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摘要

本协议的目标是通过细胞外电子受体 spectrophotometrically 监测反式等离子体膜电子传输, 并分析这些细胞外电子受体可能发生的酶相互作用。

摘要

反式等离子体膜电子传输 (tPMET) 在细胞内的还原应力保护和保护免受细胞外氧化剂的破坏中起着重要作用。这种从胞内还原剂向细胞外氧化剂输送电子的过程没有很好的定义。在这里, 我们提出了 C2C12 myotubes 的分光光度检测, 以监测 tPMET 利用细胞外电子受体: 水溶性四氮唑 salt-1 (WST-1) 和 26-dichlorophenolindophenol (DPIP 或 DCIP)。通过减少这些电子受体, 我们能够在实时分析中监控这个过程。随着抗坏血酸氧化酶 (AO) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 的加入, 我们可以确定 tPMET 的哪一部分是由抗坏血酸出口或超氧化物产生的。当 WST-1 在低背景下产生稳定结果的同时, 在添加 AO 和 SOD 后, DPIP 能够重新氧化, 并通过分光光度分析证明。该方法显示了一种实时、多井、快速分光光度法, 其优点优于其它用于监测 tPMET 的方法, 如氰化钾 (FeCN) 和 ferricytochrome c 还原法。

引言

纯化的等离子膜降低电子受体的能力使人认为等离子膜具有固有的氧化还原容量1。以前在真菌、植物和动物中看到过, tPMET 是多个有机体共有的过程2,3,4,5。具体地说, 这一过程已在酿酒酵母、胡萝卜细胞、红细胞、淋巴细胞、骨肉瘤、黑色素瘤、巨噬细胞、骨骼肌和中性粒细胞2、3、4,5,6,7. 在通过等离子膜传输电子以减少细胞外氧化剂的过程中, tPMET 涉及许多细胞功能, 包括: 细胞生长5,8, 细胞生存能力9, 铁新陈代谢10, 细胞信号11,12,13, 和保护从活性氧种类12,14,15。由于 tPMET 在许多细胞功能中的参与, tPMET 的失衡已经被推测为某些严重的健康状况的发展做出贡献, 包括癌症16、心血管疾病17和新陈代谢综合症18。

有多种方法来监测电子在等离子膜上的传输, 但最广泛使用的技术是通过比色测定来评估细胞外电子受体的减少。通常使用的细胞外电子受体是四氮唑盐、DPIP、FeCN 和 ferricytochromec19, 20.最常用的四氮唑盐是第二代盐, 称为WST-119。与第一代四氮唑盐相比, 这种化合物在比色测定中更容易使用, 因为两个磺酸基团增加了其水溶性21。WST-1 与中间电子受体 1-甲氧基吩 methosulfate (mPMS) 相结合, 在两个单电子转移事件中减少。此还原将 WST-1 的弱色氧化形式更改为更强烈的黄色 formazan20,22。WST-1 有一个高摩尔消光系数 37 x 103 M-1cm-1, 导致高检测灵敏度21,22。DPIP 也被用作细胞外电子受体来监测 tPMET。已表明, DPIP 可以减少 extracellularly 由 tPMET 不支持中间电子受体23,24。由于缺少中间电子受体, DPIP 可以直接从等离子膜中提取电子, 而不像 WST-124。类似于 DPIP, FeCN 已被证明是减少 extracellularly 盐 tPMET 不支持中间电子受体19,24。与 WST-1 和 DPIP 不同, FeCN 具有低摩尔消光系数, 导致检测灵敏度降低9。另一个常用的细胞外电子受体监测 tPMET 是 ferricytochrome c. 类似 WST-1, ferricytochrome c 减少增加使用中间电子受体, mPMS22。与 WST-1 不同的是, ferricytochrome c 方法由于高背景和低摩尔消光系数22而不太敏感。

