膜分馏和 gtpase-关联免疫吸附法检测小 gtpase 预基化和 gtp 结合

摘要

在这里, 我们描述了一个方案, 以研究前化和鸟苷-5 ' 三磷酸 (gtp) 加载的 rho gtpase。该方案由两种详细的方法组成, 即膜分馏和 gtpase 连锁免疫吸附法。该协议可用于测量不同其他小型 gtpase 的预化和 gtp 负载。

摘要

rho gtpase 家族属于 ras 超级家族, 在人类中包括大约20名成员。rho gtpase 在调节各种细胞功能方面非常重要, 包括细胞骨架动力学、细胞动力、细胞极性、轴突引导、水泡贩运和细胞周期控制。rho gtpase 信号的变化在许多病理条件下发挥着至关重要的调节作用, 如癌症、中枢神经系统疾病和免疫系统依赖性疾病。rho gtpase (即甲氧基酯途径中间体的预化) 和 gtp 结合的翻译后修饰是影响该蛋白活化的关键因素。本文提供了两种基本而简单的方法来检测 rho gtpase 的预化和 gtp 结合活性。本手稿对已使用的技术程序的详细情况进行了逐步说明。

引言

rho gtpase 是一组小蛋白质 (21-25 kda), 在整个进化过程中得到很好的保存, 并在小 gtpase 的 ras 超级家族中形成一个独特的亚科。在这个超家族中的每个亚科, 都有一个共享的 g 域核心, 参与 gtpase 活性和核苷酸交换¹。rho 家族和其他 ras 子家族的区别在于, 在小 gtpase 域2中存在 "rho 插入域 "。

根据最近的分类, rho gtpase 被认为是一个信号蛋白家族, 适合 ras gtpase 超级家族³。mammalian rho gtpases 有22个成员, 根据其具体功能和一般特征⁴ , 其中除甘酸、r比1和 cdc42 是该组研究最多的成员。rho gtpase通过严格调节的机制与细胞内信号通路相连, 这种机制依赖于分子开关, 通过蛋白质翻译后修饰5。

gtp 负载和水解是小型 rho gtpase 活性失活循环中必不可少的机制,通过gtpas-激活蛋白 (gap) 进行调节。gap 负责 gtp 水解, 并与负责 gtp 加载反应的鸟嘌呤核苷酸交换因子 (gef) 协同工作。rho gdp 离解抑制剂 (gdi)通过结合到结合到结合到 gdp 绑定的 rho gtpases, 提供了小 rho gtpases 的进一步调控。这抑制了 gdp 离解, 并促进了小 rho gtpase 远离活性的细胞膜位点的分离。还进一步调节了 rho gtpase 蛋白, 涉及 gdi 的前化, 它调节核苷酸的水解和交换, 并控制 gdpw gtp 循环^1,6,7,8。

gtp 负载和 rho gtptase 的前化都参与了 rho gtptase 在细胞溶胶和细胞膜之间的运动, 改变了这些蛋白质 1^,9的亲脂性。上述调节剂与 gdp/gtp 交换活性10的细胞膜磷脂和其他调节蛋白相互作用^.此外, gdi, 离解抑制剂, 阻止 gtp 水解和 gdp/gtp 交换。gdi 抑制了非活性 rho 蛋白与 gdp 的分离, 因此, 它们与下游效应的相互作用。gdi 还调节细胞中的细胞溶胶和膜之间 gtpase 的循环。rho gtpase 的活动在很大程度上取决于它们对细胞膜的运动;因此, gdi 被认为是关键的调节剂, 可以通过隐藏其疏水区域 11^,12来隔离细胞质中的 gtpase。

为了使 rho gtpase 在其活化周期的所有阶段都具有最佳的信号和功能, gtp-boxing/gtp 水解的动态循环至关重要。在这一过程中的任何类型的改变可能会导致随后的变化, 由 rhgtpase 调节的细胞功能, 如细胞极性, 增殖, 形态发生, 细胞分裂, 迁移, 粘附和生存¹³, 14。

