전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

요약

여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

초록

포유류 생식 생물학의 분야에 있는 연구는 종종 난소와 고환의 전반적인 건강을 평가 포함 됩니다. 특히, 여성, 난소 피트 니스는 시각화 및 낭과 oocytes를 측정 하 여 평가 자주. 난소는 불투명 한 3 차원 조직 이기 때문에 전통적인 접근 힘들게 부 러 뜨 리는 조직의 수많은 직렬 섹션으로 전체 기관에 걸쳐 세포를 시각화 하기 위해 필요 합니다. 또한,이 방법으로 정량화는 일반적으로 점수는 oocyte의 대략적인 직경에 의해 구분 된 섹션의 하위 집합만 수반, 때문에 그것은 부정확 하 경향이 있다. 여기, 프로토콜 대신 전체 장기 조직 개간 및 면역 형광 마우스 난소 낭과 oocytes 시각화의 얼룩을 활용 하 여 설명 합니다. 전통적인 방법에 비해,이 프로토콜은 수많은 이유로 난소 내 세포를 시각화에 대 한 유리: 1) 난소 보존할 샘플 준비와 처리; 섹션에 어렵다, 2) 작은 난소; 쉽게 시험 될 수 있다 3) 세포질 부 량은 더 쉽게 그리고 정확 하 게 달성; 그리고 4) 몇 군데 전체 기관.

서문

세포질 구성 및 포유류 난소의 형태학 상 특징을 공부 하기 위하여 과학자 들은 종종 vivo에서 실험 뒤에 immunohistological 포함 된 파라핀 난소의 얼룩에 의존 합니다. 최근에 그러나, 전체 난소 기관 문화 기술은 더 나은 시각화와 결합 될 수 있다 때문에 난소 기능^1,2,,34 를 공부 하는 효과적인 대안이 될 수 입증 하고있다 더 많은 고 정량화 도구입니다. 전통적으로, 난소 형태학의 분석 3 차원 재구성 난소 아키텍처 파라핀 임베디드 직렬 섹션에서 하지만 되기 힘들고 시간이 걸리고, 순차적으로 포함 된 파라핀 조직 단면에 따라 달라 집니다. 기관의 적절 한 개조를 보장 하지 않으며 섹션 자주 분실 또는 잘못 주문 과정에서.

직렬 구분과 관련 된 기술 과제, 이외에 정기적으로 여 포 난소^5,6당 숫자를 계량 하는 데 사용 하는 방법에 변화가 있습니다. 현재 사용 하는 방법론 변화 연구^5,7에 걸쳐 난소의 메타 분석을 손상 한다. 예를 들어 다른 연구 기사에서 여 포 숫자 특정 스트레인⁶내에서 유사한 발달 세 사이 이상의 사진에 의해 달라질 수 있습니다. 보고 뿌리 부 량에 큰 차이이 혼란으로 이어질 수 있습니다 고 간 연구 비교를 방해. 실험적으로, 직렬 섹션에서 뿌리 정량화 하는 기존의 방법과 섹션의 미리 정의 된 수의 모 낭을 계산 하 여 수행 됩니다 (예를 들어, 모든 다섯 번째, 10 번째, 또는 다른 섹션). 이 방법을 사용 하 여 포 수 있는 가변성 섹션 두께, 경험과 기술 직렬 섹션^5,6생성에 섹션 계산에 주기에서 뿐만 아니라 변화에서 발생 합니다. 그것의 다양성 뿐만 아니라 다른 전통적인 조직 단면 단점은 젊은 동물에서 작은 난소의 단면화는 특히 도전적이 고 매우 조직 방향⁸에 의존.