本文提出了一种通过分光光度法进行 tPMET 的实时分析方法。该方法利用细胞外电子受体 WST-1 和 DPIP, 因为它们都具有较高的摩尔消光系数, 而与其他常用的细胞外电子受体如 ferricytochrome c 相比, 它们的成本更低。我们使用吩 methosulfate (pms), 而不是 mPMS 他们有类似的化学成分和 PMS 是远远低于昂贵。mPMS 是光化学法稳定, 这是一个重要的特点, 商业套件, 需要长期的货架期。然而, 我们使 PMS 新的每一个化验, 所以稳定性不应该是一个问题。我们还提出一种方法来评估可能的酶相互作用 (参见图 1) 之间的细胞外电子受体和酶, 可用于进一步表征的过程 tPMET。具体地说, 酶的 AO 和 SOD 可以用来确定哪一部分的 tPMET 是由于抗坏血酸转运或胞外超氧化物释放, 两种常用的方法, 电子运输横跨等离子膜。

研究方案

注意: 有关关键步骤的示意图概述, 请参见图 1 。

1. WST-1 还原试验

  1. 使用标准的细胞培养过程在96井板中利用 a F 来生长和区分 C2C12 黏附细胞.7
    1. 使用由 Dulbecco 修饰鹰培养基 (DMEM) 组成的分化培养基, 辅以2% 匹马血清、100毫升青霉素和0.1 毫克/毫升链霉素。孵化细胞在37°c 与 5% CO2。
    2. 当监测抗坏血酸参与 tPMET, 补充分化培养基与100µM 抗坏血酸。允许细胞在分化培养基中孵育24-48 小时。
  2. 准备库存 WST-1 和 PMS 解决方案。
    1. 为了使10毫米的 WST-1, 溶解0.033 克 WST-1 (FW): 651.34 克/摩尔) 在5毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。存储在4摄氏度。
    2. 要制作5毫米的 pms 库存, 可将0.0023 克 pms (固件: 306.34 克/摩尔) 溶解在1.5 毫升的去离子 H2o (蝶和 2 o).储存在-20 摄氏度和保护免受光照。
  3. 添加0.0108 克葡萄糖的最终浓度为5毫米至11.4 毫升的 PBS 或 HEPES 缓冲生理盐水 (哈佛商学院; 20 毫米 HEPES 钠盐, 140 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 2.5 毫米 MgSO4, 1 毫米 CaCl2)。添加480µL 10 毫米 WST-1 为最终浓度为400µM 和48µL 5 毫米 PMS 的最后浓度20µM。
  4. 当监测抗坏血酸参与 tPMET, 把溶液分成两个6毫升整除数。对一个整除, 添加6µL 蝶和 2 O 和另一个整除添加6µL 2 kU/毫升 AO 为最终浓度 2 U/毫升.
  5. 当监测超氧化物参与 tPMET, 将解决方案分为两个6毫升整除数。对于一个整除, 添加55µL KPO4缓冲区和另一个整除添加55µL 6.5 kU/毫升 SOD, 以最终浓度为 60 U/毫升。
  6. 用 PBS 冲洗细胞。吸入介质并添加150µL PBS。然后吸入 PBS
    注: 化验是用电镀的, 附着的细胞做的。因此, 在洗涤过程中没有离心或胰蛋白酶的使用。
  7. 添加100µL WST-1 溶液 (-) sod 或 (-) ao 到列 1-6, 并添加100µL WST-1 溶液 (+) SOD 或 (+) AO 到7-12 列在96井板块。使用行 G 和 H 作为背景控件 (即, 在没有单元格的井中单独监测试剂中吸光度的变化)。
  8. 用分光光度计每10分钟测量1小时的吸光度值 438 nm。
  9. 读完后, 用150µL 的 PBS 冲洗介质, 洗净每一个井。然后吸入 PBS
  10. 计算每个井吸光度的变化, 方法是从任何时间点的吸光度中减去井的初始吸光度。更正背景井 (即) 中观察到的吸光度变化 (如果有) 的变化, 而不使用检测溶液, 但没有细胞的油井。
  11. 为了进行分析, 将吸光度数据正常化为60分钟的控制测量或用 PBS 或哈佛商学院冲洗水井, 然后执行二辛可宁酸 (可评估) 蛋白质测定。
  12. 添加2毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA) 标准 (范围从 0.5-2 µL 为标准曲线, 取决于细胞的汇合程度) 到空井 (G 行和 H), 然后添加到所有水井的可测性试剂。
  13. 通过 nmol 每µg 蛋白质的 WST-1 减少来量化数据。使用37毫米-1 cm-1 22作为消光系数为减少的 WST-1 在438毫微米。

