Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les cellules immunitaires noyées dans une matrice tridimensionnelle (3D) collagène microscope à lumière-feuille. Ce protocole précise également comment suivre la migration cellulaire en 3D. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans la matrice 3D.

Résumé

In vivo, l’activation, la prolifération et la fonction des cellules immunitaires tous se produisent dans un environnement de tridimensionnel (3D), par exemple dans les ganglions lymphatiques ou des tissus. Jusqu'à date, la plupart des systèmes in vitro reposent sur une surface bidimensionnelle (2D), tels que plaques de culture cellulaire ou de lamelles. De façon optimale de reproduire les conditions physiologiques in vitro, nous utilisons une matrice de collagène 3D simple. Collagène est l’une des principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) et a été largement utilisé pour constituer des matrices 3D. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) est décrit avec acquisition haute vitesse, grande profondeur, faible de blanchiment et photocytotoxicité. En outre, microscopie à lumière-feuille est particulièrement avantageuse pour la mesure à long terme. Nous décrivons ici un protocole optimisé comment configurer et gérer les cellules immunitaires humaines, par exemple primaire humains lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK) dans la matrice de collagène 3D pour une utilisation avec la microscopie en lumière-feuille pour l’imagerie de cellules vivantes et échantillons fixes. La procédure d’acquisition d’images et analyse de la migration cellulaire sont présentés. Une attention particulière est donnée pour mettre en évidence les étapes critiques et des facteurs pour la préparation des échantillons et l’analyse des données. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans une matrice de collagène 3D et n’est pas limité aux cellules immunitaires.

Introduction

La plupart des connaissances sur la migration cellules vient de 2D expériences^1,2,3, qui sont normalement effectués dans un verre ou une surface en plastique d’une culture/imagerie plat. Toutefois, un scénario physiologique exige, dans la plupart des cas, un micro-environnement 3D, dans laquelle la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle décisif. ECM non seulement fournit l’essentiel de la structure 3D afin de maintenir la morphologie cellulaire appropriée, mais offre également des signaux de survie ou des indications directionnelles pour un fonctionnement optimal de nombreuses cellules^4,5 . Par conséquent, il faut un environnement 3D pour mieux identifier les fonctions cellulaires et le comportement dans un environnement reflétant mieux le contexte physiologique.

Dans le corps humain, la plupart des cellules en particulier les cellules immunitaires, exercent leurs fonctions selon un scénario 3D. Par exemple, les lymphocytes T activés patrouillent tissus recherchant des cellules cibles, cellules naïves T migrent dans les ganglions lymphatiques dans la recherche de leurs cellules présentatrices d’antigène apparentés au cours de laquelle le mode de migration et les machines sont adaptées aux correspondants extracellulaire environnement,^3,6,7. Le gel de collagène 3D a été largement utilisé comme une cellule 3D bien établies et bien caractérisé la culture système^8,9,10. Nos travaux antérieurs montre que les lymphocytes humains primaires sont très mobiles et migrent à une vitesse moyenne d’environ 4,8 µm/min dans une matrice à base de collagène de 0,25 %¹¹. Réarrangement du cytosquelette joue un rôle clé dans la migration de cellules¹². Accumulation de preuves montre que les lymphocytes ne s’appliquent pas seulement à un seul mode de migration mais peuvent passer d’un certain comportement de migration selon l’emplacement, cytokines, microenvironnement, gradient chimiotactique et des signaux extracellulaires qui tune le comportement migratoire dans différentes manières ³.

Pour analyser efficacement les fonctions des cellules immunitaires et comportement, par exemple, migration, formation de protrusion ou le transport vésiculaire, c’est un avantage pour être en mesure d’acquérir des images dans des quantités relativement importantes de 3D de manière rapide et fiable. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) offre une solution satisfaisante^13,14. Au cours de l’acquisition de l’imagerie, une mince feuille de lumière statique est générée pour éclairer l’échantillon. De cette façon, sur le plan focal, une grande surface peut être illuminée simultanément sans affecter les cellules hors plan. Cette fonctionnalité permet une vitesse d’acquisition élevée avec un blanchiment drastiquement réduite et la photocytotoxicité. Dans cet article, nous décrivons comment visualiser des cellules immunitaires humaines primaires microscope à lumière-feuille et comment analyser la migration dans un scénario de 3D.

