Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar os folículos nos ovários culturas de ratos jovens sem seccionamento serial. Usando a imunofluorescência todo órgão e tecido de compensação, seccionamento físico é substituído com seccionamento óptico. Este método de preparação da amostra e visualização mantém a integridade do órgão e facilita a quantificação automatizada de células específicas.

Resumo

Pesquisa no campo da biologia reprodutiva de mamíferos, muitas vezes envolve avaliar a saúde geral dos ovários e testículos. Especificamente, nas fêmeas, aptidão ovário frequentemente é avaliada pela visualização e quantificação dos folículos e ovócitos. Porque o ovário é um tecido tridimensional opaco, abordagens tradicionais exigem laboriosamente, cortar o tecido em numerosas seções seriais para visualizar células por todo o órgão inteiro. Além disso, porque a quantificação por este método geralmente envolve apenas um subconjunto das seções separadas pelo diâmetro aproximado de um oócito de pontuação, é propenso a imprecisão. Aqui, um protocolo é descrito que em vez disso, utiliza compensação de tecido de todo órgão e mancha da imunofluorescência de ovários de rato para visualizar os folículos e ovócitos. Em comparação com as abordagens mais tradicionais, este protocolo é vantajoso para a visualização de células dentro do ovário por vários motivos: 1) o ovário permanece intacto em toda a preparação das amostras e processamento; 2) pequenos ovários, que são difíceis de seção, podem ser examinados com facilidade; 3) celular quantificação é alcançada mais facilmente e com precisão; e 4) o órgão todo fotografado.

Introdução

A fim de estudar a composição celular e características morfológicas dos ovários de mamíferos, os cientistas muitas vezes dependem de experiências na vivo seguidas de reagidos coloração dos ovários de parafina incorporado. Mais recentemente, porém, cultura de ovário todo órgão tem provado para ser uma alternativa eficaz para estudar a função ovárica^1,2,3,4 , porque a técnica pode ser acoplada com melhor visualização e ferramentas de quantificação. Tradicionalmente, a análise da morfologia ovariana depende reconstrução tridimensional arquitetura de ovário de parafina incorporada seções serial, mas, além de ser trabalhosa e demorada, serialmente seccionamento tecido parafina incorporado é que não garantia a reconstrução adequada do órgão, e seções são muitas vezes perdidas ou mis ordenou no processo.

Além dos desafios técnicos associados com seccionamento serial, também há variações nos métodos usados rotineiramente para quantificar números do folículo por ovário^5,6. A variabilidade metodológica utilizada atualmente prejudica a meta-análise da reserva ovariana através de estudos de^5,7. Por exemplo, números de folículo de artigos de pesquisa diferentes podem variar por 10 vezes ou mais entre as idades de desenvolvimento semelhantes dentro de uma cepa específica de⁶. Estas grandes diferenças na quantificação do folículo relatado podem levar a confusão e tem impedido o estudo transversal comparações. Experimentalmente, as abordagens tradicionais para quantificação de folículo de seções seriais são executadas pela contagem de folículos de um número pré-definido de seções (por exemplo, cada quinto, décimo, ou outra seção). Variabilidade nas contagens de folículo usando esta abordagem surge não só de periodicidade em quais seções são contadas, mas também de variações na espessura de corte e a experiência técnica na geração de seções serial^5,6. Além de sua variabilidade, outra desvantagem de seccionamento de tecido tradicional é que o seccionamento dos ovários pequenos de animais jovens é especialmente desafiador e altamente dependente de orientação de tecido⁸.

O protocolo abaixo descreve uma técnica de cultura de ovário rotineiramente utilizados¹ mas grandemente melhora a quantificação de folículo tradicional substituindo seccionamento físico com tecido de compensação e seccionamento óptico utilizando microscopia confocal^{8 ,9}. Limpar utilizando a imersão de tecido (sem a necessidade de perfusão transcraniana ou electroforese) em um e sorbitol-à base de ureia solução (por exemplo, ScaleS(0)¹⁰) provou ser compatível com a imunocoloração e permitiu a redução do tempo de compensação sem comprometer a profundidade da imagem. Outros métodos relatados (por exemplo, ScaleA2^8,10, SeeDB¹¹, Clear¹²e ClearT2¹²) estão mais tempo consumindo ou não permitem resolução óptica em profundidade da amostra. Seccionamento óptico é vantajoso porque é menos trabalhoso e mantém arquitetura tridimensional^{7,8 do órgão}. Outra vantagem desta abordagem é que a preparação das amostras não requer reagentes caros para limpar o tecido e pode ser realizada com relativa facilidade.