프로토콜 아래 일상적으로 사용 된 난소 문화 기술¹ 설명 하지만 전통적인 뿌리 정량화 조직 삭제와 실제 단면 및 광학 단면 confocal 현미경^{8 사용 하 여 대체 하 여 크게 향상 시켰습니다. ,9}. 에 요소 및 솔 비 톨-기반 조직 집중 (하지 않아도 transcranial 관류 또는 전기 이동 법)을 사용 하 여 삭제 솔루션 (예를 들어, ScaleS(0)¹⁰)는 immunostaining와 호환 되 고 입증의 감소에 대 한 허용 화상의 깊이 손상 없이 개간 시간. 다른 보고 된 방법 (예, ScaleA2^8,10, SeeDB¹¹,¹², ClearT 및 ClearT2¹²) 하나 더 많은 시간을 소비 또는 샘플의 깊이 있는 광학 해상도 허용 하지 않습니다. 광 단면 적은 노동 집약 이며 오르간의 3 차원 건축^7,8을 유지 하기 때문에 유리 하다. 이 방법의 또 다른 이점은 샘플의 준비 조직을 값비싼 시 약을 필요로 하지 않습니다 및 상대적으로 쉽게 수행할 수 있습니다.

특히, 설명 하는 프로토콜은 출생 후 하루 5 교양된 마우스 난소에 대 한 최적화 되었습니다 하지만 출생 후 일 0-10에서에서 배열 하는 난소에 실시 되었습니다. 메서드는 자연스럽 게 조직에 그것은 경작, 기관 처리 및 조작을 용이 하 게 하는 막에 부착 하는 난소 문화 시스템을 사용. 설명 하는 문화 시스템 최대 10 일 동안을 어떻게 다른 실험 조건 평가 explanted 난소 oocyte 생존¹³방해할 수 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 설명 정량화 절차 처리 패키지 피지 ImageJ¹⁴ 비 상업적 이미지를 사용 하 여 수행 하 고 대부분 개인용 컴퓨터에서 수행할 수 있습니다. 또한, 정량화에 대 한 사용 되는 이미지 만들 수 있습니다 광범위 하 게 사용할 수 있는 미래의 메타 분석에 대 한 되므로, 사회 과학에 대 한.

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프로토콜

코넬 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 여기, JCS 2004-0038 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법을 승인 했습니다.

1입니다. 악기와 문화 미디어 준비

1. 지우기 작업 영역 10% 표 백제와 깨끗 하 고 적어도 5 분 동안 작업 영역 표면에 표 백제를 허용. 5 분 후 깨끗 한 종이 타 올, 70% 에탄올 (EtOH) 초과 표 백제를 제거 합니다. 70%와 철저 하 게 해 현미경 청소 EtOH.
   참고: 작업 영역 적어도 반 기관 문화의 오염을 피하기 위하여 메 마른 것이 중요 하다.
2. 70%를 적신 종이 타월로 깨끗 한 집게와가 위를 랩 EtOH 사용의 시간까지.
   참고: 이상적인 해 부 도구 난소의 나 이/크기에 따라 달라질 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 한 날카로운 마이크로 해 시저, 두 좋은 팁 집게 (중 번호 5 또는 55)를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 아이리스가 위를 해 부 한 마이크로.
3. 원뿔 튜브에 50 mL의 난소 문화 미디어와 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 확인 합니다.
   1. 난소 배양⁴을 하려면 최소한의 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 25 m m (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 0.25 µ g/mL x 1을 보충 암포 B (예를 들어, 열 5 mL의 MEM, 45 mL FBS, HEPES, 1.25 mL 및 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 mL 비활성화).
4. 접시와 난소 문화 전에 삽입을 준비 합니다.
   1. 조직 문화 후드에서 35 m m 조직 문화 접시에 난소 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
   2. 전 담가 문화 매체와 막을 삽입 합니다. 당 약 0.55 mL, 24-잘 캐리어 조직 배양 플레이트, 그리고 장소는 세포 배양에에서 삽입 잘 일반적으로 충분 한 미디어를 추가 합니다. 삽입의 막 접촉 매체 다는 것을 확인 하십시오.
   3. 35mm 판과 실험에 난소의 예상된 번호에 따라 셀 문화 삽입과 우물의 수를 준비 합니다. 문화 미디어와 문화 미디어와 37 ° C, 5% CO₂, 그리고 대기 O₂ 인큐베이터에 삽입을 포함 하는 24-잘 캐리어 격판덮개의 1 mL를 포함 하는 35 m m 접시를 놓습니다.
5. 옆 절 개 범위 뜨거운 접시를 준비 하 고 37 ° c 온도 설정 37 ° C, 5% CO₂ 를 유지 하 고 해 부 룸은 대기 O₂ 인큐베이터.

