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Resumen

Aquí presentamos un protocolo de los experimentos electroquímicos celulares para estudiar la contribución del transporte de protones a la velocidad de transporte de electrones extracelular a través de los citocromos de la membrana externa de Shewanella oneidensis MR-1.

Resumen

Directa detección electroquímica de c-tipo complejos citocromo incrustados en la membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complejos citocromo; OM c- Cyts) recientemente ha surgido como un método de análisis de celulares nuevos para caracterizar el transporte de electrones bacteriano de la cadena respiratoria al exterior de la célula, conocido como el transporte de electrones extracelular (EET). Mientras que la vía y cinética del flujo del electrón durante la reacción de EET se han investigado, un método electroquímico de la célula entera para examinar el impacto del transporte de cationes asociado con EET todavía no se ha establecido. En el presente estudio, se describe un ejemplo de una técnica bioquímica para examinar el efecto de cinética isótopos de deuterio (KIE) sobre EET mediante OM c- Cyts usando un microbio modelo, Shewanella oneidensis MR-1. El KIE en el proceso EET puede obtenerse si la OTA a través de OM c- Cyts actúa como el paso tarifa-limitador en la actual producción microbiana. Para ello, antes de la adición de D2O, la solución sobrenadante fue reemplazada con medio fresco que contiene una cantidad suficiente de la donante del electrón para apoyar la tasa de reacciones metabólicas por aguas arriba y para eliminar las células planctónicas de un uniforme monocapa biofilm en el electrodo de trabajo. Métodos alternativos para confirmar la limitación de velocidad se paso en actual producción microbiana como EET mediante OM c- Cyts también se describen. Nuestra técnica de un análisis electroquímico de células completas para investigar la cinética del transporte de protones se puede aplicar a otras cepas microbianas electroactivos.

Introducción

Recientemente han surgido técnicas electroquímicas para caracterizar directamente una proteína redox en una célula bacteriana intacta desde el descubrimiento del metal reduciendo las cepas microbianas, como Geobacter sulfurreducens PCA, S. oneidensis MR-1 que tienen complejos de citocromo tipo c de membrana externa (OM c-Cyts) expuestos a la célula exterior1,2,3,4,5. El OM c- Cyts mediar transporte de electrones de la cadena respiratoria a sustratos sólidos situados extracelularmente. Este transporte se denomina transporte de electrones extracelular (EET)1,6 y es un proceso crítico para las biotecnologías emergentes, tales como las células de combustible microbianas6. Por lo tanto, para comprender la cinética subyacente de EET y mecanismos y su relación con la fisiología microbiana, OM c -Cyts han investigado usando celulares electroquímica4,7, combinado con microscopía 8 , 9, espectroscopia10,11y biología molecular2,4. En contraste, los métodos para investigar el impacto del transporte de cationes asociados de EET, por ejemplo, protones, en la cinética de la EET en las células vivas apenas establecidos, a pesar de transporte de protones a través de las membranas bacterianas tienen un papel fundamental señalización, homeostasis y energía producción12,13,14. En el presente estudio, describimos una técnica para examinar el impacto del transporte de protones en la cinética de la EET en la S. oneidensis MR-1 célula usando células completas medidas electroquímicas, que requiere la identificación del paso tarifa-limitador en la microbiana de producción actual15.

Una forma directa de evaluar la contribución del transporte de protones en la OTA asociada es efecto cinético del isótopo deuterio (KIE). El KIE es observable como el cambio en la cinética de transferencia de electrones sobre el reemplazo de protones con los iones de deuterio, que representa el impacto del transporte del protón en electrón transferencia cinética16. La teoría de KIE sí mismo se ha establecido bien con medidas electroquímicas de enzimas purificadas17. Sin embargo, ya que la producción actual en S. oneidensis MR-1 resultado de múltiples procesos diversos y fluctuantes18, uno no puede simplemente identificar EET como el proceso de limitación de velocidad. Para observar el KIE en procesos de transporte de protones junto con EET, tenemos que confirmar que la actual producción microbiana está limitada por el transporte de electrones a través de OM c- Cyts al electrodo. Para ello, sustituimos la solución sobrenadante con medio fresco que contiene una alta concentración de lactato como un donante del electrón en el pH óptimo y la temperatura antes de la medición de KIE; este reemplazo sirve dos funciones: (1) mejora la tasa de los procesos metabólicos por aguas arriba en comparación con la OTA y (2) omite las células de la natación en el sobrenadante del monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 en el (electrodo de trabajo electrodos de óxido de estaño dopado (ITO) de indio). El protocolo detallado presentado pretende ayudar a los nuevos profesionales mantener y confirmar que el proceso EET es la etapa de determinación de tasa.