Especificamente, o protocolo descrito foi otimizado para ovários rato cultivados em cinco dias pós-natal, mas tem sido conduzido nos ovários desde dia pós-natal 0 - 10. O método faz uso de um sistema de cultura de ovário em que o tecido naturalmente anexa à membrana no qual é culta, facilitando a manipulação de órgãos e manipulação. O sistema de cultura descrito pode ser usado para manter explantados ovários durante 10 dias e para avaliar como diferentes condições experimentais podem interferir com o oócito sobrevivência¹³. O procedimento de quantificação descrito é executado usando a pacote FIJI-ImageJ¹⁴ de processamento de imagem não-comercial e pode ser realizado na maioria dos computadores pessoais. Além disso, imagens usadas para quantificação podem ser feitas amplamente disponíveis para a comunidade científica, permitindo assim para meta-análise futura.

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Protocolo

Institucional Cuidado Animal da Universidade de Cornell e Comissão de utilização (IACUC) aprovou todos os métodos descritos aqui, sob o protocolo n. o 2004-0038 JCS.

1. preparação dos instrumentos e meios de cultura

1. Limpe a área de trabalho limpa com 10% de lixívia e permitir que a lixívia ficar na superfície da área de trabalho pelo menos 5 min. Depois de 5 min, retire a excesso lixívia com toalhas de papel limpo e 70% de etanol (EtOH). Limpar o microscópio dissecar cuidadosamente com 70% EtOH.
   Nota: É importante que a área de trabalho seja pelo menos semi estéril para evitar contaminação de culturas de órgão.
2. Enrole limpo fórceps e a tesoura com uma toalha de papel umedecida com 70% EtOH até o tempo de uso.
   Nota: As ferramentas de dissecação ideal podem variar de acordo com a idade/tamanho do ovário. Os melhores resultados são obtidos usando um afiado micro dissecação scissor, duas pinças de ponta fina (qualquer número 5 ou 55) e um micro dissecando tesoura de íris.
3. Em um tubo cônico, certifique-se 50 mL de meio de cultura de ovário e quente em banho maria a 37 ° C.
   1. Para tornar o meio de cultura de ovário⁴, suplemento 1 x Media mínimos essenciais (MEM) com 10% de soro Fetal bovino (FBS), 25mm (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), 100 unidades/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, 0,25 µ g/mL Anfotericina B (por exemplo, 45 mL de MEM, 5 mL de calor inativada FBS, 1,25 mL de HEPES e 0,5 mL de 100 ações de x de anfotericina B, penicilina e estreptomicina).
4. Prepare pratos e inserções antes da cultura do ovário.
   1. Em uma capa de cultura de tecidos, adicione 1 mL de meio de cultura de ovário para uma placa de cultura de tecido de 35 mm.
   2. Pré-embebição inserir membrana com meio de cultura. Adicione mídia suficiente, geralmente cerca de 0,55 mL por bem, para o placa de cultura de tecido portador de 24-bem e coloque uma cultura celular de inserir no poço. Certifique-se de que membrana a inserção toca a mídia.
   3. Prepare o número de placas de 35 mm e poços com inserções de cultura celular de acordo com o número esperado de ovários no experimento. Coloca as placas de 35 mm, contendo 1 mL de meios de cultura e placa carregadora 24-poço contendo meios de cultura e inserções em um 37 ° C e 5% CO₂atmosférica incubadora de₂ O.
5. Organizar uma chapa quente ao lado do escopo de dissecação e seleccionar a temperatura de 37 ° c. Manter a 37 ° C, 5% de CO₂ e a incubadora de₂ O atmosférica está perto da sala de dissecação.

2. ovário dissecção e cultura de órgãos

Nota: Ovários podem ser dissecados em temperatura ambiente, enquanto a exposição à temperatura não-ideal é mínima.