2. 난소 절 개 및 기관 문화

참고: 난소 수 수 해 부 상 온에서 비 이상적 온도에 노출은 최소한으로.

1. 잘린, 한 번에 한 하 여 5, 출생 일에 여성 쥐를 안락사.
   참고: 안락사 IACUC 지침 연구 수행 되 고 있는 시설에 따라 실시 해야 합니다.
2. 동물 스프레이 70 %EtOH. 동물 해 부 현미경 아래 건조 종이 타월 위에 놓습니다. 해 부 현미경 가까운 난소 문화 미디어 포함 35 m m 조직 문화 접시를 놓습니다.
3. 집게 또는 마이크로 해 부 아이리스 시저, 절 개는 피부를 통해 동물의 그리고 복 부 구멍으로 잘라 내장을 안 주의 사용 하 여 확인 합니다. 복 부 구멍에 밀어 내장 하 고 난소를 찾습니다. 난소를 추출 하 고 문화 미디어를 포함 하는 35 m m 조직 문화 접시에 그들을 배치.
4. 일단 난소에서 동물 해 부 되어 있다, 난소 및 모든 연결 된 조직 증가 하기 위해서는 더 나은 해 부 현미경의 배율 시각화. 좋은 팁 집게 청소, 부르사, 지방 조직 등 모든 비-난소 조직을 제거. 연결 된 비 난소 조직을 제거 하는 경우 난소를 그대로 유지 하는 주의 해야 합니다.
5. 난소는 격리, 일단 캐리어 24-잘 접시의 미리 젖된 세포 문화 삽입으로 쌍을 배치 (1.4.2와 1.4.3 단계 참조) 오르간을 축축한 유지 하기에 충분을 매체의 볼륨을 조정 하 고 (하지 않고 완전히 물속에 넣는 그것).
   주의: 수 난소를 전송할 때 셀 문화 삽입의 막에 있는 구멍을 찌 르 지 않도록 주의 하십시오.
6. 장소 explanted 37 ° C, 5% CO₂, 그리고 대기 O₂ 인큐베이터에서 장기.
7. 2.1 2.6 각 동물의 난소는 해 부 및 세포 배양에 배치 될 때까지 난소 문화 매체를 포함 하는 24-잘 접시의 삽입 하는 단계를 반복 합니다.
8. 변경 사용 하 여 난소 문화 매체 2 일 마다 난소 미디어 aliquots 37 ° C 물 탕에서 따뜻하게 하 고 원하는 실험 시간 지점에서 프로토콜의 3 부로 진행.

3. 조직 고정

1. 15 mL 원뿔 튜브에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에 4 %paraformaldehyde (PFA) 준비 (예를 들어, 추가 16 %PFA 전자 현미경 학년의 2 mL 1 x PBS의 6 mL).
   주의: PFA 유해 물질 이며 화학 후드 처리 해야 합니다.
2. 취재 갓된 4 %PFA 솔루션으로 조직 하 여 조직 문화 삽입에서 제거 하지 않고 교양된 난소를 수정. 플라스틱 접착제 ()을 피하기 위해 증발 접시의 가장자리를 밀봉 및 샘플 4 ° C에서 밤새 껏 두기 위하여.
   참고: 처리 및 조직의 무결성을 촉진 하기 위하여 하지 마십시오 전체 절차를 통해 셀 문화 삽입에서 난소 생기 죠. 삽입의 표면에 부착 된 교양된 난소는 처리에 대 한 유리 손상 또는 기관 잃고 없이.
3. 3 조직 린스 x 70 %EtOH 고 4.1 또는 섬광 튜브에 가득한 게 단계로 진행 70 %EtOH 4 ° C에서 추가 처리.
   참고: 조직 endogenously 사용 하는 경우 70% 샘플을 저장 하는 형광 단백질을 표현 EtOH 크게 줄일 수 신호. 또는 조직 씻어 서 하 고 0.2% 나트륨 아 지 드 (NaN₃)와 함께 PBS에 저장 될 수 있습니다. 그러나 NaN₃ 는,, 매우 독성과 심각한 흡입 위험이. 증기 두건에서 재고 솔루션을 만들고 처리 실험실 코트와 니트 릴 장갑 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용.

