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要約

ここで全細胞外膜シトクロムシェワネラ oneidensis氏-1 複合体を介して細胞外の電子輸送の速度へのプロトン輸送の貢献を研究する電気化学実験のプロトコルを提案する.

要約

直接cの電気化学的検出-細菌の外膜に埋め込まれているシトクロム複合体を入力 (外膜c-シトクロム複合体; を入力OM c- 假) が最近セル外部へ呼吸の鎖からの細菌の電子輸送を特徴付ける新規細胞分析法として登場、細胞外の電子輸送 (EET) と呼ばれます。経路と EET 反応の間に電子流の動態を調べた、一方 EET に関連付けられている陽イオン輸送の影響を調べる全細胞の電気化学的手法はまだ確立されていません。本研究では、重水素同位体効果 (キエ) EET の OM cを調べる生化学的手法の例 - 假モデル微生物、シェワネラ oneidensis氏-1, を使用して、説明します。OM cを介して EET - 假微生物の現在の生産の率制限ステップとして機能する場合、EET プロセスに KIE を取得できます。そのため、D2O は、加算の前に上澄みが上流の代謝反応の速度をサポートし、ユニフォームから浮遊性のセルを削除する電子供与体の十分な量が含まれている新鮮なメディアに置き換えられました作用電極上の単分子膜バイオ フィルム。レート制限を確認する方法は、微生物の現在の生産のステップ - 假 OM cを介して EET として述べる。プロトン輸送の動力学を調査するため細胞の電気化学的アッセイの我々 の手法は、他の電気活性微生物系統に適用できます。

概要

S. oneidensis氏 1、 Geobacter sulfurreducens 、PCA など、金属還元微生物菌株が発見されて以来そのままの細菌の細胞の酸化還元タンパク質を直接特徴付けるため電気化学的手法が近年します。外膜 c 型チトクロム複合体 (OM c 假) セル外観1,2,3,4、5の露出があります。OM c- 假は、呼吸鎖から細胞外に位置する固体基板上への電子輸送を仲介します。このトランスポートは、細胞外の電子輸送 (EET)1,6と呼ばれ、新興のバイオ テクノロジー、微生物燃料電池6などの重要なプロセスです。したがって、基になる EET の速度論と機構、および微生物生理学へのリンクを理解する OM c -假を用いて調べた細胞電気化学4、7顕微鏡と組み合わせて8,9、分光10、11、および分子生物学2,4。対照的に、EET 関連する陽イオン輸送など陽子 EET 細胞内動態の影響を調査する方法確立されているやっとのこと重要な役割を持つ細菌の膜を渡るプロトン輸送にもかかわらずシグナリング、恒常性とエネルギー生産12,13,14。本研究で、細胞電気化学測定法を使用しての率制限ステップの id を必要とするs. oneidensis氏 1 セルの EET 動力学に関するプロトン輸送の影響を調査する手法について述べる微生物現在生産15。

関連付けられた EET のプロトン輸送の貢献を評価する直接方法の 1 つは重水素同位体効果 (キエです)。KIE 電子転送速度16プロトン輸送の影響を表す重水素イオン、プロトンの交換時に電子伝達速度の変化として観察可能であります。KIE 自体の理論定着させてきた電気化学測定法を用いた精製酵素17。しかし、以来、 s. oneidensis氏-1 の現在の生産の結果、複数の多様なと変動プロセス18から、レート制限プロセスとして EET を識別できない単に 1 つ。EET と相まってプロトン輸送過程の KIE を観察する我々 は OM cを介して電子輸送によって微生物の現在の生産が制限されることを確認する必要があります - 電極に假。この目的のため最適 pH と KIE 測定前に温度条件を電子供与体として乳酸の高濃度を含む新鮮な培地と培養上清中のソリューションを置き換えこの交換は、2 つの役割を提供しています: (1) これに EET と比較して上流の代謝プロセスのレートを強化、(2) 作業電極 ( s. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムから発売清スイミング セルの省略インジウム スズ添加酸化物 (ITO) 電極)。提示の詳しいプロトコルを新しい実務を維持し、EET プロセスが、律速段階であることを確認します。