Protocolo

1. formación de una monocapa de Biofilm de S. oneidensis MR-1 en un electrodo ITO (figura 1)

Nota: Para evitar la contaminación del reactor electroquímico con otros microbios, todos los medios, instrumentos y componentes del reactor electroquímico deben esterilizarse previamente. Cuando utilizando células de S. oneidensis MR-1 y la construcción de los reactores electroquímicos, todos los procedimientos deben realizarse en una mesa de trabajo limpia.

  1. Cultivo de células de S. oneidensis MR-1
    Nota: Un monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 se constituyó en un ITO electrodo siguiendo las condiciones anteriormente registrados4.
    1. Para hacer crecer células de S. oneidensis MR-1, agregar una colonia de S. oneidensis MR-1 cultivadas en una placa de agar que Luria-Bertani (LB) (20 g/L) y bacto agar (15 g/L) en 15 mL de medio LB (20 g/L) a 30 ° C por 24 h en condiciones aeróbicas con agitación a 160 rpm.
    2. Centrifugue la suspensión de células en 6.000 × g por 10 min y resuspender el precipitado celular resultante en 15 mL de medio definido (pH 7.8) (DM: NaHCO3 [2, 5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] y 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ácido (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido [HEPES; 7,2 g/L]), suplementado con lactato de 10 mM y 0,5 g/L Extracto de levadura como fuente de carbono y oligoelementos para S. oneidensis MR-1 , respectivamente.
    3. Además cultivar la suspensión celular aeróbica a 30 ° C por 12 h con agitación a 160 rpm y centrifugar nuevamente a 6.000 × g por 10 minutos lavar el precipitado de células resultante dos veces con medio de DM por centrifugación durante 10 minutos a 6.000 × g antes de la electroquímica experimento.
  2. Construcción de un reactor electroquímico de tres electrodos (figura 1)
    1. Poner un sustrato ITO como el electrodo de trabajo en la parte inferior del reactor.
    2. Posteriormente, coloque un cilindro de vidrio (diámetro de 2 cm) y una cubierta de politetrafluoroetileno (PTFE). Luego inserte (KCl saturado) de Ag/AgCl y un alambre de platino en el reactor como los electrodos de referencia y contador, respectivamente.
      Nota: Para evitar la fuga de aire y solución, inserte una hoja de goma de butilo entre cada componente.
    3. Añadir 4,0 mL de MS suplementados con lactato de 10 mM y extracto de levadura 0.5 g/L en el reactor electroquímico.
    4. Después de confirmar que no hay ninguna salida desde el reactor electroquímico, flujo del gas del nitrógeno en el reactor electroquímico durante 20 min para mantener condiciones anaeróbicas en el reactor electroquímico.
      Nota: Para evitar la contaminación con otros microbios, el gas debe filtrarse antes de que fluya en el reactor electroquímico.
    5. Conectar el reactor electroquímico con un potenciostato y aplicar +0.4 V (versus electrodo de hidrógeno estándar, ella) al electrodo ITO, manteniendo la temperatura del reactor electroquímico a 30 ° C mediante un sistema de circulación de agua exterior.
      Nota: Para evitar el efecto de un campo eléctrico externo, el reactor electroquímico debe colocarse en una jaula de Faraday.
  3. Cultivo electroquímico de S. oneidensis MR-1 células (figura 1 y figura 2)
    1. Ajustar la densidad celular de la suspensión obtenida en el paso 1.1 a una densidad óptica de 1,43 a 600 nm (OD600) con DM complementado por levadura de lactato y 0,5 g/L de 10 mM del extracto.
      Nota: Para obtener el correcto OD600, aplicar la suspensión de OD600 ≤ 0,8 a un espectrómetro de UV-vis antes de ajustar el OD600 a 1,43.
    2. Agregar 0,3 mL de la suspensión de células en el reactor electroquímico a través del puerto de inyección con una jeringa: OD600 en el reactor cambia a 0.1.
      Nota: La adición de la suspensión celular de 0.3 mL con OD600 = 1,43 en el reactor electroquímico que contiene 4,0 mL resultado medio en 4,3 mL de solución con un OD600 = 0.1. Cuando utilice otros reactores con volúmenes distintos, el cálculo de la densidad celular se requiere.
    3. Continuar la aplicación en +0.4 V (frente a ella) al electrodo ITO para 25 h.
      Nota: Para la formación de una monocapa de biopelícula en un electrodo ITO, asegúrese de que la corriente producida exhibe una desviación inferior al 50% de la figura 2.

