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要約

ここでは、光シート顕微鏡を用いた三次元 (3 D) コラーゲン マトリックスに埋め込まれた免疫細胞を可視化するためのプロトコルを提案する.このプロトコルはまた、3 D の細胞の移動を追跡する方法を詳しく説明します。3 D マトリックスの懸濁細胞の他のタイプのこのプロトコルを用いることができます。

要約

生体内で、活性化、増殖、およびすべての免疫細胞の機能は、例えばリンパ節の組織の三次元 (3 D) 環境で発生します。最新では、ほとんどの生体外でシステムは細胞培養プレートか coverslips などの 2 次元 (2 D) 表面に依存します。生理学的な条件を最適な模倣の in vitro、単純な 3 D コラーゲン マトリックスを駆使します。コラーゲンは細胞外マトリックス (ECM) の主要なコンポーネントの 1 つと広く 3 D マトリックスを構成するために使用されています。3 D イメージングの (単一の平面照明顕微鏡とも呼ばれる) 最近開発された光シート顕微鏡技術は高い集録速度、大きな浸透深さ、低漂白、photocytotoxicity と紹介されています。さらに、光シート顕微鏡は長期計測のため特に有利です。ここで最適化されたプロトコルは、セットアップ、人間の免疫細胞、例えば主なひと細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) を処理する方法を記述してナチュラル キラー (NK) 細胞の生細胞イメージングのための光シート顕微鏡用 3 D コラーゲン マトリックス ・固定サンプル。細胞遊走の画像取得と解析の手順が掲載されています。特定焦点は、重要なステップと試料調製及びデータ解析のための要因を強調表示に与えられます。このプロトコルは、3 D コラーゲン マトリックスの懸濁細胞の他のタイプのために用いることができるし、免疫細胞に制限されていません。

概要

移行についてほとんど知識細胞に由来する 2 D 実験1,2,3、通常ガラスまたは文化/イメージングのプラスチック表面で実施された料理。しかし、生理学的なシナリオを必要とするほとんどのケースで 3 D 微小環境、細胞外マトリックス (ECM) が決定的な役割を果たしています。ECM は、適切な細胞の形態を維持するために 3 D 構造エッセンシャルを提供するだけでなく、生存信号または多く細胞4、5の最適な機能の方向性の手がかりを提供しています。したがって、3 D 環境が良い細胞機能および生理学的なコンテキストを反映してより良い環境での動作を識別するために必要です。

人間の体内では、ほとんど細胞免疫細胞特には 3 D シナリオの下でその機能を発揮します。たとえば、活性化 T 細胞は標的細胞を探して組織をパトロール、ナイーブ T 細胞はリンパ節の検索中に移行モードと機械に対応する細胞外適応している同種の抗原提示の細胞に移行環境3,6,7。3次元コラーゲンゲルは、よく確立され、よ特徴付けられた 3 D の細胞培養システム8,9,10として広く使用されています。我々 の以前の仕事は、一次ヒトリンパ高度なモバイルが 0.25% コラーゲン ベースの行列11約 4.8 μ m/分の平均速度で移行を示しています。細胞骨格の再編は、細胞移行12のキーの役割を果たしています。細胞外シグナルが曲とリンパ球のみのシングル モードの移行は適用されませんまだ場所、微小環境、サイトカイン、走化性の勾配に応じて特定の移行動作を切り替えることができますを示しています証拠を蓄積、別の方法3の回遊行動。

免疫細胞機能や動作、たとえば、移行、突出部形成または小胞輸送を確実に分析するには、高速かつ信頼性の高い方法で比較的大きな 3 D ボリューム内の画像を取得することができるため大きな利点です。3 D イメージングのため (1 つの平面照明顕微鏡とも呼ばれる) 最近開発された光シート顕微鏡技術は、満足のいく解決13,14を提供しています。買収、イメージング、中にサンプルを照らす照明板が薄く静的が生成されます。これで、焦点面大面積は、平面を細胞に影響を与えずに同時に照らされることができます。この機能により、大幅に削減漂白と photocytotoxicity 高速です。本稿では、光シート顕微鏡を用いたプライマリひと免疫細胞を可視化する方法と 3 D のシナリオで移行を分析する方法について説明します。

プロトコル

ひと由来の材料 (ヒトの血液ドナーからの白血球減少システム室) と本研究の遂行の研究が倫理委員会 (16.4.2015 (84/15; から宣言によって承認されて教授博士レッティグ Stürmer))、対応するガイドラインに従います。

