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摘要

双链 DNA 断裂的修复是一个动态过程, 不仅需要在断裂时形成修复配合物, 而且要解决病变后的解决方法。在这里, 我们使用免疫荧光显微镜的短暂和长期的双滞留断裂作为一个工具来解剖这个基因组维持机制。

摘要

在 DNA 中修复双链断裂 (DSBs) 是一个高度协调的过程, 它有必要形成和解决多蛋白修复复合体。这一过程是由无数的蛋白质, 促进蛋白质的联想和解除这些病变。在很大程度上, 由于能够执行一个巨大的蛋白质库功能屏幕, 有一个更大的赞赏的基因, 双链 DNA 断裂修复。经常敲除或化学抑制剂屏幕识别参与修复过程中的蛋白质, 使用增加的毒性作为一个标记的蛋白质, 这是需要的争端处理修复。功能分析虽然对于确定涉及维持基因组保真度的新的细胞蛋白很有用, 但需要确定感兴趣的蛋白质是否促进修复复合体的定位、形成或解决。

通过免疫荧光显微镜可以很容易地检测到修复蛋白的积累。因此, 这些蛋白在 dna 损伤部位的联想和解除可以通过在诱导双链 DNA 断裂后观察这些核病灶来获得。这种方法还可以识别错误本地化的修复因子蛋白, 如果修复缺陷不同时发生, 修复不完全延迟。在这种情况下, 长时间的双链 DNA 断裂可以通过表达一个罕见的切割限制性 (例如, I-SceI) 在细胞中, 该酶的识别站点已经集成到细胞基因组中来设计。由于忠实的修复将重新引入酶的识别部位, 引发另一轮的分裂, 因此导致的病变特别难以解决。因此, 消除了修复动力学的差异。如果未形成修复配合物, 则会阻碍局部化。本协议描述了确定修复动力学的变化以及修复蛋白质定位所需的方法。

引言

每天, 人体内的每一个细胞都被轰炸, 估计有1万的 DNA 病变1。这种存在的威胁使我们面临突变、肿瘤以及细胞死亡的风险。为了保护基因组的保真度, 哺乳动物细胞进化成了一系列复杂的蛋白质联想和修饰对 DNA 损伤的反应。这种反应被组织成多个途径, 统称为 DNA 损伤反应 (DDR)2,3。复员方案包括 dna 修复蛋白在 dna 损伤的积累, 在世俗和空间上协调。DDR 经常诱发细胞周期骤停, 以避免在复制受损 DNA2、4、5时可能发生的损伤传播或强化。反过来, 细胞活力也必须在修复完成后关闭解除修复复合体的细胞周期停止。

在各种类型的 DNA 损伤中, DSBs 是最有害的。未能修复 DSBs 可能导致染色体重排或大规模删除, 如失去整个染色体武器。DSBs 的修复分为两个路径6,7,8。同源重组 (HR) 要求姐妹染色体作为 DNA 模板使用, 因而被限制在细胞周期9,10的晚 S 和 G2/M 阶段。非同源端连接 (NHEJ) 没有这些限制, 但在修复 DSBs11、12时可能会导致小的删除。

特别报告人修复和复员方案一般是积极的调查领域。尽管被组织成很方便的分离通路, 却有大量的冗余。事实上, 许多蛋白质 (例如 BRCA1、BRCA2 和 RPA 复合体) 都涉及多个路径13、14、15、16。一条通路修复病变, 可导致损伤中间体, 必须由另一通路14修复。这些途径交织在一起, 结合他们的复杂任务, 将正确的蛋白质在正确的地方适当地为必要的时间, 需要一个多层次的管理过程。

最近的一份报告强调了复员方案错综复杂的情况, 表明修复复杂的形成、解决和定位可以分别被削弱17。下面的协议的总目标是彻底解剖细胞修复争端的能力。利用免疫荧光显微镜, 在 DSBs 诱导后的代表性时间点可以可视化损伤部位的修复蛋白积累。

这种技术对常用的方法有几个优点。通常, 在单个时间点进行修复, 不能代表修复配合物的装配和离解的动态过程。从初始激活到完全分辨率, 观察整个修复范围, 可确保延迟修复不认错为完全抑制。相反, 它保证了无法停用的修复响应的诱导, 不认错为正常或过度激活。