4. 전체 산 면역 형광

1. Permeabilization 단계 4.3 이전 4 h의 최소 고정된 조직 RT에 1 x PBS에 놓습니다.
2. Permeabilization 솔루션 및 차단 솔루션을 준비 합니다.
   1. 설명 된 대로 permeabilization 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS를 0.2% 폴 리 비닐 알코올 (PVA), 0.1% 나트륨 borohydride (NaBH₄) 솔루션 (12 wt.% 14 M 수산화 나트륨 (NaOH) 해결책에서), 및 1.5% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르 (비 이온 계면 활성 제 세제)를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA, NaBH₄, 50 µ L 및 비 이온 계면 활성 제 세제 750 µ L의 0.1 g 추가 다음 초순 추가 최대 50 mL를 물과 혼합 솔루션에서 완전히 될 때까지 실 온에서 잘 선동.
   2. 설명한 대로 차단 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 2.5 M 글리신 pH 7.4의 세제, 0.15% 0.1% 비 이온 계면 활성 제를 추가, 10% 정상 염소 혈 청, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 0.2% 할머니₃, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 및 0.25 µ g/mL 암포 B. 준비의 재고 솔루션 2.5 500 mL 마지막 볼륨 (pH 7.4)에 초순에 글리신의 93.8 g와 10% 할머니₃ 의 재고 솔루션 초순; 50 mL에 5 g을 용 해 하 여 용 해 하 여 M 글리신 그런 다음 50 mL 원뿔 튜브에서 10 x PBS, 비 이온 계면 활성 제 세제, 글리신 재고 솔루션, 염소 혈 청, 1.5 g, BSA의 NaN₃ 재고 솔루션의 1 mL의 5 mL의 750 µ L의 50 µ L의 5 mL을 추가 하 여 차단 솔루션 준비 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 ml. 50 mL 주사기 필터의 마지막 볼륨까지 초순 최종 솔루션을 추가 합니다.
3. 제거 및 유리병에서 1 x PBS를 삭제 하 고 완전히 난소 잠수함 충분 한 permeabilization 솔루션을 추가 합니다. 궤도 셰이 커 (예: nutator) 실 온에서 4 시간에 permeabilization 솔루션에서 샘플을 놓습니다.
   참고: 보육 시간 기관 두께 따라 달라질 수 있습니다.
4. Permeabilization 솔루션을 완전히 난소 잠수함 충분 한 차단 솔루션 바꿉니다. 플라스틱 접착제로 유리병을 밀봉 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 12 h의 최소 잠복기를 둡니다.
5. 제조업체의 데이터 시트에 의하여 차단 솔루션에서 기본 항 체 희석을 준비 합니다.
   참고: Note 모든 항 체 개간 에이전트와 호환 됩니다. 샘플 당 필요한 평균 볼륨은 약 750 µ L.
   1. Oocyte 정량화 사용 TAp63 (핵 oocyte 마커)과 MVH (세포질 세균 셀 표식).
      참고: 면역 형광 이미지에 사용 되는 항 체는 마우스 안티-p63, 토끼 안티-MVH). 1 차적인 항 체 솔루션 재사용된 2 수 x 이상의 프로토콜을 얼룩이 지 사이 4 ° C에 저장 하 고 박테리아의 성장을 방지를 제대로 처리 하는 경우.
6. 24-잘 접시에 조직을 포함 하는 삽입 놓고 1 차적인 항 체 솔루션의 약 750 µ L를 추가 합니다. 난소는 완전히 빠져들 확인 합니다. 증발을 최소화 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 4 일 동안 잠복기를 두고 플라스틱 접착제로 접시를 봉인.
7. 세척 솔루션을 준비 합니다.
   1. 설명 된 대로 세척 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 하 게 0.2 %PVA 0.15% 비 이온 계면 활성 제 세제를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA의 0.1 g, 비 이온 계면 활성 제 세제와 50 mL의 최종 볼륨까지 초순 75 µ L를 추가 합니다.
8. 1 차적인 항 체 희석 제거 하 고 세척 솔루션의 관대 한 금액을 추가. 항상 잠수함 난소를 확인 하십시오. 궤도 셰이 커에 실 온에 하룻밤 솔루션에 담가 난소를 허용 합니다.
9. 세척 솔루션을 장착 하 고 2 시간 이상 궤도 셰이 커에 품 어.
10. 4.9 단계 반복 하 여 하나의 추가 시간.
11. 솔루션을 차단에 이차 항 체 희석을 준비 합니다.
    참고: 사용 하는 2 차 항 체는 반대로 마우스 488 형광 염료 염소와 염소에서 안티 토끼 594 형광 염료에서. 4.5 단계를 참조 하십시오. 평균 볼륨에 대 한 샘플 당 필요합니다.
12. 난소에서 세척 솔루션을 제거 하 고 이차 항 체 해결책을 추가 하십시오. 빛 (알루미늄 호 일 포장 판)에서 샘플을 보호 하 고 증발을 최소화 하기 위해 플라스틱 접착제로 접시를 봉인. 2 일 동안 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 품 어.
    참고: 샘플을 보호 하는 알루미늄 호 일을 사용 하 여 모든 후속 인큐베이션 단계에서 계속 합니다.
13. 이차 항 체 솔루션 샘플에서 제거 하 고 세척 해결책을 추가 하십시오. 8 h는 궤도 흔드는에 품 어.
    참고: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩은 원하는 경우, 첫 번째 세척 단계 (~ 8 h 외피)에 DAPI의 50 ng/mL를 추가 합니다.
14. 하룻밤 세척을 위한 세척 솔루션을 교체 합니다.
15. 준비 하는 동안 개간 솔루션 (섹션 5 참조), 신선한 솔루션으로 솔루션을 세척 하는 하룻밤을 장착 하 고 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 계속.

