三维人体免疫细胞可视化的光片显微术

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以可视化的免疫细胞嵌入在三维 (3D) 胶原基质中使用光片显微镜。该协议还阐述了如何在3D 中跟踪单元迁移。该协议可用于3D 矩阵中其他类型的悬浮单元。

摘要

在体内, 免疫细胞的活化、增殖和功能都发生在三维 (3D) 环境中, 例如在淋巴结或组织中。迄今为止, 大多数体外系统依赖于二维 (2D) 表面, 如细胞培养板或盖玻片。为了最佳地模拟体外生理条件, 我们利用一个简单的3D 胶原基质。胶原蛋白是细胞外基质 (ECM) 的主要成分之一, 被广泛用于构成3D 矩阵。对于3D 成像, 最近开发的光片显微技术 (也称为单平面光照显微镜) 具有采集速度快、穿透深度大、漂白低、photocytotoxicity 等特点。此外, 光片显微镜对长期测量特别有利。在这里, 我们描述了一个优化的协议如何建立和处理人类免疫细胞,例如, 在3D 胶原基质中的主要人细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和自然杀伤细胞 (NK), 用于活细胞成像的光片显微镜和固定样本。给出了图像采集和细胞迁移分析的步骤。特别着重强调了取样准备和数据分析的关键步骤和因素。该协议可用于其他类型的悬浮细胞在3D 胶原基质和不限于免疫细胞。

引言

大多数关于迁移细胞的知识来自2D 实验^1,2,3, 通常是在玻璃或塑料表面进行的一种文化/成像皿。然而, 在大多数情况下, 生理场景需要3D 微环境, 其中胞外基质 (ECM) 起决定性作用。ECM 不仅提供了维持适当细胞形态所必需的3D 结构, 而且还为许多细胞^4、5的最佳功能提供了生存信号或方向性提示。因此, 需要一个3D 的环境来更好地识别细胞的功能和行为在一个更好地反映生理环境的环境中。

在人体内, 大多数细胞特别是免疫细胞, 在3D 的情况下发挥作用。例如, 活化 t 细胞巡视组织寻找靶细胞, 天真的 t 细胞通过淋巴结迁移, 寻找其同源抗原呈现细胞, 在此期间, 迁移模式和机械适应相应的胞外环境^3,6,7。3D 胶原凝胶已被广泛应用为一种成熟、特征良好的3D 细胞培养系统,^8、9、10。我们以前的研究表明, 主要的人类淋巴细胞是高度流动的, 以平均速度迁移, 在0.25% 的胶原基基质¹¹中, µm/分钟大约4.8。细胞骨架的重排在移植¹²中起关键作用。积累的证据表明, 淋巴细胞不应用只有单一的迁移模式, 但可以切换到特定的迁移行为, 取决于位置, 微环境, 细胞因子, 趋化梯度, 和细胞外信号, 调节迁移行为以不同的方式³。

为了可靠地分析免疫细胞的功能和行为, 例如, 迁移, 突起形成或水泡运输, 能够快速可靠地获取相对较大的3D 卷中的图像是很有好处的。对于3D 成像, 最近开发的光片显微技术 (也称为单平面照明显微镜) 提供了一个满意的解决方案^13,14。在成像采集过程中, 生成一个薄的静态光片来照亮样品。这样, 在焦点平面上, 可以同时照亮大面积而不影响离平面单元。此功能使高采集速度与大幅降低漂白和 photocytotoxicity。本文介绍了如何使用光片显微镜对人体免疫细胞进行可视化, 以及如何分析3D 场景中的迁移。

研究方案

为这项研究进行的研究与人的材料 (白细胞减少系统房间从人血液捐赠者) 由地方道德委员会授权 (声明从 16.4. 2015 (84/15;Rettig 博士教授)), 并遵循相应的指导方针。

1. 中性胶原蛋白溶液的制备 (500 µL)

1. 将400µL 冷冻胶原蛋白溶液 (10.4 毫克/毫升) 转移到细胞培养罩下的无菌1.5 毫升管。慢慢加入50µL 冷冻 10x PBS (pH 7.0-7.3) 到400µL 的冷冻胶原蛋白溶液。通过轻轻地平铺管子来混合溶液。
   注意: 1 部分的所有步骤都应该在细胞培养罩下完成。
2. 添加8µL 0.1 米氢氧化钠成500µL 胶原溶液从1.1。将 pH 值调整为 7.2-7.6。使用 ph 值测试条 (ph 范围: 6-10) 来确定混合物的酸碱度。
   注: 不同批次胶原蛋白的体积可能有所不同。氢氧化钠溶液必须缓慢混合以避免气泡。该混合物应保持在冰上, 以避免胶原凝胶。
3. 添加2µL 的无菌 ddH₂O 使最终体积为500µL. 拌匀, 并将此胶原蛋白溶液 (8.32 毫克/毫升) 储存在冰上或在4°c, 直到进一步使用。
   注: 在这种情况下, 中性胶原蛋白可用于24小时整除数不建议避免气泡。