目前的协议为读者提供了一个详细的方法来监测小丙二酸 gtpase 激活通过调查他们的婚前和 gdp/gtp 加载. 该方法也可用于检测各种小 gtpase 的预化和 gtp 结合。gtpase 连锁免疫吸附法可用于测量其他类型 gtpase 的活化水平, 如 rac1、rac2、rac3. h-、k-或 n-ras、arf 和 rho¹⁵。药理剂辛伐他汀被用作一个例子, 因为最近有报道称, 它参与了小 rho gtpase 的前化和活性^{8、9、14、16的调节}。

研究方案

1. 用膜细胞分裂法测定红景天的归因

1. 细胞培养和辛伐他汀治疗
   1. 种子 50, 000 u251 细胞在100毫米的盘子和培养他们在杜尔贝克的改良鹰的培养基 (dmem) (高葡萄糖, 10% 胎儿牛血清 [fbs])。
   2. 当30% 的融合时, 通过去除培养基并加入含有辛伐他汀的培养基 (在二甲基亚硫酸盐 [dmso] 中溶解的辛伐他汀 10μm) 对细胞进行处理, 并在 37°c 8 下孵育 36小时.单独使用 dmso 作为车辆控制。
      注: 细胞的细胞和膜分馏需要1000万细胞。
2. 细胞的收集
   1. 从37°c 孵化器中取出细胞。观察显微镜下的细胞以确认融合。
      注: 细胞应为 70%-80% 融合。
   2. 吸入培养基, 用冷磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗细胞1x。加入5毫升乙二胺四乙酸 (edta) 缓冲液 (kcl:400 mgl, nacl:6800 mgl, nahco3:2200 mgl, nah₂₂₀₀4.h2o:140 mg/2, d-葡萄糖: 1, 000 毫克, edta 二钠: 373 mg/2), 并将细胞放回37°c 孵化器 5分钟.
   3. 孵育5分钟后, 用细胞在含有与 edta 相同量的培养基的15毫升管中收集 edta。
      注: 在管内有介质中和 edta, 并阻止细胞膜的任何进一步消化。
   4. 将管子放入冰盒中, 然后进入离心机。
   5. 在4°c 下将离心机设置为 1, 500 x g,并将电池旋转5分钟。
   6. 在不干扰颗粒的情况下取出上清液, 加入1毫升的冷 pbs。把细胞混合好。
   7. 将细胞混合物 (溶液) 转移到新的 1.5 ml 管中, 在4°c 时在 1, 500 x g的温度下离心, 并将细胞旋转5分钟。
   8. 检查颗粒大小 (用于估计下一步缓冲区的体积)。把样品放在冰上。完全丢弃上清液而不干扰颗粒。
   9. 加入冰凉缓冲液 i (10 mm tris-hcl [ph 7.5]、0.1 mm edta、0.1 mm egta、1 mm 二硫素醇和蛋白酶抑制剂鸡尾酒), 通过上下移液将样品混合好, 然后进行超声处理。
3. 声纳
   1. 将声纳设置为五个周期, 每个周期 5秒, 并重复3倍。
   2. 在冰上执行超声。到超离心机上。
      注: 冰凉条件保存蛋白质, 使结果更可靠。
4. 超离心
   1. 使用超离心分离细胞均质体到细胞质和膜组分。将离心机设置为 100, 000 x g , 在4°c 下使用35分钟。如图 1所示, 检查颗粒大小。
      注: 膜分数在管的最底部, 其余是其他细胞质成分。
   2. 收集上清液完全, 同时注意不要打扰颗粒。上清液是细胞质的一部分。将上清液放入新标记的管中。
   3. 加入300μl 的离解缓冲液 (缓冲液 ii) (50 mm tris-hcl [ph 7.5]、0.15 mm 氯化钠、1 mm 二硫醇、1% sds、1 mm edta、1 mm egta 和蛋白酶抑制剂鸡尾酒) 颗粒 (含有膜分数)。通过上下移液很好地混合。
   4. 进行蛋白质测定和西方印迹 (免疫印迹分析) 样品制备。
5. 免疫印迹
   1. 从裂解缓冲液中分离的组分制备细胞蛋白提取物 (20 mm tris-hcl [ph 7.5]、0.5 mm pmsf、0.5% 非离子洗涤剂40、100μm β-甘油 3-磷酸和0.5% 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。
   2. 使用 lowry 方法8测量蛋白质浓度^,并计算裂解缓冲液的体积 (20 mm tris-hcl [ph 7.5]、0.5 mm pmf、0.5% 非变性洗涤剂、辛烷基苯氧基聚氧乙烯醚、100μm β-甘油 3-磷酸和 0.5%)蛋白酶抑制剂鸡尾酒), 使样品之间的蛋白质浓度正常化。
   3. 在90°c 下加热样品 5分钟, 并将样品装上 15% sds-page 凝胶以分离蛋白质。
      注: 为每个样品装入1μg 的蛋白质。计算需要相应运行的卷。
   4. 在还原条件下 (500 nm 甘氨酸、50 mm Tris-HCl 和20% 甲醇) 将分离的蛋白质转移到尼龙膜中 2小时, 在 100 v 的室温 (rt) 下。
      注: 要确认成功的蛋白质转移, 请使用 ponceau 染色或可视化膜上的蛋白质标记。
   5. 用5% 脱脂干牛奶和1x 含乳缓冲盐洗涤剂 (tbssp 0.01% 非离子洗涤剂) 阻断膜;tbst) 在4°c 过夜或 rt 处阻止非特异性抗体结合1小时。
   6. 添加原代抗体进行免疫印迹分析, 并在4°c 下孵育过夜。
      注: 在本实验中, 在 1x tbst 1% 的牛奶中使用了 rac这家数、cdc42、r搜救、gapdh 和泛卡粘蛋白 (12:1000) 稀释剂。采用泛卡粘蛋白和 gapdh 分别测定了膜和细胞质分数的纯度。
   7. 用 1x tbst 清洗膜 3倍, 时间为20分钟。
   8. 用抗兔辣根过氧化物酶 (hrp) 结合二级抗体对相应的原代抗体 (rt 为 1小时) 对膜进行培养。
   9. 将斑点清洗 3x 20分钟, 并通过增强的化学发光 (ecl) 检测进行开发。

