, אשר לעיתים קרובות לקודד את תגובת המתח חלבונים ולאחר dysregulation של תרגום קאנונית החניכה הייתה שם במדינות מחלות כמו סרטן ^{1 , 2}. רכיבים רגולטוריות RNA דיסקרטי, כגון IRESes הסלולר, לאפשר התרגום של כזה^2,mRNAs³.

היבט מעניין במיוחד אחד של שליטה translational היא להבין מנגנונים של הקנוני לעומת תרגום קאנונית mRNA נתון. Toeprinting היא טכניקה המאפשרת המחקר מכניסטית מפורט חניכה תרגום RNAs ספציפיים בתוך חוץ גופית. המטרה הכוללת של toeprinting הוא להעריך את היכולת של RNA עניין nucleate את היווצרות חניכה תרגום מורכב עם הריבוזום תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים נדרשים עבור תרגום יעיל חניכה. למשל, גיוס ריבוזום אולי הפריע בהיעדרו של כובע 5' אבל מגורה על ידי נוכחות IRES.

העקרון של השיטה היא במבחנה לתמלל של RNA של עניין, דגירה זה בנוכחות הסלולר תמציות המכילות רכיבים תרגום (או הרכיבים מטוהרים) כדי לאפשר חניכה מתחמי לטופס, וכדי להפוך לתמלל הרנ א עם פריימר ספציפיים. מתחמי RNA-ריבוזום יציב יגרום שעתוק במהופך לעכב בקצה 3' של הריבוזום-מה שנקרא 'toeprint'^5,6,7.

ב פרוטוקול זה, ribosomal subunits, eIFs, tRNAs, ו IRES הטרנס-משחק גורמים (ITAFs) נתרמים בנוחות על ידי ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה). יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של פריימר fluorescently התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מבוסס על ג'ל imager, ולא פריימר radiolabeled. פעולה זו מבטלת צעדים נוספים, כולל radiolabeling הראשיים, כמו גם ייבוש הג'ל, לחשוף אותה למסך מעצימה. הלהקות פלורסנט נרשמים בזמן אמת, כמו שלשול ג'ל, המאפשרות ברזולוציה גדולה יותר. Uncapped X-linked המדכא של אפופטוזיס חלבון (XIAP) IRES RNA משמשת כדוגמה כאן, למרות mRNAs רצ'ט ניתן לנתח גם על-ידי טכניקה זו⁸.

בניגוד לניתוח המערבי, אשר מודד את הפלט הסופי של תהליך התרגום בתא lysates, toeprinting היא גישה במבחנה כדי למדוד את התרגום חניכה היווצרות מורכבות על RNA. גישה זו רדיוקציוניסטי מאפשרת לצורך המחקר ומפורט של סובסטרטים או גורמים המסדירים תרגום חניכה (למשל., רצ'ט או משולחים שאינם רצ'ט mRNA, IRES מבנה, נוכחות או היעדרות של זנב poly-A, אספקת חלבון ספציפי גורמים, וכו.). לפיכך, toeprinting ניתן ללמוד מצבים שונים של תרגום⁸ או ההשפעות של מבנים mRNA, כגון IRESes,^9,של סינתזת חלבון¹⁰.

Protocol

הערה: ה-RNA היא רגישים מאוד השפלה על-ידי ribonucleases (RNases). סטנדרט הזהירות כדי לשמור את הרנ א ללא שינוי. משתנים לעתים קרובות כפפות. להשתמש פיפטה מסוננים טיפים, נטולת נוקלאז plasticware, וכימיקלים נוקלאז ללא כל השלבים של הפרוטוקול. שימוש ללא נוקלאז או diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים עבור כל הפתרונות מטופלים.

1. הכנת פתרונות

1. הכנת מאגר Toeprinting: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.6), 100 מ מ KOAc, 2.5 מ מ Mg(OAc)₂, 5% (w/v) סוכרוז, spermidine dithiothreitol (DTT), ו- 0.5 מ מ 2 מ מ.
   1. לאחסן DTT, spermidine לשימוש יחיד aliquots ב-20 ° C כדי להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
      הערה: DTT, spermidine יש להוסיף למאגר toeprinting מיד לפני השימוש. פתרון חסר DTT, spermidine שניתן לאחסן ב-20 ° C.
2. להכין את aliquots של 85 מ מ 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP), מ מ 91 אדנוזין טריפוספט (ATP). לאחסן את aliquots ב-20 ° C.
3. להכין 450 מ של 6% לזיהוי - שבעה מ' אוריאה ג'ל מיקס: 67.5 מ של 40% acrylamide:bis-אקרילאמיד (19:1), g 189 של אוריאה, mL 112.5 של 5 x TBE (טריס/בוראט/thylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)), ו- 120 מ ל מים. להמיס האוריאה על-ידי חימום באמבט מים 37 ° C או על פלטה חמה עם ערבוב. לסנן את הפתרון (למשל., 0.2 μm ניטרוצלולוזה מסנן ואקום).
   הערה: הפתרון שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות.
   זהירות: אקרילאמיד Monomeric היא רעלן עצבי אשר יכול להיספג דרך העור. . שמור על עצמך כדי למנוע מגע עם העור (כלומר. ללבוש כפפות, מעיל המעבדה, עין הגנה). לזיהוי צריך גם לטפל טיפול, כפי הפילמור רשאי להמשיך עד 100% השלמת.
4. להכין formamide בטעינת צבע: 95% formamide, EDTA 18 מ מ, 0.025% (w/v) נתרן dodecyl סולפט (מרחביות), כחול bromophenol 0.025% (w/v), cyanol קסילן 0.025% (w/v). חנות ב-20 ° C.
5. יתמוסס nmol 1 של פריימר (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' שכותרתו סיום עם IRDye 800.) 100 μL של מים עבור ריכוז עבודה של 10 pmol/μL. לאחסן ב-20 ° C ב- aliquots חד-פעמיים (µL כ 10), מוגן מפני אור.

