C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

요약

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

초록

Trans 플라스마 막 전자 전송 (tPMET) extracellular oxidants에 의해 세포내 감소 스트레스 로부터 세포의 보호 뿐만 아니라 손상 으로부터 보호 역할을 하고있다. Extracellular oxidants 세포내 reductants에서 전자 수송의이 과정은 잘 정의 된. 여기 우리 C2C12 myotubes tPMET 세포 외 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 여 spectrophotometric 분석 실험을 제시: 수용 성 tetrazolium 소금-1 (서 부 표준시-1)과 2, 6-dichlorophenolindophenol DPIP (DCIP). 이러한 전자 수락자의 감소, 통해 우리는 실시간 분석에이 과정을 모니터 할 수 있습니다. 효소 superoxide dismutase (SOD)는 분석 실험을 하는데 산화 효소 (AO) 등의 추가 함께 우리 tPMET의 부분 각각 하는데 수출 또는 초과 생산 때문입니다 확인할 수 있습니다. 서 부 표준시-1 낮은 배경 가진 안정적인 결과를 표시 했다, 그러나 DPIP AO와 spectrophotometric 분석 시연 했다 잔디의 추가 후 다시 산화 될 수 있었다. 이 메서드는 실시간, 빠른 멀티 잘 spectrophotometric 분석 결과 tPMET, ferricyanide (FeCN) ferricytochrome c 감소 등을 모니터링 하는 데 사용 하는 다른 방법을 통해 장점 보여 줍니다.

서문

전자 수락자를 줄이기 위해 순화 된 플라즈마 막 수 플라즈마 멤브레인 고유의 redox 용량¹는 보기를 주도하 고 있다. 이전에 곰 팡이, 식물, 그리고 동물에서 본, tPMET는 여러 생물^2,3,,45에 공통 프로세스입니다. 특히,이 과정은 Saccharomyces cerevisiae, 당근 세포, 적혈구, 림프 톨, 다리, 흑색 종, 대 식 세포, 골격 근육, 및 호 중구^2,3, 에서 입증 되었습니다. ^{4 , 5 , 6 , 7}. extracellular oxidants를 줄이기 위해 플라즈마 막에 걸쳐 전자를 수송 하는 과정에서 tPMET는 포함 하는 많은 세포 기능에 관여: 세포 성장^5,8, 세포 생존 능력⁹, 철 대사¹⁰,^11,,1213, 반응성 산소 종^12,,1415보호를 신호 하는 세포입니다. 많은 세포질 기능에 tPMET의 개입으로 인해 tPMET의 불균형은 암¹⁶,¹⁷, 심혈 관 질환 포함 한 몇 가지 심각한 건강 상태의 발전에 기여할 가설 되었습니다 및 대사 증후군¹⁸.

원형질 막의 전자 전송을 모니터링 하는 여러 가지 하지만 가장 널리 사용 되는 기술 색도계 분석 실험을 통해 세포 외 전자 수락자의 감소를 평가 하는 것입니다. 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자 tetrazolium 소금, DPIP, FeCN, 그리고 ferricytochrome c^19,20있습니다. 가장 일반적으로 사용 되는 tetrazolium 소금은 2 세대 소금 알려진 서 부 표준시-1¹⁹. 이 화합물은 1 세대 tetrazolium 소금 두 된 그룹,²¹의 물 가용성 증가 하는 때문에 비해 색도계 분석 실험에 활용 하기가 쉽습니다. 중간 전자 수락자 1-methoxy-phenazine methosulfate (Mpm)와 함께에서 서 부 표준시-1, 2 단 전자 전송 이벤트에서 감소 된다. 이 감소는 더 강렬한, 노란색 formazan^20,22에 약하게 색 산화 형태의 서 부 표준시-1을 변경합니다. 서 부 표준시-1 높은 분석 결과 감도^21,22로 이어지는 37 x 10³ M^-1c m^-1의 높은 어 금 니 소 광 계수가 있다. DPIP는 또한 tPMET를 모니터링 하는 extracellular 전자 수락자로 이용 된다. 그것은 그 DPIP 감소 될 수 있다 extracellularly 중간 전자 수락자^23,24의 도움 없이 tPMET에 의해 표시 되었습니다. 중간 전자 수락자의 부족, DPIP 픽업 전자를 서 부 표준시-1²⁴달리 플라즈마 막에서 직접 수 있습니다. DPIP와 마찬가지로 FeCN 줄어들 extracellularly ferrocyanide 중간 전자 수락자^19,24의 도움 없이 tPMET에 의해에 표시 되었습니다. 서 부 표준시-1, DPIP와 달리 FeCN 낮은 분석 결과 감도⁹로 이어지는 낮은 어 금 니 소멸 계수가 있다. TPMET 모니터를 또 다른 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자는 ferricytochrome c. 서 부 표준시-1, ferricytochrome c 감소 증가 중간 전자 수락자, Mpm²²의 사용과 비슷합니다. 서 부 표준시-1과는 달리, ferricytochrome c 방법은 높은 배경 및 낮은 분자량 소멸 계수²²덜 민감한.