2. 使用小 g 蛋白活化法测量 rja gtp 负载

1. 计数 10, 000 细胞/和培养 u251 细胞在一个100毫米的盘子。
2. 当它们是30% 的融合, 治疗细胞与辛伐他汀描述的步骤1.1.2。
3. 把培养板从孵化器里拿出来。观察显微镜下的细胞以确认融合。确保细胞融合 70%-80%。将培养皿放在冰上, 吸气培养基, 用冰凉的 pbs (ph 值 7.2) 清洗细胞3倍。
4. 吸收 pbs。在冰上倾斜 petri 菜一分钟, 以清除 pbs 的所有残余。
   注: 残留的 pbs 会对此检测产生不利影响。
5. 将细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰凉裂解缓冲液中裂解。
   注: 700μl 通常足以满足100毫米培养皿的需要。请参见表 1 , 以找到每个养殖容器的适当体积。
6. 用细胞刮刀收获细胞裂解液。倾斜这种技术的培养板。
7. 将裂解液转移到贴有标签的冰凉低温管, 并将其保持在冰上。
8. 使用漩涡彻底混合。保留10μl 的裂解液进行蛋白质检测, 以测量样品中的蛋白质浓度。
9. 将剩余的细胞裂解液冷冻在液氮中。
   注: 在冷冻细胞裂解液之前, 准备多个细胞裂解物, 以避免反复的冻融循环, 这可能导致丙二酸 gtpase 的活性损失。
10. 将冷冻冷冻管转移到-80°c 的冷冻室, 并将样品存放在 gtpase 联免疫吸附试验中。
    注: 不要将样品存放超过14天。工作迅速, 不要将样品放在冰上超过10分钟。不要同时处理所有的 petri 菜肴。
11. 使用 lowry 方法8测量蛋白质浓度^,并计算裂解缓冲液的体积, 使样品之间的蛋白质浓度正常化。
    注: 最佳浓度通常为 1 mg/ml;但是, 可以检测到 0.3-2 mgml。
12. 在微管中加入60μl 的裂解缓冲液和60μl 的结合缓冲液, 准备一个空白控制。
    注: 空白控件具有除抗原以外的所有试剂, 并用于背景的减法。
13. 通过添加12μl 的 rho 控制蛋白、48μl 的裂解缓冲液和60μl 的结合缓冲液来制备阳性控制。
    注: 阳性对照具有所有试剂, 加上已确认的用于 rha-gtp 的抗原。
14. 把 rho 亲和力板从袋子里拿出来, 放在冰上。
15. 用100μl 的冰凉蒸馏水溶解井中的粉末。把盘子放在冰上。
16. 在设置为25°c 的水浴中解冻快速冷冻细胞裂解物。
17. 在每个样品中加入计算出的冷裂解缓冲液 (从步骤 2.11), 使蛋白质浓度正常化。
    注: 清洗电池后 (使用真空管吸入器) 后取出 pbs, 以避免导致裂解缓冲液成分的变化。将样品蛋白平衡到0.8 到2时的浓度, 以便准确比较 gtpase 活化检测中的样品。表 2提供了有关用于此检测的缓冲液的详细信息。
18. 将归一化的冷样品转移60μl 到微管中, 加入60μl 的结合缓冲液;将样品充分混合, 并将其保存在冰上。
19. 通过有力的闪烁, 完全去除微板上的水/溶液, 然后在实验室垫子上进行5到7个硬水龙头。
20. 在井中添加50μl 的归一化样本、空白控件和正对照。