Protocole

Les recherches menées pour la présente étude avec le matériel humain (chambres de système réduction leucocytaire de donneurs de sang humain) sont autorisé par le Comité d’éthique local (déclaration de 16.4.2015 (84/15 ; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) et suit les directives correspondantes.

1. préparation de la Solution de collagène neutralisée (500 µL)

1. Transférer 400 µL de la solution mère de collagène réfrigérés (10,4 mg/mL) dans un tube stérile de 1,5 mL sous le capot de la culture cellulaire. Lentement, ajouter 50 µL de réfrigérée 10 x PBS (pH de 7,0 à 7,3) à 400 µL de solution mère de collagène réfrigérés. Mélanger la solution de carrelage doucement le tube.
   Remarque : Toutes les étapes dans la partie 1 doivent se faire sous une hotte de culture cellulaire.
2. Ajouter 8 µL de NaOH 0,1 M en 500 µL de la solution de collagène de 1,1. pour ajuster le pH à 7,2 et 7,6. Utilisez les bandelettes de test pH (gamme de pH : 6-10) pour déterminer la valeur pH du mélange.
   Remarque : Les Volumes peuvent varier pour les différents lots de collagène. Solution de NaOH doit être mélangé lentement pour éviter les bulles d’air. Le mélange doit être maintenu sur la glace pour éviter la formation de collagène.
3. Ajouter 2 µL de ddH stérile₂O pour transformer le volume final à 500 µL. bien mélanger et conserver cette solution de collagène (8,32 mg/mL) sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
   Remarque : Dans ces conditions, neutralisé collagène peut être utilisé pendant 24 h. parties aliquotes ne sont pas recommandés pour éviter les bulles d’air.

2. préparation pour la microscopie de Fluorescence lumière-feuille à l’aide de capillaires

1. Fluorescent étiqueter les cellules vivantes d’intérêt avec les colorants fluorescents primaire désiré¹⁵ ou protéines fluorescentes¹¹ comme décrit plus haut.
2. Transférer 1 × 10⁶ cellules dans un tube stérile de 1,5 mL sous une hotte de culture cellulaire. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 8 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 200 µL de milieu de culture.
   Remarque : La densité cellulaire de 5 × 10⁶ cellules/mL est recommandée pour la visualisation de la migration des cellules immunitaires humaines, surtout pour les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK).
3. Ajouter 85,9 µL de solution neutralisée collagène de 1,3. dans la suspension cellulaire de 2,2. et mélanger correctement pour atteindre une concentration de collagène de 2,5 mg/mL. Laisser le mélange cellulaire/collagène sur glace dans la hotte.
   Remarque : Supposons que la concentration désirée du collagène est N mg/mL, a neutralisé le volume de solution de collagène (pour 200 µL de la suspension cellulaire) = 200 × N /(8.32-N)
4. Ensuite, mettre le piston correspondant dans le capillaire (diamètre intérieur ~ 1 mm) jusqu'à ce que le piston soit 1 mm sur le tube capillaire. Mouiller le piston en plongeant dans le milieu de culture (Figure 1 a).
   Remarque : Cette étape permettrait d’éviter les bulles d’air lorsque le capillaire est plongé dans le mélange de cellule/collagène. Le capillaire et le piston n’ont pas à être stérile.
5. Plonger le tube capillaire dans le mélange de cellule/collagène de 2,3. Tirez lentement sur le piston arrière pour 10-20 mm (Figure 1 b). Essuyer la paroi extérieure du capillaire avec un essuie-tout humidifié avec un spray d’éthanol 70 % pour supprimer la solution restante de collagène.
6. Monter le tube capillaire avec le modelage d’argile sur la paroi d’un tube de 5 mL et placer le mélange de cellule/collagène sur le bord du capillaire (Figure 1).
7. Gardez le tube capillaire à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 1 h pour la polymérisation de collagène.
8. Ajouter le milieu de culture (environ 1 à 2 mL) dans un tube de 5 mL. Soigneusement, appuyer sur le piston de collagène polymérisé out dans le milieu à environ 3/4 du collagène suspendus dans le milieu (Figure 1).
9. Gardez le capillaire, comme ça, à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 30 min à équilibrer la tige de collagène avec le milieu.
   Remarque : Par la suite, la tige de collagène peut être tiré vers l’arrière dans le capillaire et d’élevage supplémentaire avant d’utiliser.