然而, 延迟蛋白复合物的形成和修复蛋白的错误定位可能与这种方法没有明确的区别。为了确定修复蛋白在定位时是否与延迟有关, 可以通过酶解细胞 DNA 来引入 "长效" 的分裂分子。所产生的病变是裁每次修复时, 导致一个明显的大核修复重点和消除时间限制, 从招聘。这可以通过修改现有的方法, 使用罕见的切割限制性 (如SceI) 来诱导一个长期的争端解决办法来实现。DSBs 的寿命使免疫荧光显微镜能直观地显示出难以捉摸的修复蛋白。增强的丰度还可以改善可视化, 当检测受到限制的抗体质量, 这一特点, 可能是有用的, 当较小的研究蛋白质被认为对 DNA 修复的影响。

值得注意的是, 我们提供了一个自由图像处理和分析软件 (如ImageJ) 的明确指令。这就消除了图像分析中的一个主要的金融障碍, 打开了对更广泛的受众进行 DNA 损伤修复的审问。

研究方案

请注意, 本协议是为包含 SceI 识别站点18的 U2OS 单元格编写的。细胞不需要 U2OS, 但必须包含 SceI 的网站。根据所使用的细胞类型, 可能需要对该协议进行调整 (例如, 种子细胞数和潜伏期)。