21. 在4°c 时, 在300转/分的温度下, 将板材放在轨道振动台上30分钟。
    注: 晃动步骤非常重要, 建议在300转/分处使用轨道板振动台。
22. 在 rt 用200μl 的洗涤缓冲液清除盘子中的样品 2x, 每次洗完后都要用闪烁的方式大力取出井内的洗涤缓冲液, 然后敲击, 并将盘子放在 rt 的长凳上。
23. 在每口井中加入200μl 的 rt 抗原显示缓冲液, 并在 rt 孵育2分钟。
24. 从井中挤出溶液, 用 rt 上的200μl 洗涤缓冲液清洗3x 井。
25. 在每口井加入50μl 的新鲜制备的半250抗 rhoa 原代抗体。
26. 将板放在轨道振动台上 45分钟, 每分钟300转, 设定为25°c。从井里把溶液翻出来。
27. 重复清洗步骤 2x (步骤 2.24)。
28. 在每口井加入50μl 的新鲜制备的半250抗 rhoa 二级抗体。
29. 将板放在轨道振动台的顶部 45分钟, 每分钟300转, 设定为25°c。
30. 将等量的试剂 a 和试剂 b 混合制备 hrp 检测试剂。
31. 从每口井中挤出溶液, 用 rt 的200μl 洗涤缓冲液清洗3x 井。
32. 在每口井中加入50μl 新鲜制备的 hrp 检测试剂。
33. 在3-5分钟内读取发光信号, 以获得最大信号, 并使用适当的软件包分析结果。
    注: 读数必须在3-5分钟内进行, 才能获得最大信号。运行一个 "测试板", 以确认正确的裂解缓冲液体积被用于细胞裂解物, 使蛋白质浓度足够高, 以检测 r有望 gtptase 活性。(测试板是一种细胞板, 用于确定蛋白质浓度是否在可接受的范围内, 并确定所使用的裂解缓冲液的体积是否合适。如果在线性范围内, 正控制应改为比空白井高4至10倍。如果没有, 则通过咨询制造商来调整亮度计。表 3给出了发光计的设置。
34. 在标题为 "示例"、 "平均值"、 "标准偏差"、 "排斥1"、 "排斥2"、 "排斥3" 和"排斥"4 的列中输入原始数据, 以显示每个示例上所做的复制次数。
35. 在"平均值" 下, 输入公式= 平均值 (xn:yn) , 其中 x = rep1 的列指示符, y = repex4的列指示符, n = 正在处理的行的行指示符。
36. 在"标准偏差" 下, 输入公式= stdev (xn:yn) , 其中 x = rep1的列指示符, y = repr4 的列指示符, n = 正在处理的行的行的行指示符。
37. 将复制数据输入到回收1、 rep1等中.
38. 输入数据后, 使用单击和拖动方法选择 "示例"、 "平均值" 和"标准偏差"。
39. 然后, 在数据分析软件中, 选择图表制作功能, 该函数看起来像一个正方形, 里面有一个迷你条形图。
    注: 这将引入图表制作过程, 在该过程中, 可以根据输入的数据设计图表。
40. 选择柱形图, 并为输入值指定"均值数"。
    注:首先制作平均值的图表, 然后指定 y 轴误差线的"标准偏差" 列。为此, 请双击图形栏, 选择 y 轴错误选项卡, 单击 "自定义" 选项, 然后选择工作表中的区域以输入"标准偏差" 数据的位置。在创建所需的图表后, 可以看到需要比较的组之间的差异。

