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摘要

在这里, 我们提出一项协议, 以量化卵泡在培养卵巢小鼠没有连续切片。用全器官免疫荧光和组织清除, 用光学切片代替物理切片。这种样品制备和可视化方法保持了器官的完整性, 促进了特定细胞的自动定量。

摘要

在哺乳动物生殖生物学领域的研究通常涉及评估卵巢和睾丸的整体健康。具体来说, 在女性中, 卵巢健康通常通过形象化和定量卵泡和卵母细胞来评估。由于卵巢是一个不透明的三维组织, 传统的方法需要费力地切片的组织成许多序列切片, 以便可视化整个器官细胞。此外, 由于这种方法的量化通常只需要评分的一部分, 由大约卵母细胞的直径分开, 它容易不准确。在这里, 一个协议被描述, 而不是利用整个器官组织清除和免疫荧光染色小鼠卵巢, 以可视化卵泡和卵母细胞。与传统方法相比, 该协议有利于在卵巢内可视化细胞, 原因有很多: 1) 卵巢在样品制备和加工过程中保持完好;2) 小卵巢不易切片, 可轻松检查;3) 细胞量化更容易、更准确地实现;和 4) 整个器官成像。

引言

为了研究哺乳动物卵巢的细胞组成和形态学特征, 科学家们经常依赖于体内实验, 其次是石蜡嵌入卵巢的免疫组织化学染色。最近, 虽然整个卵巢器官培养已被证明是研究卵巢功能的有效替代方案1,2,3,4 , 因为该技术可以结合更好的可视化和量化工具。传统上, 卵巢形态学分析依靠石蜡嵌入序列切片重建三维卵巢结构, 但除了费力和耗时, 连续切片石蜡嵌入组织不保证器官的适当的重建, 并且区段经常丢失或错误地命令在过程中。

除了与串行切片相关的技术难题外, 通常用于量化每个子房的卵泡数的方法也有变化5,6。目前使用的方法变异在研究中损害了卵巢储备的 meta 分析5,7。例如, 不同研究文章中的卵泡数在特定应变6中的相似发育年龄之间可能会有10倍或更多的变化。这些在报告的卵泡数量上的巨大差异会导致混淆, 并阻碍了交叉研究的比较。实验中, 从序列切片中进行卵泡定量的传统方法是通过计数一个预先定义的节数 (例如,每第五、第十或其他部分) 的卵泡来完成的。使用这种方法的卵泡计数的变异性不仅来自于计算节数的周期性, 而且还产生于截面厚度的变化, 以及生成串行部分5、6的技术经验。除了变异外, 传统组织切片的另一个缺点是, 幼兽的小卵巢的切片特别具有挑战性, 并且高度依赖于组织方向8。

下面的协议描述了常规使用的卵巢培养技术1 , 但大大改善了传统的卵泡定量替代物理切片与组织清除和光学切片使用共焦显微镜8 ,9。用组织浸泡 (不需要经颅灌注或电泳) 在尿素和山梨醇基溶液中 (例如,刻度 (0)10) 的清除被证明与染色兼容, 并允许减少清除时间而不损害成像深度。其他报告的方法 (例如、ScaleA28、10、SeeDB11、ClearT12和 ClearT212) 要么更耗时, 要么不允许对示例进行深入的光学解析。光学切片是有利的, 因为它是少劳动密集型和维护器官的三维体系结构7,8。这种方法的另一个好处是, 样品的制备不需要昂贵的试剂来清除组织, 而且可以相对容易地进行。

具体而言, 所描述的协议已被优化为培养的小鼠卵巢在产后五天, 但已经进行了卵巢范围从产后一天 0-10。该方法利用卵巢培养系统, 组织自然附着在其培养的膜上, 促进器官的处理和操作。所描述的培养系统可用于维持说明卵巢长达10天, 并评估不同实验条件对卵母细胞存活率的影响13。所描述的量化程序是使用非商业图像处理包 (斐济-ImageJ14 ) 进行的, 可以在大多数个人计算机上进行。此外, 用于量化的图像可以广泛地提供给科学界, 从而允许将来进行 meta 分析。