2. 用毛细血管制备光片荧光显微镜样品

1. 荧光用所需的主要荧光染料¹⁵或荧光蛋白¹¹ , 如前所述, 将感兴趣的活细胞标记出来。
2. 将 1 x 10⁶的细胞移植到细胞培养罩下的无菌1.5 毫升管中。离心管在 200 x g 8 分钟, 在200µL 培养基中丢弃上清和并用重悬颗粒。
   注: 建议细胞密度为 5 x 10⁶细胞/毫升的可视化人类免疫细胞迁移, 特别是对细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和自然杀伤 (NK) 细胞。
3. 从1.3 中添加85.9 µL 的中性胶原溶液。入细胞悬浮从2.2。并适当混合以达到2.5 毫克/毫升的胶原蛋白浓度。把细胞/胶原蛋白混合在冰盖上。
   注: 假设所需的胶原蛋白浓度为 N 毫克/毫升, 中和的胶原蛋白溶液体积 (200 µL 细胞悬浮) = 200 x N/(8.32-n)
4. 接下来, 将匹配的柱塞放入毛细管 (内径 ~ 1 毫米), 直到柱塞是1毫米的毛细管。将柱塞浸入培养基中 (图 1A)。
   注意: 这一步可以帮助防止气泡时, 毛细血管被浸入细胞/胶原蛋白混合。毛细管和柱塞不必是无菌的。
5. 将毛细血管浸入细胞/胶原蛋白混合物中, 从2.3。慢慢拉回活塞 10-20 毫米 (图 1B)。用70% 乙醇喷雾湿润的纸巾擦拭毛细管的外壁, 除去剩下的胶原蛋白溶液。
6. 安装在5毫升管内壁上的粘土的毛细管, 并推动细胞/胶原蛋白混合到毛细管的边缘 (图 1C)。
7. 保持毛细管在37°c 与 5% CO₂ 1 h 为胶原聚合。
8. 将培养基 (大约 1-2 毫升) 添加到5毫升管中。仔细按聚合的胶原棒出到中等到约3/4 的胶原蛋白挂在培养基 (图 1D)。
9. 保持毛细血管, 像这样, 在37°c 与 5% CO₂为另30分钟平衡胶原棒与培养基。
   注: 之后, 胶原棒可以拉回毛细血管和进一步培养之前进一步使用。

3. 使用光片显微镜进行图像采集

1. 根据制造商的指示装配样品室。
2. 打开孵化和显微镜将样品室加热到37摄氏度 (仅用于活细胞成像)。
3. 将毛细管放在样品室中, 找到样品, 找到感兴趣的区域进行图像采集。
4. 激活相应的激光器。设置以下设置: 激光功率、曝光时间、z 堆栈的步长、z 堆栈的开始和结束位置以及活细胞成像的时间间隔。
   注: 例如,图 2中的样本每四十年代成像6小时, 37 摄氏度, 步长为1µm (总厚度: 538 µm)。激光功率为 1%, 曝光时间为30毫秒. x y 方向的像素大小为0.23 µm。
5. 开始图像采集。

4. 自动跟踪分析

1. 打开文件转换器, 单击 "添加文件" 以选择要转换为软件文件格式 (*. ims) 的图像文件。单击 "浏览" 并选择一个文件夹以保存转换后的文件。单击 "全部启动"。
2. 打开分析软件。单击 "超越"。转到 "文件", 然后单击 "打开", 然后选择要分析的图像文件。
   注意: 如果文件大小很大, 此步骤可能需要时间。对于单个实验, 建议不要使用大于 1 tb (tb) 的文件, 因为此类大型文件的计算能力要求很高。
3. 单击 "添加新点"。最后检查框过程整个图像。单击 "下一步"。
4. 输入 x 和 y (像素) 的坐标以定义感兴趣的区域。输入要分析的帧数 (时间和 z 位置)。单击 "下一步"。
5. 在源通道的下拉列表中, 选择包含要跟踪的对象的目标通道。输入估计的 xy 直径(µm)。单击 "下一步"。
   注意: 估计 xy 直径是要跟踪的对象的 x y 维度的平均直径。
6. 单击 "质量"。设置一个阈值, 其中大多数单元格 (对象) 应包括在内。单击 "下一步"。
7. 选择所需的算法 (推荐自回归运动)。输入最大距离 (建议使用20 µm ), 最大间隙大小 (建议为3或 2)。最后单击 "处理整个图像"。
   注意:最大距离和最大间隙大小是两个中断轨道的阈值。更具体地说, 在两个连续帧中, 当同一对象之间的距离超过最大距离时, 后面框架中的此对象将被视为新对象。有时在获取过程中, 同一对象可能会消失几个帧并再次出现。在这种情况下, 只有当此对象在最大间隙大小中重新出现时, 它才会被视为同一个对象。
8. 单击 "筛选器类型", 然后选择排除不想要的曲目的选项。
   注意: 此步骤是可选的。
9. 单击 "下一步", 然后单击 "完成"。
   注意: 根据计算性能的不同, 此步骤可能需要数小时的时间。
10. 单击 "编辑曲目" 并选择 "正确漂移"。选择适当的算法 (建议平移漂移)。选择所需的结果数据集大小(建议使用与当前大小相等的新大小)。单击"确定"。
    注意: 只有当胶原蛋白在图像采集过程中漂移时, 才需要这个步骤。
11. 单击 "统计信息", 然后选择 "配置可见统计值列表"。检查要导出的兴趣选项 (如坐标、速度等)。单击"确定"。
12. 单击 "将所有统计信息导出到文件" 并输入文件名。