여기 우리 spectrophotometric 분석 실험을 통해 tPMET의 실시간 분석을 위한 방법 제시. 메서드 활용 서 부 표준시-1 및 DPIP, extracellular 전자 수락자로 그들은 둘 다 높은 어 금 니 소멸 계수 되 고 일반적으로 다른에 비해 덜 비싼 사용 ferricytochrome c 등 세포 외 전자 수락자. 우리는 phenazine methosulfate (PMS) 활용 Mpm 대신 그들은 유사한 화학 메이크업 및 PMS 있다 훨씬 덜 비싼. Mpm은 photochemically 안정 긴 수명이 필요로 하는 상용 키트에 대 한 중요 한 특성입니다. 그러나, 우리가 있도록 PMS 신선한 각 분석 결과 대 한 안정성 문제 해서는 안됩니다. 우리는 또한 가능한 효소 사이 상호 작용 ( 그림 1참조) extracellular 전자 수락자와 더 tPMET의 과정을 특성화 하기 위해 활용 될 수 있습니다 효소를 평가 하는 방법을 제시. 특히, 효소 AO와 잔디를 사용할 수 있습니다 어떤의 tPMET 부분은 하는데 전송 또는 extracellular superoxide 릴리스, 원형질 막에 걸쳐 수송 될 전자에 대 한 두 가지 일반적인 방법 결정 합니다.

프로토콜

참고:에 대 한 주요 단계 도식 개요 그림 1 을 참조 하십시오.