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研究方案

康奈尔大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 已经批准了这里描述的所有方法, 根据2004-0038 号议定书 JCS。

1. 文书和文化媒体的准备工作

  1. 用10% 漂白剂擦拭工作区域, 并允许漂白剂在工作区域表面保持至少5分钟的清洁。5分钟后, 用干净的纸巾和70% 乙醇 (乙醇) 去除多余的漂白剂。用70% 乙醇彻底清洁解剖显微镜。
    注意: 重要的是, 工作区域必须至少半无菌, 以避免对器官培养的污染。
  2. 包装干净的镊子和剪刀与纸巾, 70% 乙醇, 直到使用时间。
    注意: 理想的解剖工具可能根据卵巢的年龄/大小而变化。最好的结果是使用一个尖锐的显微解剖剪刀, 两个细尖钳 (5 或 55) 和一个显微解剖虹膜剪刀。
  3. 在锥形管, 使50毫升的卵巢培养基和温暖的37°c 水浴。
    1. 要使子房区域性为中等4, 请补充1x 最小的基本培养基 (内存) 与10% 胎牛血清 (血清), 25 毫米 (4-(2 羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES), 100 单位/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 0.25 µg/毫升两性霉素 B (例如, 45 毫升的记忆, 5 毫升的热灭活血清, 1.25 毫升的 HEPES, 0.5 毫升100x 的青霉素, 链霉素和两性霉素 b)。
  4. 在卵巢培养前准备板材和插入物。
    1. 在组织培养罩中, 将1毫升的卵巢培养基添加到35毫米的组织培养板中。
    2. 预浸泡的插入膜与培养基。增加足够的培养基, 通常大约0.55 毫升每井, 到24井载体组织培养板, 并且安置细胞文化插入在井中。确保插入的膜接触介质。
    3. 在实验中, 根据预期的卵巢数量, 准备35毫米板和水井的细胞培养插入物。将包含1毫升培养基的35毫米板和包含培养基的24井载体板和插入到37°c、5% CO2和大气 O2孵化器中。
  5. 在解剖范围旁边安排一个热板, 将温度设置为37摄氏度。保持37°c, 5% CO2和大气 O2孵化器靠近解剖室。

2. 卵巢解剖和器官培养

注意: 只要暴露在非理想温度下, 卵巢就可以在室温下进行解剖。

  1. 弄死的雌性老鼠在产后5天, 通过斩首, 一次一次。
    注: 必须根据正在进行研究的设施中的 IACUC 准则进行安乐死。
  2. 用70% 乙醇喷洒动物。将动物放在干纸巾顶部的解剖显微镜下。放置一个35毫米的组织培养皿, 包含卵巢培养培养基接近解剖显微镜。
  3. 用镊子或显微解剖虹膜剪刀, 通过皮肤的动物和进入腹腔切开切口, 用谨慎不要切开入肠道。把肠子从腹腔推出来, 找到卵巢。提取卵巢并将其放入含有培养基的35毫米组织培养皿中。
  4. 一旦卵巢已经从动物解剖, 增加了解剖显微镜的放大倍数, 以便更好地可视化卵巢和任何附加组织。用干净的细尖钳, 去除所有非卵巢组织, 如囊和脂肪组织。在去除附着的非卵巢组织时, 要注意保持卵巢完好无损。
  5. 一旦卵巢被隔离, 将一对进入预浸泡细胞培养的载体24孔板 (指步骤1.4.2 和 1.4.3) 和调整培养基的体积, 以确保它足以保持器官湿润 (没有完全淹没它)。
    注意: 在转移卵巢时, 注意不要在细胞培养插入物的细胞膜上戳一个洞。
  6. 放置说明器官在37°c, 5% CO2和大气 O2孵化器。
  7. 重复步骤 2.1-2.6, 直到每个动物的卵巢被解剖, 并放置在细胞培养插入的24井板包含卵巢培养基。
  8. 每2天改变卵巢培养培养基, 使用温暖的卵巢介质整除数从37°c 水浴, 并在所需的实验时间点进行协议的3部分。