3. image Acquisition microscope à lumière-feuille

1. Assemblée de la chambre de mesure selon les instructions du fabricant.
2. Allumez l’incubation et le microscope pour chauffer la chambre de mesure à 37 ° C (pour l’imagerie de cellules vivantes seulement).
3. Placer le tube capillaire dans le compartiment de mesure et de localiser l’échantillon pour trouver la zone d’intérêt pour l’acquisition d’images.
4. Activer la laser(s) correspondante. Définissez les paramètres suivants : laser puissance, durée d’exposition, étape-taille de position z-pile, de début et de fin de z-pile et l’intervalle de temps pour l’imagerie de cellules vivantes.
   Remarque : par exemple, l’exemple à la Figure 2 a été photographié chaque 40 s pendant 6 h à 37 ° C, avec une taille de palier 1 µm (épaisseur totale : 538 µm). La puissance du laser était de 1 % avec un temps de pose de 30 m la taille en pixels à l’axe x-y est 0,23 µm.
5. Démarrer l’acquisition de l’image.

4. automatisée d’analyse de suivi

1. Ouvrir le convertisseur de fichier, cliquez sur Ajouter des fichiers pour choisir l’ou les fichiers d’imagerie à convertir dans le format de fichier du logiciel (*.ims). Cliquez sur Parcourir et sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer les fichiers convertis. Cliquez sur Démarrer Tous.
2. Ouvrez le logiciel d’analyse. Cliquez sur le surpasser. Allez dans fichier et cliquez sur ouvrir, puis choisissez le fichier image à analyser.
   Remarque : Si la taille du fichier est grande cette étape peut prendre de temps. Fichiers de plus de 1 téraoctet (to) ne sont pas recommandés pour une expérience unique dans le processus de ces gros fichiers sont hautement calcul capacité exigeant.
3. Cliquez sur ajouter de nouveaux Spots. Cochez la case Processus toute Image enfin. Cliquez sur suivant.
4. Entrez les coordonnées x et y (en pixels) pour définir la zone d’intérêt. Entrez le nombre d’images (temps et z-position) à analyser. Cliquez sur suivant.
5. Sélectionnez la chaîne cible, qui contient les objets à être l’objet d’un suivi, dans la liste déroulante du Canal Source. Renseignez estimée xy diamètre (µm). Cliquez sur suivant.
   Remarque : Diamètre estimé xy est le diamètre moyen dans la dimension x-y d’objets à suivre.
6. Cliquez sur qualité. Définir un seuil, dans lequel la plupart des cellules (objets) devraient être incluse. Cliquez sur suivant.
7. Choisir l’algorithme souhaité (Autoregressive Motion est recommandé). Entrez la distance max (il est recommandé de20 µm ) et la taille de l’écart maximum (3 ou 2 est recommandée). Cliquez sur le processus entier d’images enfin.
   Remarque : Distance Max et Max écart taille sont deux seuils pour briser les titres. Plus précisément, dans les deux cadres continus lorsque la distance entre le même objet dépasse la distance Max, cet objet dans le cadre plus tard est considéré comme un nouvel objet. Parfois lors de l’acquisition, le même objet peut disparaître pour quelques images et apparaître à nouveau. Dans ce cas, seulement lors cet objet réapparaît au sein de la taille d’écart Max, elle est considérée comme l’objet même.
8. Cliquez sur le Type de filtre , choisissez l’option d’exclure des pistes non désirés.
   Remarque : Cette étape est facultative.
9. Cliquez sur suivant et puis cliquez sur Terminer.
   Remarque : Cette étape peut prendre des heures à jours en fonction des performances de calcul.
10. Cliquez sur Modifier les titres et choisissez Dérive Correct. Sélectionnez l’algorithme approprié (Drift translationnelle est recommandé). Sélectionnez le Résultat Dataset taille (Taille nouveau égal à la taille actuelle est recommandé). Cliquez sur OK.
    Remarque : Cette étape n’est nécessaire quand le collagène dérivé lors de l’acquisition de l’image.
11. Cliquez sur statistiques et choisissez Configurer liste de statistiques valeurs visibles. Vérifiez les options d’intérêt à être exporté (p. ex., coordonnées, vitesse et ainsi de suite). Cliquez sur OK.
12. Cliquez sur Exporter toutes les statistiques de fichier et entrez le nom du fichier.

