JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里, 我们提出了一个全细胞电化学实验的协议, 以研究质子传输的贡献, 通过外膜细胞色素复合体在希瓦氏菌 oneidensis MR-1 的细胞外电子转运率。

摘要

在细菌外膜中嵌入的c型细胞色素复合物的直接电化学检测 (外膜c型细胞色素复合物;OM c-青旅) 最近出现作为一种新的全细胞分析方法来表征细菌电子运输从呼吸道链到细胞外部, 称为细胞外电子转运 (EET)。研究了 EET 反应过程中电子流的途径和动力学, 研究了与 EET 相关的阳离子输送的影响的全细胞电化学方法尚未建立。在本研究中, 本文介绍了通过 OM c-中青旅使用模型微生物 (希瓦氏菌 oneidensis MR-1) 检测 EET 上氘动力学同位素效应 (绢) 的生物化学技术的例子。如果 EET 通过 OM c-青旅作为微生物电流生产中的速率限制步骤, 则可以获得 EET 过程的绢。为此, 在添加 D2O 之前, 将上清液替换为含有足够数量的电子捐献者的新鲜介质, 以支持上游代谢反应的速率, 并从统一的浮游细胞中移除工作电极上的单层生物膜。此外, 还介绍了通过 OM c-青旅法确定微生物电流生产中 EET 速率限制步骤的替代方法。研究质子转运动力学的全细胞电化学检测技术可应用于其它活性微生物菌株。

引言

在一个完整的细菌细胞中, 直接表征氧化还原蛋白的电化学技术最近出现, 自从发现了金属还原微生物菌株, 如S. oneidensis MR-1 或地杆菌能 sulfurreducens PCA,其中有外膜 c 型细胞色素复合体 (OM c-青旅) 暴露于细胞外部1,2,3,4,5。OM c-青旅介导从呼吸道链到位于 extracellularly 的固体基底的电子传输。此传输称为胞外电子传输 (EET)1,6 , 是新兴生物技术 (如微生物燃料电池6) 的关键过程。因此, 为了了解潜在的 EET 动力学和机制, 以及它与微生物生理学的联系, OM c-中青旅已使用全细胞电化学47, 结合显微术进行了研究。8,9, 光谱学10,11, 分子生物学2,4。相比之下, 研究 EET 相关的阳离子传输 (例如,质子) 对活细胞中 EET 动力学的影响的方法几乎没有建立, 尽管质子在细菌膜中的转运具有关键作用, 在信号、稳态和能源生产12,13,14。在本研究中, 我们描述了一个技术, 以检查质子传输对 EET 动力学的影响, 在S. oneidensis MR-1 细胞使用全细胞电化学测量, 这需要确定的速率限制步骤在微生物电流生产15。

一个直接的方法来评估质子传输对相关 EET 的贡献是氘动能同位素效应 (绢)。绢是可观察的作为电子转移动力学的变化在替换质子与氘离子, 代表质子传输对电子转移动力学的影响16。绢本身的理论已得到很好的建立使用电化学测量与纯化酶17。但是, 由于oneidensis中的当前生产 MR-1 来自多个、不同和波动的进程18, 因此不能简单地将 EET 标识为速率限制过程。为了观察质子传输过程与 EET 耦合的绢, 我们需要确认微生物电流的产生是通过 OM c-中青旅对电极的电子传输来限制的。为此, 在绢测量前, 我们在最佳 pH 值和温度条件下, 用含有高浓度乳酸的新鲜培养基取代上清液;这个替换服务两个角色: (1) 它提高了上游代谢过程的速率与 EET 相比, (2) 省略了在工作电极上从S. oneidensis MR-1 的单层生物膜上释放的上清液中的游泳细胞 (铟锡掺杂氧化物 (ITO) 电极)。所提供的详细协议旨在帮助新的从业者保持并确认 EET 过程是速率确定步骤。

研究方案

1. 在 ITO 电极上形成oneidensis MR-1 的单层生物膜 (图 1)