3. 组织固定

  1. 在15毫升锥形管中, 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中准备4% 多聚甲醛 (粉煤灰)(例如, 将2毫升16% 的粉煤灰电子显微镜分级为6毫升 1x PBS)。
    注意: 粉煤灰是一种危险物质, 应在化学罩下处理。
  2. 修复培养的卵巢, 而不删除的组织从文化插入, 通过覆盖组织与新鲜准备的4% 粉煤灰溶液。用塑料粘合剂封住盘子的边缘 (以避免蒸发), 并将样品在一夜之间放置在4摄氏度。
    注意: 为了便于处理和组织完整性, 避免在整个过程中将卵巢从细胞培养中插入。在插入物表面附着的培养卵巢有利于处理, 而不损害或失去器官。
  3. 用70% 乙醇冲洗组织 3x, 然后进行步骤4.1 或将其存储在充满70% 乙醇的闪烁瓶中, 4 °c, 直到进一步加工。
    注: 如果使用组织内在表达荧光蛋白, 储存样品与70% 乙醇可能会大大减少信号。或者, 组织可以漂洗和存储在 PBS 与0.2% 叠氮化钠 (南3)。然而, 南3是剧毒的, 并造成严重的吸入危险。在油烟机中制作库存解决方案, 并佩戴适当的个人防护设备, 如实验室外套和丁腈橡胶手套。