5입니다. 난소 지우기 및 이미징

1. ScaleS(0) 솔루션을 청소 준비 합니다.
   1. ScaleS(0) 주어진된 비율에 시 약을 추가 하 여 솔루션¹⁰ 삭제 준비: 40 %D-(-) 톨 (w/v), 10% 글리세롤, 4.3 M 요소, 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), pH 8.1 (예: 50 mL 원뿔 튜브에 추가 글리세롤, sorbitol의 10 g의 2.5 mL DMSO의 5 mL 및 9 M 우 레 아 25 mL의 총 볼륨의 12 mL. 30 분 동안 50 ° C에서 반전 하 여 솔루션을 믹스와 사용 전에 드.)
2. 세척 솔루션을 제거 하 고 솔루션을 지우기에 샘플 잠수함. 더 나은 결과 위해 궤도 셰이 커에 샘플을 유지 합니다.
3. 2 청소 솔루션을 대체 조직을 투명 하 게 (약 2 일) 될 때까지 매일 x.
4. 조직에는 선택이 취소 되어, 일단 준비 샘플 영상에 대 한 신중 하 게 벌금 교양된 난소를 포함 하는 삽입 멤브레인을 제거 하 여 메스 고 유리 슬라이드에 샘플 배치 팁.
5. 영상 현미경 광학 단면 수에 샘플으로 이동 합니다.

6. oocyte 정량화

참고: 셀을 정할 수 있는 많은 다른 컴퓨터 프로그램 있습니다. 아래 설명 된 oocyte 정량화 피지 ImageJ¹⁴비 상업적 이미지 처리 패키지를 사용 하는 프로토콜이입니다.