2. DPIP 还原试验

  1. 生长和区分 C2C12 黏附细胞与步骤1.1 相同的步骤。
  2. 准备库存10毫米 DPIP 溶液如下。溶出0.029 克 DPIP (FW: 290.08 克/摩尔) 在10毫升的蝶和 2 o. 通过用分光光度计测定 600 nm 中的吸光度, 确定 DPIP 的浓度.使用1毫米-1 cm-1 23作为消光系数为减少的 DPIP 在600毫微米。存储在4摄氏度。
  3. 添加0.0108 克葡萄糖到11.880 毫升的 PBS, 最终浓度为5毫米。添加120µL 10 毫米 DPIP 的最后浓度为100µM。
  4. 当监测抗坏血酸参与 tPMET, 把溶液分成两个6毫升整除数。对一个整除, 添加6µL 蝶和 2 O 和另一个整除添加6µL 2 kU/毫升 AO 为最终浓度 2 U/毫升.
  5. 当监测超氧化物参与 tPMET, 将解决方案分为两个6毫升整除数。对于一个整除, 添加55µL KPO4缓冲区和另一个整除添加55µL 6.5 kU/毫升 SOD, 以最终浓度为 60 U/毫升。
  6. 在150µL 的 PBS 中吸入培养基和洗涤细胞。吸入 PBS 并添加100µL DPIP 溶液 (-) sod 或 (-) ao 到1-6 列, 并添加100µL DPIP 溶液 (+) SOD 或 (+) AO 到7-12 列在96井板。使用 G 和 H 行作为后台控制 (即), 以监测在没有细胞的油井中单独的试剂中吸收的变化。
  7. 用分光光度计每10分钟测量 600 nm 的吸光度, 1 h. 将相对于该控件的吸光度的变化量化为60分钟, 类似于步骤 1.9-1.13。

3. 降低电子受体是否为 AO 或 SOD 基板的测定

  1. 到5.436 毫升的 PBS 或哈佛商学院, 添加240µL 10 毫米 WST-1 为最终浓度400µM 和24µL 5 毫米 PMS 的最后浓度20µM。
    1. 对于 DPIP, 添加60µL 10 毫米 DPIP, 最终集中100µM, 到5.940 毫升的 PBS 或哈佛商学院。
  2. 在没有细胞的情况下, 在一个平底96井板中添加100µL 溶液, 并测量分光光度计在 438 nm, WST-1, 或 600 nm, DPIP。
  3. 添加1µL 10 毫米抗坏血酸到一半的水井, 最后浓度为100微米。监测吸光度直到稳定。
  4. 稳定后, 添加1µL 200 u/毫升 AO 的最终浓度为 2 u/毫升的每一个井或添加1µL 6 kU/毫升 SOD 的最后浓度 60 U/毫升的最终集中到每一个井和监测吸光度为 1 h。

结果

使用 RStudio 统计软件25进行重复测量, 对方差分析进行了统计。示例大小在图图例中显示。

为了监测 tPMET, C2C12 myotubes 与细胞外电子受体、WST-1 和 DPIP 一起使用。AO 用于确定 WST-1 和 DPIP 减少的部分是由于抗坏血酸流出和 SOD 被用来确定 WST-1 减少的部分是由于胞外超氧化物释放。如图 2所?...

讨论

我们提出了两种方法, 利用细胞外电子受体, WST-1 和 DPIP, 分光光度法检测 tPMET C2C12 myotubes。随着标准培养过程中细胞系的生长和分光光度计板读取器的增加, 在简单的微板块实验中, 可以用这些电子受体监测 tPMET。WST-1 的还原是从良好到良好的在一个试验中重现, 但有日常的变化。以 PBS 为缓冲器的日日变化系数 (cv) 为 0.18, 以哈佛商学院为缓冲区的 cv 为0.23。

从以前的文献使用 ...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们要感谢托马斯贝尔, 林恩 Mattathil, 马克 Mannino, 和 Neej 的技术支持。这项工作得到美国公共卫生服务奖 R15DK102122 从国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所 (NIDDK) 的支持乔纳森费舍尔。手稿内容完全是作者的责任, 不一定代表 NIDDK 或国立卫生研究院的官方意见。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

参考文献

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