プロトコル

1. s. oneidensis氏-1 ITO 電極 (図 1) 上の単分子膜バイオ フィルムの形成

注: 他の微生物の電気化学リアクターの汚染を防ぐためには、すべてのメディア、実装、および電気化学リアクターのコンポーネント殺菌を行う事前に。ときにすべてのプロシージャをクリーン ベンチで行うべきs. oneidensis氏 1 セルを使用し、電気化学リアクターを構築します。

  1. S. oneidensis氏 1 細胞の培養
    注: s. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムが形成された ITO 電極条件を以下報告以前4。
    1. S. oneidensis氏 1 細胞を成長するには、 s. oneidensis氏-1 ルリア ベルターニカミラ (LB) (20 g/L) を有し、15 mL の LB 培地 (20 g/L) 160 rpm で振とうしながら好気性条件で 24 h の 30 ° c になる寒天 (15 g/L) 寒天プレート上に成長のコロニーを追加します。
    2. 6,000 × g , 10 分間の細胞懸濁液を遠心し、15 mL の培地 (pH 7.8) で得られた細胞ペレットを再懸濁します (DM: NaHCO3 【 2.5 g/L CaCl2·2H2O [0.08 g/L]、NH4Cl 【 1.0 g/L MgCl2·6 H2O 【 0.2 g/L 塩化ナトリウム 10 g/L と 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] [HEPES; 7.2 g/L] ethanesulfonic 酸) 10 mM 乳酸と 0.5 g/L 酵母エキス、炭素源として補われた、 s. oneidensis氏 - 1 微量元素、それぞれ。
    3. さらに 160 rpm で振とうしながら 12 h 30 ° C で好気性細胞懸濁液を育成、遠心力場再び 6,000 × g 10 分洗浄で DM 媒体で 2 回結果細胞ペレットの電気化学的前に 6,000 × g で 10 分間遠心分離によって実験。
  2. 3 電極電気化学リアクター (図 1) の建設
    1. 原子炉の下部に作用電極として ITO 基板を置きます。
    2. その後、ガラス シリンダー (直径 2 cm)、ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) カバーを挿入します。銀/塩化銀 (飽和 KCl) と白金線に挿入原子炉参照とカウンター電極としてそれぞれ。
      注: 空気およびソリューションの漏れを防ぐためには、各コンポーネント間にブチルゴム シートを挿入します。
    3. 10 mM 乳酸を添加した DM の 4.0 mL と 0.5 g/L 酵母エキス電気化学リアクターに追加します。
    4. 電気化学リアクターからの漏れがないことを確認した後、窒素ガスを電気化学リアクター電気化学リアクター内の嫌気的条件を維持するために 20 分以上に流れ込みます。
      注: 他の微生物による汚染を防ぐためには、ガスがフィルターされ、電気化学リアクターに流れる前に、。
    5. 電気化学リアクターを電気化学測定装置に接続し、0.4 V を適用 (標準的な水素の電極対彼女) ITO 電極に外部の水循環システムを使用して 30 の ° C で電気化学リアクターの温度を維持します。
      注: 外部電界の影響を防ぐためには、電気化学リアクターはファラデーケージの中に配置する必要があります。
  3. (図 1および図 2) s. oneidensis氏 1 セルの電気化学的栽培
    1. 手順 1.1 600 1.43 の光学密度で得られた懸濁液の細胞密度を調整 10 mM 乳酸と 0.5 g/L 酵母によって補われる DM の nm (外径600) を抽出します。
      注: 正しい外径600を得るためには、OD600 ≦ 0.8 細胞懸濁液を調整 1.43 に OD600前に紫外可視分光光度計に適用します。
    2. 注射器を使って注入ポートを介して電気化学リアクターに細胞懸濁液 0.3 mL を追加: 原子炉で OD600は 0.1 に変更します。
      注: 外径600 0.3 mL 細胞懸濁液の添加外径600ソリューション 4.3 ml 4.0 mL 中結果を含む電気化学リアクターに 1.43 を = = 0.1。別のボリュームとその他の原子炉を使用している場合、細胞密度の計算が必要です。
    3. 25 h ITO 電極に (彼女) と 0.4 V で潜在的なアプリケーションを続行します。
      注: ITO 電極上の単分子膜バイオ フィルムの形成、作り出された電流を示す偏差が図 2の 50% 未満の場合ことを確認します。