注: 为了防止电化学反应器与其他微生物的污染, 电化学反应器的所有介质、装置和元件应预先消毒。当使用oneidensis MR-1 单元格并构造电化学反应器时, 所有程序都应在干净的工作台上进行。

  1. oneidensis MR-1 细胞的培养
    注: 在以前报告的4的条件下, 在 ITO 电极上形成了一个oneidensis MR-1 的单层生物膜。
    1. 要增长oneidensis MR-1 单元格, 请添加一个 s 的殖民地. oneidensis MR-1 在含有 Luria Bertani (磅) (20 克/升) 和 bacto 琼脂 (15 克/升) 的琼脂盘上生长, 在有氧条件下为30摄氏度的15毫升的 LB 培养基 (20 克/升), 在小时内以 24 rpm 摇晃。
    2. 离心细胞悬浮在 6000 x g为10分钟, 并并用重悬在15毫升的被定义的培养基 (pH 7.8) 的结果细胞颗粒 (DM: NaHCO3 [2.5 克/升], CaCl2· 2H2O [0.08 克/升], NH4Cl [1.0 克/升], 氯化镁2·6H2O [0.2 克/升], 氯化钠 [10 克/升], 和 2-[4-(2-羟乙基) 1-哌嗪基] 磺酸 [HEPES; 7.2 克/升]), 辅以10毫米乳酸和0.5 克/升酵母萃取物作为碳源,以及 S . oneidensis 的跟踪元素 MR-1分别。
    3. 进一步培养细胞悬浮有氧在30°c 为 12 h 与震动在 160 rpm 和离心机再在 6000 x g 为10分钟. 用 DM 介质将所合成的细胞颗粒洗净两次, 然后在 10 x g 的电化学前进行离心处理. 实验。
  2. 三电极电化学反应器的构造 (图 1)
    1. 在反应器底部放置一个 ITO 基体作为工作电极。
    2. 随后, 插入一个玻璃圆筒 (直径2厘米) 和聚四氟乙烯 (PTFE) 盖子。然后将银/AgCl (氯化钾饱和) 和铂丝插入反应器中, 分别作为参考和反电极。
      注: 为防止空气和溶液泄漏, 请在各组件之间插入丁基橡胶板。
    3. 添加4.0 毫升 DM 补充10毫米乳酸和0.5 克/升酵母萃取物进入电化学反应器。
    4. 在确认电化学反应器没有泄漏的情况下, 将氮气流入电化学反应器中20分钟, 以维持电化学反应器内的厌氧条件。
      注: 为防止其他微生物污染, 应在气体流入电化学反应器之前对其进行过滤。
    5. 将电化学反应器连接到恒电位仪, 并将 +0.4 V (与标准氢电极, 她) 应用于 ITO 电极, 使用外部水循环系统将电化学反应器的温度保持在30摄氏度。
      注: 为了防止外部电场的影响, 电化学反应器应放置在法拉第笼中。
  3. oneidensis MR-1 单元格的电化学培养 (图 1和图 2)
    1. 将步骤1.1 中获得的悬浮液的细胞密度调整为1.43 在 600 nm (OD600) 的光密度, 用 DM 补充10毫米乳酸和0.5 克/升酵母萃取物。
      注意: 要获得正确的 od600, 请在调整 od600至1.43 之前, 将 od600 ≤0.8 的单元格悬浮应用于紫外-可见光光谱仪。
    2. 使用注射器将0.3 毫升的电池悬浮液注入电化学反应器中: 反应器中的外径600变为0.1。
      注意: 增加0.3 毫升细胞悬浮与 od600 = 1.43 入电化学反应器包含 4.0 mL 媒介结果4.3 毫升解答与 od600 = 0.1。当使用不同体积的其他反应器时, 需要计算细胞密度。
    3. 继续潜在的应用在 +0.4 V (与她) 到 ITO 电极25小时。
      注: 为在 ITO 电极上形成单层生物膜, 请确保所产生的电流与图 2中的偏差小于50%。