1. 이미지 이미지 드롭-다운에서 형식 에서 흑인과 백인 8 비트 이미지로 변환 (DAPI 채널) 없이 관심의 특정 세포 표식에 대 한 Z-스택 이미지 시리즈의 병합된 최대 강도 투영을 사용 하 여, 메뉴입니다.
2. 이미지 메뉴에서 조정 탭을 강조 표시 하 고 임계값을 선택 합니다.
3. 수동으로 가장 각 개별 oocyte 식별 수준 임계값을 조정. 수준이 결정 되 면 흑백 이미지를 생성 하려면 적용 을 클릭 합니다. 완료 되 면, 타원형 또는 Freehand 아이콘을 사용 하 여 묘사 하 여 샘플을 계량.
   참고: 피지 ImageJ는 미세 입자 정량화에 사용 될 이미지를 조정 하려면 다른 옵션이 있습니다. 예를 들어, 과정에에서 | 바이너리 탭, 계산 될 것입니다 무슨의 탐지를 향상 하는 데 사용할 수 있는 다른 옵션이 있다. 그림 4에서는 더 낭을 개별화 하는 데 사용 하는 옵션 Erode, 구멍 채우기, 및 마지막으로 유역이었다.
4. 분석 메뉴에서 분석 입자를 선택 합니다. 원하는 해상도 따라 매개 변수를 설정 합니다.

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결과

6 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜 난소의 절 개를 그림 1에 설명 된 대로 다음. 그림 2 , 그림 3 , 그림 4 조직 난소와 피지 ImageJ를 사용 하 여 전체 조직 oocyte 정량화에 대 한 삭제의 최적화를 포함 하는이 프로토콜의 가장 새로운 기능을 강조...

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토론

포유류 복제의 연구를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양에 의무가 있지 않은 특수 셀을 측정 해야 합니다. 그러나, 문화 시스템 비보 전 난소 및 여 포 생존^1,15유지에 효과적입니다. 난소 문화 중 조직 확산을 통해 영양분의 교환에 대 한 더 큰 표면 영역을 필요합니다. 따라서, 5 일 오래 된 마우스 난소 크기에 이상적입니다 및 장기 문화에 대 한 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points	Roboz	RS-5912	Micro dissecting scissor
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5	Integra Miltex	17-305X	Fine tip forceps
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points	Integra Miltex	18-1618	Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor
1X Minimal Essential Media (MEM)	ThermoFisher Scientific	11090-081
Fetal Bovine Serium	Corning	35011CV
HEPES (1M)	Gibco	15630080
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062	Used in Step 1.3.1
35mm Tissue Culture Treated Dish	Corning	430165
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts	ThermoFisher Scientific	141006	Pore size: 8μm
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010023
Nutator mixer GyroTwister™	Labnet	S1000-A-B	three dimensional shaker
Normal Goat Serum	VWR	103219-578
Bovine Serum Albumen (BSA)	VWR	97061-416
Sodium Azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002-25G
Sodium borohydride solution (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452904-25ML	Use the solution, rather than the tablet or powder form
Polyvinyl Alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136-250G	Cold water soluble
Triton™ X-100	Sigma-Aldrich	93443-100ML	polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
Syringe filters	ThermoFisher Scientific	725-2520	25mm
10mL Syringes	BD	309695
Mouse anti-p63 antibody (4A4)	Biocare Medical	CM 163A	Dilution 1:500
Rabbit anti-MVH antibody	Abcam	ab13840	Dilution 1:600
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594	ThermoFisher Scientific	A-11032	Dilution 1:1000
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488	ThermoFisher Scientific	A-11034	Dilution 1:1000
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	ThermoFisher Scientific	62248
D-(-)sorbitol	Sigma-Aldrich	240850-100G
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012-100ML
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-5X10ML
FIJI-ImageJ			Image processing software
Disposable plastic transfer pipettes	VWR	414044-034