5. 胶原蛋白基质中细胞的固定和免疫荧光染色

1. 将1000µL 4% 多聚甲醛 (在 PBS 中的粉煤灰) 转换成5毫升管在化学罩下。
   注: 粉煤灰应与室温保持平衡。
2. 用聚合胶原蛋白从2.9 中浸出毛细管。成粉煤灰溶液 (约5毫米), 并安装在5毫升管内壁上的毛细管与建模粘土 (如图 1C所示)。
3. 轻轻按压活塞, 直到一半的胶原棒挂在粉煤灰溶液中 (图 1D)。在室温下保持管20分钟。
4. 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。取出毛细管并丢弃粉煤灰。
5. 将毛细管装入新鲜的管子中, 加入1毫升的 PBS。请确保毛细血管浸入 PBS 中。
6. 轻轻按压活塞, 直到一半的胶原棒挂在溶液中。在内壁上装上毛细管以建模粘土。
7. 在室温下保持管5分钟。
8. 重复5.4。-5.7 又2次。
9. 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。丢弃 PBS。将 1-2 毫升的阻塞/通透缓冲器 (PBS + 1-% BSA + 0.1% 非离子表面活性剂) 转移到管内, 重复5.6。
   注: BSA (1%) 可替换为5% 血清的动物的第二 Ab 被提出。
10. 在室温下保持管 30-60 分钟。
11. 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。丢弃通透缓冲区。转移 200-500 µL 的主要抗体在阻塞/通透缓冲和驱逐杆到解决方案。
12. 在室温下保持管1小时。
13. 用 PBST (PBS + 0.1% 非离子表面活性剂) 清洗胶原棒3倍, 如5.4 所述。-5.8。
14. 在室温下, 在阻断/通透缓冲液中培养1小时的二级抗体棒。不要光。
15. 用 PBS 洗3次胶原棒, 如5.4 所述。-5.8。
16. 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。将样品保存在 PBS 中, 直到成像。
17. 扫描样品, 如3所述。

结果

T 细胞移出过程中的突起形成是一个高度动态的过程, 是肌动蛋白依赖。为了可视化第一人 ctl 的突起形成, 我们瞬时转染了 mEGFP 融合蛋白, 以标记在 CTL 的肌动蛋白细胞骨架, 如前所述¹¹。在转染后的某一天, 细胞被嵌入胶原基质中。图像栈是每四十年代获得的步骤大小1µm 在37°c 使用光片显微镜。如图 2A和辅助电影 1, 在?...

讨论

大多数的体外检测是在2D 表面进行的, 例如细胞培养板、培养皿或盖玻片, 而在体内细胞, 特别是免疫细胞中, 大多经历了3D 微环境。新出现的证据显示, 免疫细胞的迁移模式在2D 和3D 方案¹⁷之间有所不同。此外, 肿瘤细胞的表达谱也不同于2D 和 3 d 培养组织^18,19,20。因此, 为了更好地模拟体外?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, bovine collagen solution	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution	Merck	1091381000	for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose	Affymetrix	32821-10GM	Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation	Thermo Fisher	11132D	Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Thermo Fisher	C10045	Fluorescent cell label
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline	Thermo Fisher	14190250	IF
Bovine serum albumin	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)	Zeiss	N.A.
Cell culture hood	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrifuge 5418 and 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL tubes	Sarstedt	62.554.002
Capillaries 50 µL	VWR (Brand)	613-3373	Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries	VWR (Brand)	BRND701934	"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips	Merck	1095430001	to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes	BD	Z230723 ALDRICH	Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris file converter	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Analysis of 3D and 4D imaging data