1. 서 부 표준시-1 감소 분석 결과

1. 성장 하 고 96 잘 접시 행 A-f.를 활용 하 여 표준 셀 문화 절차⁷ 을 사용 하 여 C2C12 부착 세포 분화
   1. 구성 된 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 2% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스 보충 차별화 매체를 사용 합니다. 5% CO₂와 37 ° C에서 세포를 품 어.
   2. TPMET에서 하는데 참여 모니터링, 100 µ M ascorbic 산 차별화 미디어 보충. 셀 ~ 24-48 대 한 차별화 미디어에는 알을 품을 수 h.
2. 재고 서 부 표준시-1 및 PMS 솔루션을 준비 합니다.
   1. 서 부 표준시-1의 10 밀리미터 주식을 하려면 분해 서 부 표준시-1의 0.033 g (수식 무게 (FW): 651.34 g/mol) 5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 4 ° c.에 게
   2. PMS의 5 밀리미터 주식을 하려면 0.0023 g PMS의 분해 (FW: 306.34 g/mol) 이온된 H₂O의 1.5 ml (diH₂O). -20 ° C에서 저장 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
3. 11.4 ml PBS 또는 HEPES 5mm의 최종 농도 식 염 수 버퍼 0.0108 g 포도 당의 추가 (HBS; 20 mM HEPES 나트륨 소금, 140 m NaCl, KCl, 2.5 m m MgSO₄, 5mm 1 m CaCl₂m m). 10 m m 400 µ M의 최종 농도를 48 µ L 5mm 20 µ M의 최종 농도 대 한 PMS의 서 부 표준시-1의 480 µ L를 추가 합니다.
4. TPMET에서 하는데 참여, 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수에 diH₂O 6 µ L을 추가 하 고 다른 약 수 2 구/mL AO 2 U/mL의 최종 농도 6 µ L 추가 합니다.
5. TPMET에 superoxide 참여 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수를 0.1 M KPO₄ 버퍼의 55 µ L을 추가 하 고 다른 약 수를 60 U/mL의 최종 농도 대 한 6.5 구/mL 잔디의 55 µ L을 추가 합니다.
6. PBS로 세포 세척. 미디어를 발음 하 고 150 µ L PBS를 추가 합니다. 다음에 PBS 발음.
   참고: 분석 결과 도금, 연결 된 셀과 함께 이루어집니다. 따라서, 원심 분리 또는 세척 과정에서 trypsin의 사용 이다.
7. 서 부 표준시-1 솔루션 (-)의 100 µ L를 추가 잔디 또는 (-) 아오 열 1-6를 100 µ L의 서 부 표준시-1 솔루션 (+) 잔디 또는 (+) 아오 열 7-12 96 잘 접시에 추가. 배경 컨트롤 행 G와 H를 사용 하 여 (즉, 변화를 모니터링 하는 데 셀 없이 웰 스에서 혼자 시 흡 광도에).
8. 438에서 1 시간 마다 10 분 분 광 광도 계를 사용 하 여 흡 광도 값 nm.
9. 읽기 후에, 미디어를 발음 하 고 각각을 씻어 PBS의 150 µ L로 잘. 다음에 PBS 발음.
10. 그 잘 시간 언제 든 지 흡 광도에서 잘에 대 한 초기 흡 광도 빼서 각 잘 흡 광도 변화를 계산 합니다. 흡 광도 (있을 경우) 배경 웰 스 (즉, 분석 결과 솔루션 우물만 셀)에서 관찰 된 변화에 대 한이 변경 수정.
11. 분석을 위해 60 분 제어 측정에 흡 광도 데이터 정상화 또는 PBS와 HBS 웰 스를 세척 하 고 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석을 수행.
12. 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 기준 추가 (0.5-2에서 셀의 합류의 정도 따라 표준 곡선 µ L) 빈 우물 (행 G 및 H), 다음 추가 BCA 시 모든 우물에.
13. 단백질의 µ g 당 서 부 표준시-1 감소의 nmol 통해 데이터를 계량. 멸종 계수로 37 m m^-1 c m^{-1 22} 를 사용 하 여 감소 된 서 부 표준시-438에서 1 nm.

2. DPIP 감소 분석 결과

1. 성장 하 고 C2C12 단계 1.1 동일한 절차와 부착 세포를 차별화 합니다.
2. 다음과 같이 재고 10 m m DPIP 솔루션을 준비 합니다. 분해 DPIP의 0.029 g (FW: 290.08 g/mol) diH₂O. 확인 600에서 흡 광도 측정 하 여 DPIP의 농도의 10 mL에 nm는 분 광 광도 계. 소 광 계수로 1 m m^-1 c m^{-1 23} 을 사용 하 여 감소 DPIP 600에 대 한 nm. 4 ° c.에 게
3. 5mm의 최종 농도 대 한 PBS의 11.880 ml 0.0108 g의 포도 당을 추가 합니다. 100 µ M의 최종 농도 대 한 10 m m DPIP의 120 µ L를 추가 합니다.
4. TPMET에서 하는데 참여, 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수에 diH₂O 6 µ L을 추가 하 고 다른 약 수 2 구/mL AO 2 U/mL의 최종 농도 6 µ L 추가 합니다.
5. TPMET에 superoxide 참여 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수를 0.1 M KPO₄ 버퍼의 55 µ L을 추가 하 고 다른 약 수를 60 U/mL의 최종 농도 대 한 6.5 구/mL 잔디의 55 µ L을 추가 합니다.
6. 미디어를 발음 하 고 PBS의 150 µ L에서 세포를 씻어. PBS를 발음 하 고 100 µ L DPIP 솔루션 (-)의 추가 잔디 또는 (-) 아오 열 1-6를 100 µ L DPIP 솔루션 (+) 잔디의 또는 (+) 아오 열 7-12 96 잘 접시에 추가. 배경 컨트롤 행 G와 H 사용 (즉, 변화를 모니터링 하는 데 셀 없이 웰 스에서 혼자 시 흡 광도에).
7. 사용 하 여 600 nm에서 흡 광도 측정 분 광 광도 계 10 분 마다 1 헤에 대 한 계량 60 분 단계 1.9 1.13 비슷한 컨트롤에 상대적인 흡 광도 있는 변화.