2. הכנת mRNA

1. להגביר את תבניות DNA לסינתזה של mRNA לפי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מתוך תבניות המתאימות (כלומר-, DNA גנומי או דנ א פלסמיד, לפי הצורך). להשתמש על אמינות גבוהה DNA פולימראז בהתאם להוראות היצרן, עם התנאים הבאים התגובה (מחזורים 35): להמיס, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; להרחיב, 72 ° C, 30 s.
   הערה: פריימר לפנים (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) משלבת את רצף יזם T7 כדי לאפשר שעתוק RNA; ומהצמיגים הפוכה (5' T₅₁GAATTCGGATCCGACCGTGG) כולל שאריות תימין 51 לספק זנב poly-A הרנ א משועתקים. שימו לב כי ה-RNA ניתן גם במבחנה עיבד מ פלסמיד ה-DNA.
2. שימוש ערכת שעתוק המתאים כדי במבחנה לתמלל המכילות IRES RNA או רצ'ט RNA מתבנית DNA. בצע הוראות היצרן. הכנת המדגם RNA רגיל 20 כרכים תגובה μL. להתייחס את הרנ א מסונתז החדש עם 2 יחידות של נטול RNase DNase למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
3. לדלל את הרנ א שטופלו DNase עד 110 µL במים נטולי נוקלאז להוסיף 110 µL חומצת פנול, מערבולת 5 s וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב g 20,000 x בטמפרטורת החדר. הסר µL 100 של שלב מימית לרכבת התחתית microfuge 1.5 mL החדש, להוסיף 10 µL של 3 מ' סודיום אצטט, מערבולת 2 ס הוספה, שלושה כרכים של 100% אתנול, מערבולת 5 s, ולאחר לזרז את הרנ א ב-20 ° C בלילה.
4. צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C ו להשליך תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 500 µL של אתנול 70% (v/v) קרה כקרח וחזור על צנטריפוגה. האחות רב תגובת שיקוע ככל האפשר, מילה נהדרת בגדר במשך 5-10 דקות להיזהר לא להוציא את גלולה.
5. Resuspend את הרנ א באמצעי האחסון המתאים של מים נטולי נוקלאז להניב ריכוז העבודה של 0.5 μg/μL. זה יכול להיות מאוחסן ב- 80 ° C או שימוש באופן מיידי.

3. Toeprinting תגובה

1. לערבב 15 μL של הארנב רטיקולוציט Lysate (כמובן, ררילה ררילה, אינם מטופלים נוקלאז), 1 μL (40 יחידות) של RNase מעכב, 1 µL של 91 מ מ ATP (סופי 1.82 גיגה מ"מ) μL 1 של 85 מ מ GMP-PNP (1.7 מ"מ הסופי) צינור microfuge 1.5 mL. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
   הערה: כמובן, ררילה ררילה צריך להיות aliquoted לשימוש יחיד להימנע ההקפאה-מפשיר חוזרות. פקד קריטי הוא תגובה חסר, כמובן, ררילה ררילה. כדי להבהיר את ההפסקות הטבעי של שעתוק במהופך בזכות מבנה משני הרנ א. להוסיף מאגר toeprinting להחליף כמובן, ררילה ררילה עבור פקד זה.
2. להוסיף 0.5 µg (1 µL) של RNA, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
3. הוסף µL 22 מאגר Toeprinting, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
4. להוסיף 0.5 µL (5 pmol) של פריימר התווית על-ידי IRDye, דגירה על קרח למשך 10 דקות.
5. להוסיף 2 µL של 25 מ מ dNTPs (הריכוז הסופי: 1 מ מ), 2 µL של 100 מ מ Mg(OAc)₂, µL 1 של העופות Myeloblastosis וירוס רוורס טרנסקריפטאז (ס ס-RT) µL 3.5 Toeprinting מאגר. עוצמת הקול הסופי הוא 50 μL.
6. דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
7. להוסיף 200 µL של מים נטולי נוקלאז ולחלץ מיד עם µL 250 25:24:1 פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (pH 8.0 בקירוב). מערבולת 5 s וצנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את שלב מימית צינור microfuge 1.5 mL, להוסיף שלושה כרכים של 100% אתנול, מערבולת 5 s, וכן לזרז ב-20 ° C בלילה.
8. צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C ו להשליך תגובת שיקוע. רחץ בגדר DNA עם 500 µL של אתנול 70% (v/v) קרה כקרח. צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 15 דקות ב 4 º C. וביופסיה supernatant הרבה ככל האפשר, אוויר יבש בגדר במשך 5-10 דקות להיזהר לא להוציא את גלולה.
9. להמיס בגדר ב 6 μL של מים נטולי נוקלאז ולהוסיף 3 μL של formamide טעינה לצבוע.