1. 中和コラーゲン溶液の調製 (500 μ L)

  1. 細胞文化のフードの下で滅菌 1.5 mL チューブに冷やしたコラーゲン原液 (10.4 mg/mL) の 400 μ L を転送します。徐々 に 50 μ L の冷蔵チルド コラーゲン原液の 400 μ L に 10 x PBS (pH 7.0 7.3) を追加します。チューブにそっと並べてソリューションをミックスします。
    注: セル文化フードの下でパート 1 のすべてのステップを行ってください。
  2. 1.1 から 500 μ L のコラーゲン溶液に 0.1 M NaOH の 8 μ L を追加します。7.2 7.6 に pH を調整します。PH テスト ストリップを使用 (pH 範囲: 6-10) 混合物の pH 値を確認します。
    注: ボリュームは、コラーゲンの異なるバッチの異なる場合があります。NaOH 溶液が空気の泡を避けるためにゆっくりと混合します。混合物は、コラーゲンのゲル化を避けるために氷の上に保管すべき。
  3. 追加 2 μ L 滅菌 ddH2O 500 μ L に最終巻をするはよく混合し、さらに使用するまで氷の上または 4 ° C でこのコラーゲン溶液 (8.32 mg/mL) を格納します。
    注: この条件の下で中和されたコラーゲン使用できます 24 時間因数は空気の泡を避けるために推奨されません。

2. 毛細血管を使用して光シート蛍光顕微鏡用試料

  1. 蛍光前述目的主な蛍光染料15または蛍光タンパク質11で関心の生きているセルにラベルを付けます。
  2. 細胞文化のフードの下で滅菌 1.5 mL チューブに 1 × 106セルを転送します。200 x g で 8 分間破棄でチューブに上清を遠心し、培養液 200 μ L でペレットを再懸濁します。
    注: 特に細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) とナチュラル キラー (NK) 細胞のための人間の免疫細胞の移動の可視化のためには、5 × 106セル/mL の細胞密度の使用をお勧めします。
  3. 1.3 から中和されたコラーゲン溶液の 85.9 μ L を追加します。2.2 からセル中断。2.5 mg/mL のコラーゲン濃度に到達する適切にミックスします。ボンネットの氷にセル/コラーゲン ミックスを残します。
    注: N mg/mL、コラーゲンの必要な濃度と、仮定のボリューム中和 (200 μ L 細胞懸濁液) のコラーゲン溶液 200 × N =/(8.32-N)
  4. 次に、一致するプランジャーを毛細血管に入れ (内径 〜 1 mm) ピストンが毛細血管から 1 mm になるまで。培地 (図 1 a) に浸漬によってプランジャーを濡れています。
    注: この手順は、セル/コラーゲン ミックスにキャピラリーを浸したときに空気の泡を防ぐために助けることができます。キャピラリーとピストンが無菌であることはありません。
  5. 2.3 からセル/コラーゲン ミックスにキャピラリーを浸し。10 〜 20 ミリメートル (図 1 b) にプランジャーをゆっくり引き出します。残りのコラーゲン溶液を削除する 70% エタノール スプレーで湿らせたペーパー タオルで毛細血管の外側の壁を拭いてください。
  6. マウント 5 mL チューブの内壁に粘土のモデリング、毛管、キャピラリー (図 1) の端にセル/コラーゲン ミックスを押してください。
  7. 5% CO2コラーゲン重合の 1 h の 37 ° C で毛細血管を保ちます。
  8. 5 mL チューブに培 (約 1-2 mL) を追加します。(図 1) の中にぶら下がっているコラーゲンの約 3/4 媒体に、重合コラーゲン棒を慎重に押して。
  9. 5% CO2培地でコラーゲン ロッドを平衡に別の 30 分の 37 ° C で、このような毛細血管を保ちます。
    注: その後、コラーゲン棒引っ張ることができる毛管と培養にさらに使用する前にさらに。

3. 画像集録光シート顕微鏡を用いた

  1. アセンブリの製造元の指示に従って試料室。
  2. 孵化とサンプル室 (ライブセル イメージングのみ) の 37 ° C に加熱する顕微鏡を入れます。
  3. 試料室にキャピラリーを置きイメージ獲得のため関心のある分野を検索するサンプルを探します。
  4. 対応する laser(s) をアクティブにします。次の設定: レーザー パワー、露光時間、z スタック、および生きているセルイメージ投射の時間間隔の z スタック ・開始・終了位置のステップ サイズ。
    メモ: たとえば、図 2の例をイメージしましたすべての 40 s 1 μ m のステップ サイズの 37 ° C で 6 時間 (総厚: 538 μ m)。レーザー出力が 30 さん x、y 方向のピクセル サイズの露光時間で 1 %0.23 μ m。
  5. 画像の取り込みを開始します。