1. Eutanásia de ratos fêmeas no pós-Natal dia 5, por decapitação, uma de cada vez.
   Nota: A eutanásia deve ser conduzida de acordo com diretrizes IACUC presentes na instalação onde a pesquisa está sendo executada.
2. Pulverizar o animal com 70% EtOH. Coloque o animal na parte superior da toalha de papel seca sob o microscópio de dissecação. Coloque um prato de cultura de tecido de 35 milímetros contendo meios de cultura de ovário perto o microscópio de dissecação.
3. Com pinça ou tesoura de íris uma dissecação micro, fazer uma incisão através da pele do animal e na cavidade abdominal, com cuidado para não cortar os intestinos. Empurrar os intestinos fora da cavidade abdominal e localizar os ovários. Extrair os ovários e colocá-los na cultura de tecidos de 35mm cápsula contendo meios de cultura.
4. Uma vez que os ovários têm sido dissecados do animal, aumente a ampliação do microscópio dissecação para visualizar melhor os ovários e qualquer tecido anexado. Com limpar a pinça de ponta fina, retire todos os não-tecido, tais como bursa e tecido adiposo. Tenha cuidado para manter os ovários intactos ao remover o anexo não-tecido.
5. Uma vez que os ovários estão isolados, colocar o par as inserções de cultura de células previamente embebido da placa carregadora 24-poço (consulte os passos 1.4.2 e 1.4.3) e ajustar o volume do meio para garantir que é suficiente manter o órgão húmida (sem completamente submergindo-lo).
   Cuidado: Tenha cuidado para não fazer um buraco na membrana da inserção da cultura de pilha ao transferir os ovários.
6. Lugar explantados órgãos em 37 ° C, 5% de CO₂e incubadora de₂ O atmosférica.
7. Repita os passos 2.1-2.6 até os ovários de cada animal são dissecados e colocados na cultura de pilha inserir da 24-placa contendo meio de cultura de ovário.
8. Mudança do meio de cultura de ovário cada 2 dias, usando aquecido alíquotas de mídia do ovário de banho maria a 37 ° C e prossiga para a parte 3 do protocolo no ponto desejado tempo experimental.

3. fixação de tecidos

1. Em um tubo cônico de 15 mL, preparar paraformaldeído 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS) de 1x (por exemplo, adicionar 2 mL de classe de microscopia eletrônica PFA de 16% para 6 mL de 1X PBS).
   Cuidado: PFA é uma substância perigosa e deve ser tratada sob uma capa de química.
2. Corrigi os ovários culturas, sem remover o tecido da inserção da cultura, cobrindo o tecido com a solução recentemente preparada de PFA 4%. Selar as bordas da placa com adesivo plástico (para evitar a evaporação) e coloque as amostras a 4 ° C durante a noite.
   Nota: Para facilitar a manipulação e a integridade do tecido, evite deslocando ovários de inserção da cultura de célula ao longo de todo o procedimento. Ovários de culturas ligados à superfície da pastilha são vantajosos para manipulação sem danificar ou perder o órgão.
3. Lave o tecido 3 x com 70% EtOH e também prosseguir para a etapa 4.1 ou loja, em frascos de cintilação cheio de 70% EtOH a 4 ° C até mais processamento.
   Nota: Se utilizar tecido endogenamente expressando proteínas fluorescentes, armazenando as amostras com 70% EtOH pode reduzir muito o sinal. Alternativamente, tecido pode ser lavado e armazenado na PBS com 0,2% de azida de sódio (NaN₃). NaN₃ no entanto, é altamente tóxico e representa um risco de graves por inalação. Faça a solução estoque na coifa e manipular a usar equipamento de protecção adequado como um laboratório casaco e nitrilo luvas.