4. 全芒免疫荧光

  1. 在通透步骤4.3 之前, 将固定组织放在 RT 1x PBS 中至少4小时。
  2. 准备通透解决方案和堵塞解决方案。
    1. 如所述, 准备通透解决方案。对 1x PBS, 添加0.2% 聚乙烯醇 (PVA), 0.1% 硼氢化钠 (NaBH4) 溶液 (从12重量 .% 在14米氢氧化钠 (氢氧化钠) 溶液) 和1.5% 聚乙二醇叔对辛醚 (非离子表面活性剂洗涤剂)。在50毫升圆锥管, 添加5毫升 10x PBS, 0.1 克聚乙烯醇, 50 µL 的 NaBH4和750µL 的非离子表面活性剂洗涤剂, 然后添加超纯水高达50毫升和搅拌良好的室温, 直到混合物完全解决。
    2. 按照说明准备阻塞解决方案。到 1x PBS, 添加0.1% 非离子表面活性剂洗涤剂, 0.15% 的2.5M 甘氨酸 pH 7.4, 10% 正常山羊血清, 3% 牛血清白蛋白 (BSA), 0.2% 南3, 100 单位/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 0.25 µg/毫升两性霉素 b. 准备一个股票解决方案2.5 M 甘氨酸将93.8 克甘氨酸溶解于超纯水中500毫升的最终容积 (pH 7.4) 和10% 南3的库存溶液, 溶解5毫升的超纯水;然后, 在50毫升锥形管中加入5毫升 10x PBS, 50 µL 非离子表面活性剂洗涤剂, 750 µL 甘氨酸溶液, 5 毫升山羊血清, 1.5 克 BSA, 1 毫升的南3库存溶液, 准备堵塞溶液。和0.5 毫升的青霉素、链霉素和两性霉素 B 的100x 库存。添加超纯水多达50毫升和注射器过滤器最终的解决方案。
  3. 从瓶子中取出 1x PBS, 然后添加足够的通透溶液完全淹没卵巢。将样品放在通透溶液中的轨道振动筛 (例如, nutator) 室温下4小时。
    注: 潜伏期可能根据器官厚度而变化。
  4. 用足够的阻断溶液取代通透溶液, 完全淹没卵巢。用塑料粘合剂封住瓶子, 在一个轨道振动筛的室温下把组织孵化至少12小时。
  5. 根据制造商的数据表, 准备阻止溶液中的主抗体稀释。
    注意: 注意并非所有抗体都与清除剂兼容。每个样本所需的平均体积约为750µL。
    1. 对于卵母细胞量化, 使用 TAp63 (核卵母细胞标记) 和 MVH (细胞质生殖细胞标记)。
      注: 免疫荧光图像中使用的抗体为小鼠 anti-p63 和兔抗 MVH)。主抗体溶液可重复使用2x 或更多, 如果储存在4摄氏度之间的染色协议和妥善处理, 以避免细菌生长。
  6. 将含有组织的插入物放置在24井板中, 并添加大约750µL 的原抗体溶液。确保卵巢完全淹没。用塑料粘合剂封住盘子, 以尽量减少蒸发, 并在眼眶上的室温下让组织孵化4天。
  7. 准备洗涤液。
    1. 如有说明, 准备洗涤液。制作 1x PBS, 加入 0.2% PVA 和0.15% 非离子表面活性剂洗涤剂。在50毫升圆锥管中, 加入5毫升 10x PBS, 0.1 克聚乙烯醇, 75 µL 非离子表面活性剂洗涤剂和超纯水, 最终体积为50毫升。
  8. 去除原抗体稀释, 并添加大量的洗涤液。一定要把卵巢淹没。允许卵巢浸泡在溶液中过夜, 在室温下的轨道振动筛。
  9. 更换洗涤液, 在轨道振动筛上孵育2小时以上。
  10. 重复步骤4.9 再一次。
  11. 在阻断溶液中准备二次抗体稀释。
    注: 所用的二级抗体为山羊抗鼠488荧光染料, 山羊中饲养的抗兔594荧光染料。请参见步骤4.5。每个样本所需的平均体积。
  12. 从卵巢中取出洗涤液并添加二次抗体溶液。保护样品免受光 (用铝箔包装板) 和密封板用塑料粘合剂, 以减少蒸发。在室温下在2天的轨道振动筛上孵化样品。
    注: 在后续的所有孵化步骤中, 使用铝箔继续保护样品免受光线的侵害。
  13. 从样品中取出二次抗体溶液并添加洗涤液。在8小时的轨道振动筛上孵化。
    注: 如果需要 46-Diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色, 添加 50 ng/毫升的 DAPI 到第一洗涤步骤 (~ 8 小时孵化)。
  14. 更换洗涤液进行隔夜清洗。
  15. 在准备结算解决方案时 (见第5节), 用新鲜的溶液代替隔夜洗涤液, 并将样品保存在室温下的轨道振动筛上。

5. 卵巢清除和成像

  1. 准备刻度 (0) 清除解决方案。
    1. 准备刻度 (0) 通过在给定比例中添加试剂来清除解决方案10 : 40% d-(-) 山梨醇 (w/v), 10% 甘油, 4.3 米尿素和20% 二甲基亚砜 (亚砜), pH 8.1 (例如在50毫升圆锥管, 增加2.5 毫升甘油, 10 克山梨醇, 5 毫升亚砜, 12 毫升9米尿素, 总容积为25毫升。混合解决方案通过反转在50°c 30 分钟和德加之前使用。
  2. 卸下洗涤液并将样品浸入清除液中。为更好的结果保持在轨道振动筛的样品。
  3. 每天更换清除解决方案 2x, 直到组织变得透明 (大约2天)。
  4. 一旦组织被清除, 准备标本进行成像, 仔细删除含有培养卵巢的插入膜与一个精细的尖端手术刀, 并将样品放在玻璃滑梯上。
  5. 在能够进行光学切片的显微镜上对样品进行成像。