3. 결정 여부 감소 전자 수락자는 AO 또는 잔디에 대 한 기판의

1. PBS의 HBS 5.436 ml, 10 m m 400 µ M의 최종 농도 5mm 20 µ M의 최종 농도 대 한 PMS의 24 µ L에 대 한 서 부 표준시-1 240 µ L를 추가 합니다.
   1. DPIP, PBS의 HBS 5.940 mL를 100 µ M의 최종 농도 10 m m, DPIP의 60 µ L를 추가 합니다.
2. 각 셀의 부재에서 평면 아래 96 잘 접시에 잘 438에서 분 광 광도 계에서 흡 광도 측정 하는 솔루션의 100 µ L를 추가 nm, DPIP에 대 한 서 부 표준시-1, 또는 600 nm에 대 한.
3. 100 μ M의 최종 농도 대 한 웰 스의 절반의 10mm 하는데 1 µ L를 추가 합니다. 안정화 될 때까지 흡수도 모니터링 합니다.
4. 안정화, 시 각 음을 2 U/mL의 최종 농도 대 한 200 U/mL AO의 1 µ L를 추가 하거나 각 60 U/mL의 최종 농도 잘 하 고 1 시간에 대 한 흡 광도 모니터 6 구/mL 잔디의 1 µ L를 추가 합니다.

결과

통계는 RStudio 통계 소프트웨어²⁵를 사용 하 여 반복된 측정 ANOVA와 수행 했다. 샘플 크기는 그림 범례에 표시 됩니다.

모니터 tPMET, C2C12 myotubes extracellular 전자 수락자, 서 부 표준시-1 및 DPIP 함께 활용 했다. AO는 서 부 표준시-1의 부분을 결정 하는 데 사용 되었다, DPIP 감소 하는데 경과 예정 이었습니다 그리고 ?...

토론

우리는 세포 외 전자 수락자, DPIP, 및 서 부 표준시-1 tPMET C2C12 myotubes에서 모니터링 하는 spectrophotometric 분석 실험에 활용 하는 두 가지 방법 제시. 표준 문화 절차에 셀 라인의 성장과 플레이트 리더를 분 광 광도 계 분석 결과 간단한 microplate에에서 이러한 전자 수락자와 tPMET 모니터링 가능 하다. 서 부 표준시-1 감소는 잘-투-잘 분석 결과, 내에서 재현할 수 이지만 일상적인 변화. PBS는 버퍼를 활용 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 myoblasts	American Type Culture Collection	CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose	Sigma	D6046
Fetal Plex animal serum complex	Gemini Bio-Products	100-602
penicillin-streptomycin	Sigma	516106
horse serum	Gibco Technologies	16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline	Sigma	D8537
trypsin-EDTA	Sigma	T4049
15 cm culture dishes	TPP	93150
96 well culture plates	TPP	92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)	Accela ChemBio  Inc	SY016315
phenazine methosulfate	Sigma	P9625
L-ascorbic acid	Sigma	A5960
ascorbate oxidase	Sigma	A0157
superoxide dismutase	Sigma	S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt	ICN Biomedicals	215011825
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
HEPES sodium salt	Sigma	H3784
sodium chloride	Sigma	S7653
potassium chloride	Fisher Scientific	BP366
magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M5921
calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902
potassium phosphate	Fisher Scientific	BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Powerwave X-I spectrophotometer	Biotek Insturments	discontinued
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer	Thermo Scientific	336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile	MidSci	781602
Iron (II) chloride tetrahydrate	Sigma	220299
Iron (II) sulfate heptahydrate	Sigma	215422
hypoxanthine	Sigma	H9636
xanthine oxidase	Sigma	X4500
Excel	Microsoft
R Studio	Rstudio		https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4	Biotek Insturments	discontinued