结果

膜分馏:

采用超离心法制备膜和细胞溶胶成分。如图 1所示, 上清液含有细胞质部分, 颗粒含有膜分数。在辛伐他汀免疫印迹法治疗后, 检测了从 u251 细胞中获得的红景天的丰度。用泛卡粘蛋白和 gapdh 分别测定了膜和细胞溶胶组分的纯度和负载控制。如图 2所示, 辛伐他汀?...

讨论

在这里, 我们描述了一个准确的方法来测量小 gtpase 前化和 gtp 结合显示为小 gtpase 亚细胞定位 (膜对细胞溶胶) 和 rho gtp 负载。小 gtpase 在真核细胞中表达, 在细胞增殖、运动和结构中起着至关重要的作用。前化和 gtp 结合都参与了 gtpase 活性的调节;因此, 评估这些蛋白质的前代化和 gtp 结合是细胞生物学家^1,8的重要工具。

根据?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high Glucose	VWR (Canada)	VWRL0101-0500
Fetal Bovine Serum	VWR (Canada)	CA45001-106
Penicillin/Streptomycin	VWR (Canada)	97062-806
EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid)	VWR (Canada)	CA71007-118
EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid)	VWR (Canada)	CAAAJ60767-AE
DTT (DL-Dithiothreitol)	VWR (Canada)	CA97061-340
Ammonium Persulfate	VWR (Canada)	CABDH9214-500G
Tris-Hydroxymethylaminomethane	VWR (Canada)	CA71009-186
30% Acrylamide/Bis Solution	Biorad (Canada)	1610158
TEMED	Biorad (Canada)	1610801
Protease Inhibitor cocktail	Sigma/Aldrich (Canada)	P8340-5ML	1:75 dilution
Rho-GTPase Antibody Sampler Kit	Cell Signaling (Canada)	9968	1:1000 dilution
Pan-Cadherin antibody	Cell Signaling (Canada)	4068	1:1000 dilution
GAPDH antibody	Santa Cruz Biotechnology (USA)	sc-69778	1:3000 dilution
RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format)	Cytoskeleton Inc. (USA)	BK121	Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016.
RhoA Antibody	Cell Signaling	2117
ECL	Amersham-Pharmacia Biotech	RPN2209
Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody	Sigma	A6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	1612071A	Spectrophotometer
Nonidet P-40	Sigma	11332473001	non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol
DMSO	Sigma	D8418-50ML
PBS	Sigma	P5493-1L
Phophatase Inhibitor cocktail	Sigma	P5726-5ML	1:75 Dilution