6. 卵母细胞量化

注意: 有许多不同的计算机程序可以量化细胞。下面描述的是使用非商业图像处理包 (斐济-ImageJ14) 进行卵母细胞量化的协议。

  1. 对于感兴趣的特定蜂窝标记, 使用Z堆栈图像系列的扁平最大强度投影 (没有 DAPI 通道), 请将图像转换为图像下拉列表Type下的黑白8位图像。菜单。
  2. 在图像下拉菜单下, 突出显示调整选项卡, 然后选择阈值。
  3. 手动将阈值调整为最佳标识每个卵母细胞的级别。确定级别后, 单击应用生成黑白图像。完成后, 通过使用椭圆或手绘图标对示例进行量化。
    注: 斐济-ImageJ 有不同的选择, 以微调的图像, 将用于粒子量化。例如, 在进程 |二进制选项卡中, 有不同的选项可用于改进对要计算的内容的检测。在图 4中, 用于更好地个性化卵泡的选项是侵蚀, 后跟填充孔, 最后是分水岭。
  4. 在分析下拉菜单下, 选择分析粒子。根据所需的分辨率设置参数。

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结果

该协议包括在卵巢解剖后的6个主要步骤, 如图 1所述。图 2, 图 3, 图 4突出显示了该协议最新颖的功能, 包括使用斐济 ImageJ 优化卵巢组织清除和全组织卵母细胞定量. 图 2A显示了落后5天产后固定子房的图像 (左)...

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讨论

研究哺乳动物的繁殖需要使用和量化的专门细胞, 不定期服从细胞培养。但是, "体外" 区域性系统在维护子房和卵泡生存能力 1,15中是有效的。在卵巢培养过程中, 组织需要更大的表面积来通过扩散来交换养分。因此, 5 天大鼠卵巢是理想的大小和形状的器官培养。该协议是为七天的文化中保持的卵巢进行了优化, 但卵巢培养长度可以根据具体的科学...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢丽贝卡威廉斯和乔安娜德拉库拉克鲁兹从康奈尔的 Recknagel 成像和安德鲁的帮助建议和技术援助。这项工作得到了国家卫生研究所资助 S10-OD018516 (康奈尔的影像设施), T32HD057854 J.C.B. 和 R01-GM45415 J.C.S。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp pointsRobozRS-5912Micro dissecting scissor
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5Integra Miltex17-305XFine tip forceps
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp pointsIntegra Miltex18-1618Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor
1X Minimal Essential Media (MEM)ThermoFisher Scientific11090-081
Fetal Bovine SeriumCorning35011CV
HEPES (1M)Gibco15630080
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240062Used in Step 1.3.1
35mm Tissue Culture Treated DishCorning430165
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture InsertsThermoFisher Scientific141006Pore size: 8μm
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences1571016% solution
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco10010023
Nutator mixer GyroTwister™LabnetS1000-A-Bthree dimensional shaker
Normal Goat SerumVWR103219-578
Bovine Serum Albumen (BSA)VWR97061-416
Sodium Azide (NaN3)Sigma-AldrichS2002-25G
Sodium borohydride solution (NaBH4)Sigma-Aldrich452904-25MLUse the solution, rather than the tablet or powder form 
Polyvinyl Alcohol (PVA)Sigma-AldrichP8136-250GCold water soluble
Triton™ X-100Sigma-Aldrich93443-100MLpolyethylene glycol tert-octylphenyl ether
Syringe filtersThermoFisher Scientific725-252025mm
10mL SyringesBD309695
Mouse anti-p63 antibody (4A4)Biocare MedicalCM 163ADilution 1:500
Rabbit anti-MVH antibodyAbcamab13840Dilution 1:600
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594ThermoFisher ScientificA-11032Dilution 1:1000
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488ThermoFisher ScientificA-11034Dilution 1:1000
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) ThermoFisher Scientific62248
D-(-)sorbitol Sigma-Aldrich240850-100G
GlycerolSigma-AldrichG9012-100ML
UreaSigma-AldrichU5378-500G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-5X10ML
FIJI-ImageJImage processing software
Disposable plastic transfer pipettesVWR414044-034

参考文献

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