2. 用新鲜 DM 培养基替换上清液, 10 毫米乳酸 (图 3)

  1. 停止潜在的应用, 并断开电化学反应器从恒电位仪和水循环系统。
  2. 新鲜 DM 培养基替换上清液10毫米乳酸
    1. 将氮气放入含有10毫米乳酸的 DM 的瓶子中, 从培养基中除去氧气。
    2. 用注射器缓慢地将电化学反应器内的所有上清液取出, 在流动的氮气下 (图 3a, b)。
      注: 为了避免氮气对 ITO 电极上的生物膜进行破坏, 气体应在液体表面上方流动。
    3. 使用注射器添加4.0 毫升含有10毫米乳酸的新鲜 DM (图 3c)。
      注意: 为了避免破坏 ITO 电极上的生物膜, 慢慢地将介质沿电化学反应器的壁上注入。为了保持生物膜湿润, 应在清除清液后立即添加培养基。在清除清液后1分钟内注射, 不会影响来自oneidensis MR-1 生物膜的当前生产。
    4. 倾斜电化学反应器, 以除去附着在电化学反应器壁上的所有上清液。
    5. 重复步骤 2.2. 2-2. 2.4 三次共计。
  3. 停止气体流动, 再将电化学反应器连接到恒电位仪, 在 303 K 上应用 +0.4 V (vs 她) 到 ITO 电极上。

3. 增加氘水来测量 EET 过程中的绢 (图 4)

  1. 确认来自oneidensis MR-1 的单层生物膜的当前生产是稳定的, 不会迅速增加。如果电流急剧增加, 请等到电流稳定在5% 以内, 增加10分钟。
    注: 在 ito 电极上形成单层生物膜, 不受其他微生物菌株的污染, 经 rDNA 序列和 ITO 电极上生物膜的扫描电子显微图像证实, 如前所述4。为确定 EET 过程的速率限制, 监测添加穿梭电子介质的效果, 如100µM anthraquinone-1-sulfonate (α AQS)。有关详细信息, 请参阅代表结果和参考15一节。
  2. 使用注射器将40µL 缺氧 50% (v/v) d2o 添加到电化学反应器中, 这样在反应器中浓度为 0.5% (v/v) d2o。
    注: 为了防止 d2o 添加对生物膜的损坏, 请插入 d2o。
  3. 等待当前稳定, 然后将 D2O 增加到 4.0% (v/v)。
    注意: 要获取绢值 (在 D2o 和 H2o 的存在下当前生产的比率), 请检查同一容量的 H2O 加法对当前生产的影响。

结果

25 h 的潜在应用在 +0.4 V (对她), 在 ITO 玻璃的工作电极上形成单层生物膜, 以前是通过扫描电子显微镜或共聚焦显微镜4确认的。在单层生物膜形成过程中, 从oneidensis MR-1 的当前生产的代表性时间过程显示在图 2中。尽管电流在每次测量中都有改变, 但如果单层生物膜均匀形成, 则产生的电流不会从图 2中的?...

讨论

与蛋白质电化学相比, 我们的全细胞电化学检测具有多种技术优势。蛋白质纯化需要多步骤的耗时程序, 但我们的全细胞方法在细胞培养后需要一天的自组织生物膜形成。为了实现 OM c-青旅和电极之间的稳定交互, 我们只需要对电极表面进行杀菌和清洗;它不需要电极修改来组织蛋白质的方向4,例如, S. oneidensis MR-1 本质上附着在电极上, 同时将 OM c-青旅定?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作在财政上得到了资助, 为特别促进研究从日本促进科学学会 (jsp) KAKENHI 授予数字 24000010, 17H04969 和 JP17J02602, 美国海军研究全球办公室 (N62909-17-1-2038)。Y.T. 是一个 jsp 研究研究员, 并通过该项目的领导研究生学校 (功绩) 支持的 jsp。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

参考文献

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

134bioelectrochemistry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。