4. 自動追跡の分析

  1. ファイル コンバーターを開き、ソフトウェアのファイル形式 (*.ims) に変換する画像ファイルを選択して[ファイルの追加] をクリックします。参照をクリックし、変換後のファイルを保存するフォルダーを選択します。すべてを開始をクリックします。
  2. 解析ソフトウェアを開きます。凌駕をクリックします。ファイルに移動し、クリックしてオープン、分析対象とする画像ファイルを選択します。
    注: ファイルのサイズが大きい場合この手順は時間をかかることがあります。1 テラバイト (TB) を超えるファイルには推奨されません単一の実験プロセスとしてこのような大きなファイルは高い計算能力を要求します。
  3. 新しいスポットを追加クリックします。チェック ボックスを最終的に全体の画像を処理します。[次へ] をクリックします。
  4. X の座標を入力し、y (ピクセル) に関心の領域を定義します。(時間および z 位置) を分析するフレーム数を入力します。[次へ] をクリックします。
  5. ソース チャンネルのドロップ ダウン リストで追跡するオブジェクトが含まれるターゲット チャネルを選択します。(Μ m) で推定される xy の直径を入力します。[次へ] をクリックします。
    注: xy の推定直径は追跡するオブジェクトの x と y 次元の平均粒径です。
  6. [品質] をクリックします。細胞 (オブジェクト) が含まれているでする必要があります、しきい値を設定します。[次へ] をクリックします。
  7. 必要なアルゴリズム (自己回帰運動をお勧めします) を選択します。最大距離を入力 (20 μ mをお勧めします) と最大ギャップ サイズ (3 または 2 を推奨)。プロセス全体の最後に画像をクリックします。
    注:最大距離と最大ギャップ サイズは、トラックを分割する 2 つのしきい値です。具体的には、2 つの連続的なフレームで同じオブジェクト間の距離が最大距離を超えたらそれ以降のフレームでこのオブジェクトとみなされます新しいオブジェクト。買収の実行中に同じオブジェクト可能性がありますいくつかのフレームの消え、再び現れます。この場合、最大ギャップ サイズ内でこのオブジェクトが表示されるときにだけは、同じオブジェクトとしては考えられます。
  8. フィルターの種類をクリックし、不要なトラックを除外するオプションを選択します。
    注: この手順は省略できます。
  9. 次をクリックし、[完了] をクリックします。
    注: このステップ性能に応じて日まで時間がかかります。
  10. トラックの編集をクリックし、正しいドリフトを選択します。(並進ドリフトをお勧めします) 適切なアルゴリズムを選択します。結果のデータセットのサイズを選択 (現在のサイズに等しい新しいサイズが推奨)。[Ok]をクリックします。
    注: この手順はのみ画像集録中にコラーゲンが漂流したときに必要な。
  11. [統計情報] をクリックし、リスト表示されている統計値の構成を選択します。関心のオプション エクスポート (例えば座標、速度など) を確認します。[Ok]をクリックします。
  12. [すべての統計をファイルにエクスポート] をクリックし、ファイル名を入力します。