4. toda montagem de imunofluorescência

1. Coloque o tecido fixo em 1X PBS em RT para um mínimo de 4 h antes da etapa de permeabilização 4.3.
2. Prepare a solução de permeabilização e solução de bloqueio.
   1. Prepare a solução de permeabilização conforme descrito. A PBS 1x, adicione 0,2% álcool polivinílico (PVA), solução de 0,1% de sódio borohidreto (NaBH₄) (a partir de 12 wt.% em solução de hidróxido de sódio (NaOH) de 14 M) e 1,5% polietileno glicol tert -octilfenil éter (detergente tensoativo não-iônico). Em um tubo cónico de 50 mL, adicionar 5 mL de PBS de 10x, 0,1 g de PVA, 50 µ l de NaBH₄e 750 µ l de detergente tensoativo não-iônico e, em seguida, adicione ultrapura até 50 mL de água e agitar bem à temperatura ambiente até obter uma mistura totalmente em solução.
   2. Prepare a solução de bloqueio conforme descrito. Para 1X PBS, adicionar 0,1% de tensoativo não-iônico detergente, 0,15% de pH de 2,5 M glicina 7.4, soro de cabra normal de 10%, 3% albumina de soro bovino (BSA), 0,2% NaN₃, 100 penicilina unidades/mL, 100 µ g/mL Estreptomicina e 0,25 µ g/mL anfotericina B. preparem uma solução stock de 2.5 glicina de M, dissolvendo 93,8 g de glicina em água ultrapura para um volume final de 500 mL (pH 7,4) e uma solução de 10% NaN₃ dissolvendo-se 5 g em 50 mL de água ultrapura; Então, em um tubo cónico de 50 mL preparar a solução de bloqueio pela adição de 5 mL de 1X PBS 10, 50 µ l de detergente tensoativo não-iônico, 750 µ l de solução de glicina, 5 mL de soro de cabra, 1,5 g de BSA, 1 mL da solução NaN₃ e 0,5 mL de 100 ações de x de anfotericina B, penicilina e estreptomicina. Adicione água ultrapura até um volume final de filtro 50 mL e a seringa a solução final.
3. Remova e descarte a PBS 1x do frasco e adicione suficiente solução de permeabilização para submergir completamente os ovários. Coloca a amostra em solução de permeabilização em um agitador orbital (por exemplo, nutator) à temperatura ambiente durante 4 h.
   Nota: O tempo de incubação pode variar de acordo com a espessura do órgão.
4. Substitua a solução de permeabilização suficiente solução bloqueio para submergir completamente os ovários. Feche o frasco com o adesivo plástico e deixar o tecido incubando durante um período mínimo de 12 horas a temperatura ambiente em um agitador orbital.
5. Prepare a diluição de anticorpo primário em solução de bloqueio conforme o datasheet do fabricante.
   Nota: Observe que nem todos os anticorpos são compatíveis com o despachante. O volume médio necessário por amostra é aproximadamente 750 µ l.
   1. Para a quantificação do oócito, use TAp63 (marcador nuclear oócito) e MVH (marcador citoplasmática de células germinativas).
      Nota: Os anticorpos utilizados nas imagens de imunofluorescência são de rato anti-p63 e coelho anti-MVH). A solução de anticorpo primário pode ser reutilizado 2 x ou mais, se armazenado a 4 ° C entre protocolos de coloração e tratada adequadamente para evitar o crescimento bacteriano.
6. Coloque a pastilha que contém o tecido em uma placa de 24 e adicionar cerca de 750 µ l de solução de anticorpo primário. Certifique-se de que os ovários estão completamente submersos. A placa com adesivo plástico para minimizar a evaporação e deixam o tecido incubando por 4 dias à temperatura ambiente em um agitador orbital do selo.
7. Prepare a solução de lavagem.
   1. Prepare a solução de lavagem como descrito. Faça 1X PBS, adicione 0,2% PVA e 0,15% tensoativo não-iônico de detergente. Em um tubo cónico de 50 mL, adicione 5 mL de PBS de 10x, 0,1 g de PVA, 75 µ l de detergente tensoativo não-iônico e água ultrapura até um volume final de 50 mL.
8. Remova a diluição do anticorpo primário e adicione uma generosa quantidade de solução de lavagem. Sempre certifique-se de submergir os ovários. Permitir que os ovários de molho na solução durante a noite à temperatura ambiente no agitador orbital.
9. Substitua a solução de lavagem e incubar no agitador orbital por 2 h ou mais.
10. Repita a etapa 4.9 uma vez adicional.
11. Prepare a diluição do anticorpo secundário em solução de bloqueio.
    Nota: Os anticorpos secundários utilizados são anti-rato 488 tintura fluorescente cresceu na cabra e anticoelho 594 tintura fluorescente erguido em cabra. Consulte a etapa 4.5. para o volume médio necessário por amostra.
12. Remover a solução de lavagem dos ovários e adicionar solução de anticorpo secundário. Proteger as amostras da luz (envoltório placa com folha de alumínio) e a placa com adesivo plástico para minimizar a evaporação do selo. Incube as amostras em um agitador orbital em temperatura ambiente por 2 dias.
    Nota: Continue protegendo as amostras de luz usando a folha de alumínio durante todas as etapas subsequentes de incubação.
13. Remover a solução de anticorpo secundário das amostras e adicionar a solução de lavagem. Incube em um agitador orbital para 8 h.
    Nota: Se a coloração de 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) é desejada, adicione 50 ng/mL de DAPI para a primeira etapa de lavagem (incubação ~ 8 h).
14. Substitua a solução de lavagem para uma lavagem durante a noite.
15. Enquanto se prepara a solução de limpeza (ver seção 5), substituir o pernoite solução com solução fresca de lavagem e manter as amostras no agitador orbital à temperatura ambiente.