2. 10 mM 乳酸 (図 3) と新鮮な DM 媒体と上澄みの交換

  1. 潜在的なアプリケーションを停止し、電気化学リアクターをポテンショスタットと水循環システムから外します。
  2. 10 ミリメートルと新鮮な DM 媒体と上澄みの交換乳酸します。
    1. 10 mM 乳酸 20 分以上で DM を含む媒体から酸素を取り除くボトルに窒素ガスを流れ。
    2. ゆっくりと流れる下、注射器を使用して電気化学反応器内培養上清を削除 (図 3 a, b) の窒素ガス。
      注: 窒素ガスによる ITO 電極上のバイオ フィルムを破損しないよう、ガスは液体表面上フローする必要があります。
    3. 注射器 (図 3 c) を使用して 10 mM 乳酸を含む新鮮な DM の 4.0 mL を追加します。
      注: ITO 電極上のバイオ フィルムを破損しないよう、電気化学リアクターの壁に沿って媒体をゆっくりと挿入します。濡れているバイオ フィルムを保つためには、上清を除去した後すぐに媒体を追加する必要があります。上清を除去した後の中の最大 1 分の注入は、 s. oneidensis氏 1 のバイオから現在の生産には影響しません。
    4. 電気化学リアクターの壁に付着した上清のすべてを削除する電気化学リアクターを傾けます。
    5. 合計で 3 回の手順 2.2.2-2.2.4 を繰り返します。
  3. ガスの流れを停止し、電気化学リアクターを 303 K で ITO 電極に 0.4 V (彼女) の対を適用するもう一度、ポテンシオスタットに接続

3. EET プロセス (図 4) に KIE を測定する重水素水の添加

  1. S. oneidensis氏 1 の単分子膜バイオ フィルムから現在の生産は安定している、急速に増加しませんを確認します。電流が急激に増加、現在安定して ± 5% 増加 10 分以上までを待ちます。
    注:4を既に報告されている、他の微生物の系統の混入しない ITO 電極上の単分子膜バイオ フィルムの形成が rdna 塩基配列と ITO 電極上のバイオ フィルムの走査型電子顕微鏡像で確認をしました。EET プロセスによる速度制限の確認、往復の電子メディエーター 100 μ M アントラキノン-1-スルホン酸 (α-AQS) などの追加の効果を監視します。代表結果のセクションを参照してください、詳細については、15を参照します。
  2. 濃度は 0.5% (v/v) D2O 原子炉のような注射器を使用して電気化学リアクターに無酸素 50% (v/v) D2O の 40 μ L を追加します。
    注: D2O 添加によるバイオ フィルムへの損傷を防ぐため、注入 D2O drop-wise。
  3. 安定し、現在待って、その後 D2O 4.0% (v/v) を追加します。
    注: KIE 値 (D2O と H2O の存在下で現在の生産に対する比率) を得るためには、同じ現在の生産における H2O 添加量の効果を確認します。

結果

(彼女) と 0.4 V で潜在的なアプリケーションの 25 時間後単分子膜バイオ フィルムは ITO ガラス、走査型電子顕微鏡や共焦点顕微鏡4で確認された以前の作用電極に形成されました。単分子膜バイオ フィルムの形成の間にs. oneidensis氏 1 から現在の生産の代表的な時間コースを図 2に示します。現在の生産は現在の間隔で変更...

ディスカッション

我々 の全細胞の電気化学的分析タンパク質電気化学と比較していくつかの技術的な利点があります。蛋白質の浄化には、多段階の時間のかかる手続きが必要ですが、本全体セル手法で自己組織化バイオ フィルム形成細胞培養後 1 日は。OM cの安定した相互作用を達成するために - 假と電極、必要がありますのみ殺菌と電極表面のクリーニングOM cを定位しながら、電極上にアタッ...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品の財政上支えられる補助金・特別推進研究の科学振興費助成番号 24000010、17 H 04969、日本社会からの JP17J02602、米国オフィスの海軍研究のグローバル (N62909-17-1-2038)。保は、日本学術振興会特別研究員、プログラムを通じて日本学術振興会での主要な大学院の学校 (メリット) をサポートします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

参考文献

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