5. 固定と蛍光抗体法コラーゲンの細胞の染色

  1. 化学のフードの下で 5 mL チューブに 4% パラホルムアルデヒド (PFA、PBS で) の 1,000 μ L を転送します。
    注: PFA は、部屋の温度にバランスする必要があります。
  2. 2.9 から重合コラーゲンと毛細血管を浸しなさい。PFA のソリューションに (の ~ 5 mm) と (図 1で示すように)、粘土のモデリングと 5 mL チューブの内壁に毛細血管をマウントします。
  3. PFA ソリューション (図 1) にぶら下がっているコラーゲン ロッドの半分までプランジャーを軽く押します。20 分間室温でチューブを維持します。
  4. キャピラリー内コラーゲン ロッドを得るにプランジャーを引き戻します。毛細血管を取り出して、PFA を破棄します。
  5. 新鮮なチューブにキャピラリーをマウントし、1 mL の PBS を追加します。毛細血管が PBS に没頭していることを確認します。
  6. ソリューションにぶら下がっているコラーゲン ロッドの半分までプランジャーを軽く押します。粘土のモデリングと内壁に毛細血管をマウントします。
  7. 5 分間室温でチューブを維持します。
  8. 5.4 を繰り返します。-別の 2 回の 5.7。
  9. キャピラリー内コラーゲン ロッドを得るにプランジャーを引き戻します。PBS を破棄します。チューブに 1-2 mL のブロック/透過バッファー (PBS + 1 %bsa + 0.1% 非イオン性界面活性剤) を転送し、5.6 を繰り返します。
    注: セカンダリ Ab で育てられた動物の 5% 血清による BSA (1%) を置き換えることができます。
  10. 30-60 分間室温でチューブを維持します。
  11. キャピラリー内コラーゲン ロッドを得るにプランジャーを引き戻します。透過バッファーを破棄します。ブロック/透過バッファーの一次抗体の 200-500 μ L を転送し、ソリューションにロッドを追放。
  12. 1 時間室温でチューブを維持します。
  13. 5.4 で説明したように PBST (PBS + 0.1-% 非イオン性界面活性剤) で 3 回コラーゲン棒を洗ってください。-5.8。
  14. 室温で 1 時間ブロッキング/透過バッファーで二次抗体のロッドを孵化させなさい。光からそれを維持します。
  15. 5.4 で説明したように PBS で 3 回コラーゲン棒を洗ってください。-5.8。
  16. キャピラリー内コラーゲン ロッドを得るにプランジャーを引き戻します。イメージングまで PBS のサンプルを保ちます。
  17. 3 で説明したように、サンプルをスキャンします。

結果

T 細胞の移行中に突出部形成は、アクチン依存である非常にダイナミックなプロセスです。主なヒト CTL の突起形成を視覚化するには、一過性11の前に、の前述の CTL におけるアクチン細胞骨格のラベルに mEGFP 融合タンパク質を transfected しました。トランスフェクション後、1 日、細胞は、コラーゲン マトリックスに埋め込まれていた。画像のスタッ...

ディスカッション

ほとんどの in vitroアッセイは 2 D 画面で、たとえば細胞培養プレート、シャーレや coverslips、生体内で細胞、免疫細胞特に経験ほとんど 3次元微小環境に対し行われます。出現の証拠は、2 D と 3 D のシナリオ17で免疫細胞の移行パターンが異なることを示しています。さらに、腫瘍細胞の発現も 2 D と 3 D 培養組織18,19

開示事項

著者は金融または商業上の利害を宣言しません。

謝辞

研究所臨床 Hemostaseology と輸血ドナー血液を提供するために感謝します。カルメン Hässig と優秀な技術的なヘルプのコーラ Hoxha。LifeAct mEGFP 構造を生成するありがとう修正 pMAX ベクトルのイェンス レッティグ (ザールラント州大学)、ローランド Wedlich-日ソールドナー (ミュンスター大学) 元 LifeAct ルビー構築のため、キリスト教のユンカー (ザールラント州大学)。このプロジェクトは、Sonderforschungsbereich 1027 (プロジェクト A2 ベクレル) と 894 (プロジェクト A1 か) によって賄われていた。DFG によって資金が供給された光シート顕微鏡 (GZ: INST 256/4 19 1 FUGG)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol, bovine collagen solutionAdvanced Biomatrix #5133-20MLCollagen matrix
0.5 M NaOH SolutionMerck1091381000for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agaroseAffymetrix32821-10GMSample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells KitThermo Fisher11348DIsolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher11132DActivation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2Thermo FisherPHC0023Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kitLonzaV4XP-30XXTransfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Orange Plasma membrane StainThermo FisherC10045Fluorescent cell label
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered salineThermo Fisher14190250IF
Bovine serum albuminSigmaA9418-100GIF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbitThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)ZeissN.A.
Cell culture hoodThermo FisherHeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i Thermo FisherN.A.
Centrifuge 5418 and 5452EppendorfN.A.
PippettesEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tipsVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubesSarstedt 62.554.002
Capillaries 50 µLVWR (Brand)613-3373Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillariesVWR (Brand)BRND701934"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stipsMerck1095430001to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringesBDZ230723 ALDRICHAlternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Imaris file converterBitplaneavailable at http://www.bitplane.com Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplaneavailable at http://www.bitplane.com Analysis of 3D and 4D imaging data

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