5. ovário limpando e imagem

1. Prepare ScaleS(0) solução de compensação.
   1. Preparar ScaleS(0) solução¹⁰ de compensação pela adição de reagentes na proporção dada: sorbitol D-(-) de 40% (p/v), 10% de glicerol, ureia de 4,3 M e 20% dimetilsulfóxido (DMSO), pH 8.1 (por exemplo, em um tubo cónico de 50 mL, adicionar 2,5 mL de glicerol, 10 g de sorbitol , 5 mL de DMSO e 12 mL de 9 M de ureia para um volume total de 25 mL. Misture a solução por inversão a 50 ° C por 30 min e desgaseificar antes do uso).
2. Remover a solução de lavagem e submergir as amostras em solução de compensação. Para melhores resultados, manter as amostras no agitador orbital.
3. Substitua a solução de limpeza 2 x diariamente até que o tecido se torna transparentes (aproximadamente 2 dias).
4. Uma vez que o tecido estiver desmarcado, preparar a amostra para a imagem latente, removendo cuidadosamente a inserir membrana contendo os ovários cultivados com uma multa dica bisturi e colocar a amostra sobre uma lâmina de vidro.
5. Prossiga para as amostras em um microscópio capaz de seccionamento óptico de imagem.

6. oócito quantificação

Nota: Existem muitos tipos diferentes de programas que são capazes de quantificar as células. Descrito abaixo, é um protocolo para quantificação do oócito usando o pacote de processamento de imagem não-comercial, FIJI-ImageJ¹⁴.

1. Usando uma projeção de intensidade máxima achatada da Z -pilha imagem série para os marcadores celulares específicos de interesse (sem canal da DAPI), converter a imagem em uma imagem de 8 bits preto e branca sob o tipo em suspenso a imagem no menu.
2. Sob o menu drop-down de imagem , destacar a guia de ajuste e selecione limiar.
3. Ajuste manualmente o limiar para um nível que melhor identifica cada oócito individual. Uma vez que o nível é determinado, clique em aplicar para gerar uma imagem preto e branca. Depois de concluído, quantificar a amostra usando delimitando o ícone Oval ou Freehand .
   Nota: FIJI-ImageJ tem diferentes opções para ajustar a imagem que será utilizada para a quantificação de partículas. Por exemplo, no processo de | Binária guia, existem opções diferentes que podem ser usadas para melhorar a detecção de que será contado. Na Figura 4, as opções usadas para melhor, individualizar os folículos foi Erode, seguido por preencher os buracose, finalmente, divisor de águas.
4. Sob o menu drop-down de Analyze , seleccione Analyze partículas. Defina os parâmetros de acordo com a resolução desejada.

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Resultados

Este protocolo inclui 6 etapas principais a seguir dissecação dos ovários, conforme descrito na Figura 1. Figura 2 , Figura 3 , Figura 4 destacar as características mais inovadores do presente protocolo, que incluem a otimização do tecido de compensação para os ovários e quantificação de oócito todo tecido...

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Discussão

O estudo da reprodução dos mamíferos requer usando e quantificação de células especializadas que não são rotineiramente passíveis de cultura de células. No entanto, sistemas de cultura ex vivo são eficazes na manutenção do ovário e do folículo viabilidade^1,15. Durante a cultura do ovário, o tecido requer uma maior área de superfície para a troca de nutrientes através da difusão. Portanto, 5 - dia velho rato ovários são ideais em tam...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points	Roboz	RS-5912	Micro dissecting scissor
Jewelers style forceps 4-3/8", style 5	Integra Miltex	17-305X	Fine tip forceps
Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points	Integra Miltex	18-1618	Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor
1X Minimal Essential Media (MEM)	ThermoFisher Scientific	11090-081
Fetal Bovine Serium	Corning	35011CV
HEPES (1M)	Gibco	15630080
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062	Used in Step 1.3.1
35mm Tissue Culture Treated Dish	Corning	430165
Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts	ThermoFisher Scientific	141006	Pore size: 8μm
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010023
Nutator mixer GyroTwister™	Labnet	S1000-A-B	three dimensional shaker
Normal Goat Serum	VWR	103219-578
Bovine Serum Albumen (BSA)	VWR	97061-416
Sodium Azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002-25G
Sodium borohydride solution (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452904-25ML	Use the solution, rather than the tablet or powder form
Polyvinyl Alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136-250G	Cold water soluble
Triton™ X-100	Sigma-Aldrich	93443-100ML	polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
Syringe filters	ThermoFisher Scientific	725-2520	25mm
10mL Syringes	BD	309695
Mouse anti-p63 antibody (4A4)	Biocare Medical	CM 163A	Dilution 1:500
Rabbit anti-MVH antibody	Abcam	ab13840	Dilution 1:600
Alexa Fluor® goat anti-mouse 594	ThermoFisher Scientific	A-11032	Dilution 1:1000
Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488	ThermoFisher Scientific	A-11034	Dilution 1:1000
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	ThermoFisher Scientific	62248
D-(-)sorbitol	Sigma-Aldrich	240850-100G
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012-100ML
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-5X10ML
FIJI-ImageJ			Image processing software
Disposable plastic transfer pipettes	VWR	414044-034