4. רצף תגובות

1. השתמש את תבנית ה-DNA מ 2.1 תחל את התווית על-ידי IRDye מהשלב 3.4 לתגובות רצף רגיל, באמצעות dideoxynucleotides (ddNTPs) כמו שרשרת מחסלים. השתמש ערכת המתאים של רצפי DNA ופעל לפי הוראות היצרן.
2. מיקס 6 μL של כל תגובה רצף עם 3 μL של formamide טעינה לצבוע.

5. הכנת רצף ג'ל ו אלקטרופורזה

הערה: פרוטוקול זה משתמש imager מבוסס על ג'ל של זריחה של 21 ס"מ על 23 ס"מ x ג'ל 0.2 מ מ, אך ניתן להתאים עבור סקוונסרים או ג'ל-גדלים, אחרים במידת הצורך.

1. ניקוי יסודי קפיציות 0.2 מ מ וכן את קצר (23 × 25 ס מ), זמן (30 × 25 ס מ) צלחות זכוכית עם 100% אתנול. אוויר יבש.
2. לערבב 30 מ"ל של 6% לזיהוי - שבעה מ' אוריאה ג'ל לערבב עם 200 μL של 10% (w/v) קירור (APS) ו 20 μL של tetramethylethylenediamine (TEMED). יוצקים את הג'ל, מקפיד להימנע בועות, והכנס את המסרק ג'ל "כריש-שן". לאפשר את הג'ל פולימריזציה לשעה בטמפרטורת החדר.
3. להרכיב את המנגנון רצף ולמלא את מאגרי מים עם 1 x TBE.
4. מראש לפעול למשך 15 דקות ב-1500 V עד טמפרטורה אופטימלית של 55 ° C מושגת.
5. מחממים את התמהיל צבע מדגם/טעינה (מן השלבים 3.9 או 4.2) עד 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק 1 טען μL על גבי הג'ל רצף.
6. הפעל את הג'ל ב-1500 V עבור 8 שעות. המכונה יקרא הלהקות בזמן אמת.
7. לפרק את המנגנון, ולחסל את ג'ל אקרילאמיד ואת מאגר הפעלה.

תוצאות

בעבר תארנו את היכולת של IRES XIAP כדי לתמוך את החניכה תלוי cap-תרגום במבחנה^8,10. Toeprinting הייתה הטכניקה מפתח לחקור את הפרטים מכניסטית חניכה XIAP IRES מורכבים. מבנה ה-DNA קידוד של mRNA המכיל את IRES XIAP (איור 1א') היה במבחנה עיבד ...

Discussion

Toeprinting היא טכניקה חזקה למדוד ישירות את היכולת של RNA עניין לתמוך היווצרות של תרגום מתחמי חניכה בנסיבות מבוקרת מאוד. פרוטוקול זה מתאר טכניקה פשוטה עבור toeprinting RNAs יונקים. ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה) משמש כמקור נוח של הריבוזומים, eIFs, יוזם tRNA, IRES הטרנס-מתנהג גורמים (ITAFs). הנסיין מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D5758-100ML
TRIS base, Ultrapure	JT Baker	4109-01
KOAc (Potassium acetate)	Bio Basic	PB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)	Bio Basic	MB0326
Sucrose, molecular biology grade	Calbiochem	573113-1KG
Spermidine	Sigma	85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution	Sigma	G0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution	Sigma	A6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%	Bio Basic	A0006
Urea	Bio Basic	UB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µm	Sarstedt	83.1823.101
Formamide	Sigma	F9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)	Bio Basic	EB0185
SDS	Bio Basic	SB0485
Bromophenol blue	Bio Basic	BDB0001
Xylene cyanol FF	Bio Basic	XB0005
MEGAshortscript T7 transcription kit	Ambion	AM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit	Ambion	AM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)	Ambion	AM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Invitrogen	15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.	Green Hectares, USA		Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	Thermo Fisher	E00382
100 mM dNTPs	Invitrogen	56172, 56173, 56174, 56175	Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µL	Promega	M5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit	Thermo Fisher	707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzer	LI-COR		Product has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)	Bio Basic	AB0072
TEMED	Bio Basic	TB0508
Phusion High Fidelity Polymerase	New England Biolabs	M0530
Turbo Dnase	Thermo Fisher	AM2238