1. 定义争端修复复杂地层的动力学

  1. 在10厘米的组织培养板上生长 U20S-DRGFP 细胞, 直到85–90% 汇合。
  2. 去除培养基, 在室温下 (RT) 在3毫升 EDTA 中孵育2分钟。
  3. 用1毫升的胰蛋白酶取代 EDTA, 在37摄氏度孵育5分钟. 确保细胞与平板表面分离, 通过显微镜观察。中和胰蛋白酶与5毫升 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM) 补充10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素/链霉素。
  4. 用 hemocytometer 和台盼蓝排除法确定悬浮液中细胞的浓度。
  5. 种子 6 x 103细胞/井在200µL 的玻璃底部96井板。另外, 种子 4 x 106细胞在8毫升在12毫米盖玻片放置在 10 cm 板材。
    注意: 每个井或盖玻片表示单个时间点, 包括控件。
  6. 在37摄氏度和 5% CO2的夜间生长细胞。
  7. 诱导 DSBs
    1. 将介质从96井 plate/10 cm 盘中更换为 h2O2稀释至浓度为25µM 与 DMEM + 10% 血清和孵育37摄氏度 1 H。
    2. 用 1x PBS 清洗细胞 3x, 并用新鲜的 DMEM 补充10% 血清和1% 青霉素/链霉素。孵化细胞在37°c 为 0, 1, 4, 8, 24, 和 48 h. 确保每项试验都使用 h2O2的新鲜稀释。
      注意: 为了避免在这里使用的 H2O2浓度的细胞中杀死癌细胞, 要确保损伤的剂量足够低, 这样大的细胞就能避免细胞凋亡和衰老。观察恢复过程是至关重要的。这是最好的实现通过测量灵敏度的范围内的剂量。进行 MTT 试验或其他细胞活性测定, 以确定可以使用的过氧化氢的最小浓度。
  8. 固定和 permeabilizing 细胞
    1. 用 1x PBS 冲洗细胞3次。从10厘米的板上取下一个盖玻片, 并将其放在24井板的一个井中固定。使用针和镊子小心地去除盖玻片和避免刮伤细胞从盖玻片表面。
    2. 在 1 h2O2曝光和新鲜 DMEM 替换 (0、1、4、8、24和 48 h) 后的指定时间, 用4% 多聚甲醛 (煤灰) 孵化15分钟的细胞。
    3. 用 PBS 清洗固定盖玻片3次。Permeabilize 在 1x PBS 中稀释了0.5% 非离子洗涤剂的细胞。孵育15分钟在 RT, 前洗涤3x 与 PBS。
      注: 通透后, 盖玻片的贮存在 PBS 中可能在4摄氏度, 至少一周。
  9. 修复复杂可视化
    1. 阻止96井板/盖玻片在溶液中3% 牛血清白蛋白 (bsa) 和0.1% 非离子洗涤剂稀释在 1x PBS (3% BSA 溶液) 为 1 h 在 RT。
    2. 孵化与主要抗体靶的修复蛋白的利益, 稀释根据制造商的规格在 3% BSA 解决方案为1小时的 RT, 前清洗3倍, 1x PBS。
    3. 在 3% BSA 溶液中, 根据制造商的协议, 孵育96井板/盖玻片和二级抗体稀释。确认二次显影没有重叠的激发或发射谱。
    4. 在洗涤细胞与 PBS 3 次添加 DAPI, 根据制造商的规格稀释 1x PBS 和孵化在 RT 5 分钟。
    5. 将盖玻片安装在幻灯片上, 并放置一个安装代理, 确保单元格端面朝下。仔细按盖玻片, 用擦拭剂浸泡任何多余的安装代理。
    6. 用快干透明指甲油密封盖玻片, 并确保盖玻片与滑轨完全密封。
    7. 通过聚焦在 DAPI 通道上的共焦显微镜图像, 在其他通道 (有兴趣的 DNA 修复基因的信号), 以避免引入偏见的实验。
    8. 或者, 图像可以获得通过采取 Z 部分的期望区域和冷凝图像到一个单一的平面, 以可视化所有可检测的病灶。
      注: 如果在选定的时间点未观察到争端解决方案或感兴趣的蛋白质, 则在最初选择广泛的时间点 (0–48 h 后的 DSBs) 时确定何时解决问题。兴趣的时间点会因其诱导的方法和兴趣的修复蛋白而异。
  10. 使用自由 ImageJ 软件来定义免疫荧光显微图像中的细胞核。
    注: 要打开显微镜图像, 必须在 ImageJ 中安装生物格式插件。
    1. 通过将图像文件拖到 ImageJ 窗口中, 或者从 ImageJ 的 "插件" 工具栏中选择 "生物格式导入程序", 打开共焦图像 (. czi 或. tif)。
      注意: 将出现 "生物格式导入选项" 窗口。
    2. 选择 "分割通道", 将图像拆分为 "生物格式导入选项" 窗口中的本构 DAPI 和荧光图像。
    3. 从下拉菜单中选择 "颜色选项" 中的 "彩色"。选择 "确定" 以将 DAPI 和组蛋白 H2AX (H2AX) 图像作为单独的窗口打开, 然后选择 DAPI 图像。
    4. 选择 "图像" 工具栏和 "调整阈值" 选项以选择原子核。
      注意: 将出现一个 "阈值" 窗口。
    5. 通过将 "阈值" 窗口的底部条完全向右滑动来调整图像阈值。调整顶部条形图, 直到原子核以不同的轮廓显示为完全红色, 背景为黑色。请勿选择 "应用"。关闭 "调整阈值" 窗口。
    6. 选择 "分析" 工具栏和 "分析粒子" 选项。请参阅屏幕上出现的 "分析粒子" 窗口。
    7. 输入原子核的最小大小。
      注: 低于所输入尺寸的粒子将不会算作原子核。
    8. 从 "显示" 下拉菜单中, 选择 "轮廓"。选择 "添加到管理器" 选项。单击 "确定" 打开 "ROI 管理器" 窗口。
      注意: 原子核的轮廓将出现在一个单独的窗口中。
    9. 为可以从 "ROI 管理器" 窗口中选择的原子核分配编号。
  11. 使用 ImageJ 量化免疫荧光显微图像 H2AX 病灶。
    1. 选择 "H2AX" 灶窗口 (染色荧光共轭二次抗体)。然后, 选择 "进程" 工具栏, 选择 "查找最大值" 以找到原子核内的焦点。
      注意: "查找最大值" 窗口将打开。
    2. 从 "输出类型" 下拉菜单中选择 "单点" 选项, 然后选择 "预览点选择" 以可视化最大值/焦点。根据图像的荧光强度输入 "噪声耐受" 值 (图 1)。检查带有小黑点的白色窗口的外观。
      注意: 这些点表示已检测到的 H2AX 焦点/极大值。对于正在分析的所有图像, 必须保持常量的噪声容差值。低/高噪声耐受将描绘在原子核内的太多/很少的极大值 (病灶), 并不会准确地表示核内的病灶。
    3. 从 "ROI 管理器" 窗口中选择 H2AX 焦点必须量化的原子核。通过检查 "全部显示" 选项选择所有原子核。
    4. 选择 "度量值" 以测量选定原子核中最大值/焦点的个数。
      注意: 最大值/焦点的数目显示为255的倍数,即, 一个最高的 "RawIntDen" (集成密度) 读数为255。
    5. 复制 "RawIntDen" 值并将其粘贴到软件中进行数据分析。