2. reemplazo del sobrenadante con medio fresco de DM con 10 mM de lactato (figura 3)

  1. Detener la aplicación potencial y desconectar el reactor electroquímico el potenciostato y el sistema de circulación de agua.
  2. Reemplazo del sobrenadante con medio fresco de DM con 10 mM de lactato
    1. Flujo de nitrógeno gas en un frasco que contenga DM con lactato de 10 mM más de 20 minutos para quitar el oxígeno del medio.
    2. Lentamente Quite todo el sobrenadante dentro el reactor electroquímico utilizando una jeringa, en que fluye el gas del nitrógeno (figura 3a, b).
      Nota: Para evitar romper el biofilm en el electrodo ITO por el gas del nitrógeno, el gas debe fluir sobre la superficie del líquido.
    3. Añadir 4,0 mL de MS dulce que contiene lactato de 10 mM utilizando una jeringa (Figura 3C).
      Nota: Para evitar romper el biofilm en el electrodo ITO, inyecte lentamente el medio a lo largo de la pared del reactor electroquímico. Para mantener la biopelícula húmeda, se debe agregar el medio inmediatamente después de la eliminación del sobrenadante. Inyección de la media hasta 1 min después de la eliminación del sobrenadante no afecte la producción actual de biofilm de S. oneidensis MR-1.
    4. Incline el reactor electroquímico para quitar todo el sobrenadante fijado a la pared del reactor electroquímico.
    5. Repita los pasos 2.2.2-2.2.4 tres veces en total.
  3. Detener el flujo de gas y conectar el reactor electroquímico para el potenciostato, aplicando +0.4 V (frente a ella) al electrodo ITO a 303 K.

3. adición de deuterio agua para medir el KIE en el proceso EET (figura 4)

  1. Confirman que la producción actual de una monocapa de biofilm de S. oneidensis MR-1 es estable y no aumenta rápidamente. Si la corriente aumenta abruptamente, espere hasta que la corriente se estabiliza dentro de un aumento de 5% durante 10 minutos.
    Nota: La formación de una monocapa de biopelícula en un electrodo ITO sin contaminación de otras cepas microbianas fue confirmada por secuencias del rDNA y una escaneo imagen microscópica electrónica de la biopelícula en un electrodo ITO, como se informó anteriormente4. Para la confirmación de la limitación de la tasa por el proceso EET, monitorear el efecto de la adición de mover electrones mediadores como 100 μm antraquinona-1-sulfonato (α-AQS). Ver la sección de Resultados de representante y de referencia15 para más detalles.
  2. Agregar 40 μl de anoxia 50% (v/v) D2O en el reactor electroquímico utilizando una jeringa de tal manera que la concentración es de 0.5% (v/v) D2O en el reactor.
    Nota: Para evitar daños en el biofilm por la adición de2O de D, inyectar D2O mediante goteo.
  3. Espera para que estabilizar la corriente y posteriormente añadir el D2O hasta un 4.0% (v/v).
    Nota: Para obtener el valor KIE (el ratio de producción actual en presencia D2O y H2O), verificar el efecto del mismo volumen de adición de H2O en la producción actual.

Resultados

Después de 25 h de potencial aplicación en +0.4 V (contra ella), se formó una biopelícula de monocapa en el electrodo de trabajo de vidrio de ITO, que previamente fue confirmado por una microscopía electrónica o la microscopia confocal4. El curso del tiempo representativo de la producción actual de la S. oneidensis MR-1 durante la formación de una biopelícula de monocapa se muestra en la figura 2. Aunque la corriente ...

Discusión

Nuestro análisis electroquímico de células completas tiene varias ventajas técnicas en comparación con electroquímica de proteína. Mientras que la purificación de proteínas requiere varios pasos lentos procedimientos, nuestro método de celulares toma un día de formación del biofilm auto-organizada después de cultivo celular. Para lograr una interacción estable entre OM c- Cyts y el electrodo, necesitamos sólo la esterilización y limpieza de la superficie del electrodo; no requiere modificación d...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado financieramente por un subvenciones de investigación promovido especialmente de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI número de concesión 24000010, 17H 04969 y JP17J02602, el nos oficina de Naval investigación Global (N62909-17-1-2038). Y.T. es un investigador de JSP y apoyado por JSP a través del programa escuelas de graduados principales (mérito).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

Referencias

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