5. fixation et Immunofluorescence souillant des cellules dans des Matrices de collagène

1. Transférer 1 000 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA, dans du PBS) dans un tube de 5 mL sous une hotte chimique.
   Remarque : IFP doit être équilibré à température ambiante.
2. Plonger le tube capillaire avec collagène polymérisée de 2,9. dans la solution de la PFA (pour ~ 5 mm) et monter le capillaire sur la paroi interne du tube 5 mL avec le modelage d’argile (comme illustré à la Figure 1).
3. Appuyez doucement sur le piston jusqu'à ce que la moitié de la tige de collagène est suspendu dans la solution de la PFA (Figure 1). Maintenir le tube à température ambiante pendant 20 min.
4. Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Sortez le capillaire et jeter la PFA.
5. Monter le capillaire dans un nouveau tube et ajouter 1 mL de PBS. Assurez-vous que le tube capillaire est plongé dans du PBS.
6. Appuyez doucement sur le piston jusqu'à ce que la moitié de la tige de collagène est suspendu dans la solution. Monter le capillaire sur la paroi intérieure avec le modelage d’argile.
7. Maintenir le tube à température ambiante pendant 5 min.
8. 5.4 le répète. -5.7 pour un autre 2 fois.
9. Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Jeter les PBS. Transférer 1 à 2 mL de tampon de blocage/perméabilisation (1-% de BSA, PBS + surfactant non ionique de 0,1 %) dans le tube et répétez 5,6.
   Remarque : La BSA (1 %) peut être remplacée par 5 % de sérum de l’animal dans que l’Ab secondaire a été soulevée.
10. Maintenir le tube à température ambiante pendant 30-60 min.
11. Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Jeter le tampon perméabilisation. 200-500 µL de l’anticorps primaire dans un tampon bloquant/perméabilisation de transfert et expulse la tige dans la solution.
12. Maintenir le tube à température ambiante pendant 1 h.
13. Lavez la tige de collagène 3 fois avec PBST (PBS + surfactant non ionique - 0,1 %), comme décrit au point 5.4. -5,8.
14. Incuber la tige dans l’anticorps secondaire dans un tampon bloquant/perméabilisation pendant 1 h à température ambiante. Garder de la lumière.
15. Lavez la tige de collagène 3 fois avec du PBS comme décrit au point 5.4. -5,8.
16. Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Conserver les échantillons dans du PBS jusqu’en imagerie.
17. Analyser les échantillons comme décrit dans 3.

Résultats

Formation de saillie au cours de la migration des cellules T est un processus très dynamique, qui est dépendante de l’actine. Pour visualiser la formation de saillie de CTL humain primaire, nous transfectées transitoirement une protéine mEGFP fusionné pour étiqueter le cytosquelette d’actine en CTL comme décrit avant¹¹. Un jour après la transfection, les cellules ont été incorporés dans la matrice de collagène. Piles d’images ont été acquises ch...

Discussion

La plupart des essais in vitro sont réalisées sur une surface 2D, par exemple dans les plaques de culture cellulaire, Pétri ou à lamelles, considérant que l’expérience in vivo des cellules, en particulier les cellules immunitaires, pour la plupart un micro-environnement 3D. Des preuves nouvelles montre que les patrons de migration des cellules immunitaires diffèrent entre 2D et 3D de scénarios¹⁷. En outre, les profils d’expression des cellules tumorales sont égalemen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, bovine collagen solution	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution	Merck	1091381000	for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose	Affymetrix	32821-10GM	Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit	Thermo Fisher	11348D	Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation	Thermo Fisher	11132D	Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2	Thermo Fisher	PHC0023	Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Thermo Fisher	C10045	Fluorescent cell label
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline	Thermo Fisher	14190250	IF
Bovine serum albumin	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)	Zeiss	N.A.
Cell culture hood	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrifuge 5418 and 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 mL tubes	Sarstedt	62.554.002
Capillaries 50 µL	VWR (Brand)	613-3373	Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries	VWR (Brand)	BRND701934	"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips	Merck	1095430001	to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes	BD	Z230723 ALDRICH	Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Imaris file converter	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	available at http://www.bitplane.com	Analysis of 3D and 4D imaging data