2. 对长期双链 DNA 断裂的定位分析

  1. 96-井板/盖玻片上的种子细胞, 如1.1 和1.2 节所述。
  2. 双链 DNA 断裂诱导的研究
    1. 染细胞与 I-SceI 表达载体使用脂质为基础的转染试剂根据制造商的规格。在转染后等待 24–72, 以最大化限制性表达式。确定转染是否成功, 通过定位一个奇异的大核γ H2AX 焦点细胞。
  3. 获取图像
    1. 修复, permeabilize, 块, 并清洗96井板/盖玻片, 如第1.8 节所述。
    2. 联合孵化细胞与抗体抗γ H2AX 和修复蛋白的兴趣 (这里, 使用的主要抗体对 RAD51) 稀释根据制造商的规格, 在 3% BSA 解决方案。
    3. 用 1x PBS 清洗96井板/盖玻片3次。在 3% BSA 溶液中, 根据制造商的协议, 孵育96井板/盖玻片和二级抗体稀释。确认二次显影没有重叠的激发或发射谱。
    4. 识别具有大核γ H2AX 焦点的细胞。只拍这些细胞的照片, 以避免偏见。
  4. 长效 I. SceI 诱发病灶的分析
    1. 通过计算有大γ H2AX 灶的细胞数量和感兴趣的修复蛋白的共同局部病灶, 手动分析持久灶。

结果

图 1描述了使用 ImageJ 对最大值/焦点量化的正确噪声判别的选择。DAPI 的合并图像和感兴趣的修复蛋白在左面板上。图 1A显示了90的噪声判别, 并标记了正确的焦点数目。在定量过程中不计算边缘上的原子核 (用粉红色箭头描绘) 和原子核外的病灶 (用黄色箭头描绘)。图 1B描述了低噪音公差50。在原子核外和?...

讨论

dna 损伤修复的一般分析和双链 DNA 断裂的修复具体来说是一个活跃的研究领域, 因为它的后果跨越肿瘤发生到基本生物学6,20。本手稿详述了一种方法, 准确地剖析了 RAD51 和γ H2AX 蛋白对 DSBs 通过 HR 的分辨率的贡献. 展望未来, 此方法可用于阐明修复蛋白在 DSBs14中的附加功能。修复动力学的比较和对 SceI 诱导的 DSBs 与细胞之间的控制细胞...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢乔尔 Sanneman 和 Philine 博士 Wangemann 的共焦显微镜核心, 由堪萨斯州立大学兽医学院资助, 他们支持的努力开发这种技术。pCBASceI 是玛丽亚 Jasin (Addgene 质粒号 26477) 30 的礼物。U2OS DR-GFP 细胞是玛丽亚 Jasin18的一种礼物。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm CoverslipsVWR89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA)ThermoFisher Scientific28908
24-well plateVWR82050-892
96-well glass bottom plateCellvisP96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488EMD Millipore05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10) Cell Signaling Technology8875S
Bio-formats plugin for ImageJNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR97061-416
DAPIThermoFisher ScientificD1306
DMEM, High GlucoseThermoFisher Scientific12100046
EDTAInvitrogen15576-028
Fetal Bovine Serum (FBS)VWR89510-194
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594ThermoFisher Scientific A-11012 
Hydrogen Peroxidesigma-Aldrich216763-100ML
ImageJ SoftwareNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI Expression VectorAddgene26477
Nail Polish- Insta DriSally and HansenClearly Quick (103)
Phosphate Buffered Saline (PBS)Bio BasicPD8117
ProLong Gold Antifade ReagentLife TechnologiesP36930
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049-500ML
TurboFect Transfection ReagentThermoFisher ScientificR0531
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

参考文献

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