Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Resumen

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Resumen

La reparación de roturas de doble hebra (distritales) en el ADN es un proceso altamente coordinado, que requiere la formación y resolución de los complejos de multi-proteínas reparación. Este proceso está regulado por una gran variedad de proteínas que promueven la asociación y disociación de las proteínas a estas lesiones. Gracias en gran parte a la capacidad para realizar pantallas funcionales de una vasta biblioteca de proteínas, hay una mayor apreciación de los genes necesarios para la reparación de rotura de ADN de doble cadena. Pantallas a menudo geneticamente o químico inhibidor identifican las proteínas implicadas en procesos de reparación mediante aumento de la toxicidad como un marcador para una proteína que se requiere para la reparación DSB. Aunque útil para identificables nuevas proteínas celulares involucradas en mantener la fidelidad del genoma, análisis funcional requiere la determinación de si la proteína de interés promueve la localización, formación o resolución de los complejos de reparación.

La acumulación de proteínas de reparación puede ser fácilmente detectada como distintos focos nucleares por microscopia de la inmunofluorescencia. Por lo tanto, asociación y disociación de estas proteínas en los sitios de daño del ADN pueden accederse mediante la observación de estos focos nucleares representante a intervalos después de la inducción de roturas del DNA de doble cadena. Este enfoque también puede identificar proteínas de factor de reparación mal localizada, si reparar los defectos no ocurren simultáneamente con incompletos retrasos en la reparación. En este escenario, roturas de DNA de doble cadena larga duración pueden diseñarse expresando una endonucleasa de corte raro (p. ej., SceI) en las células donde el sitio de reconocimiento para la enzima dijo se ha integrado en el genoma celular. La lesión resultante es particularmente difícil de resolver como reparación fiel será reintroducir sitio de reconocimiento de la enzima, lo que provocó otra ronda de escote. Como resultado, se eliminan las diferencias en la cinética de reparación. Si no se forman complejos de reparación, localización ha sido impedida. Este protocolo describe la metodología necesaria para identificar cambios en la cinética de reparación así como localización de la proteína de reparación.

Introducción

Cada día, cada célula en el cuerpo humano es bombardeado con un estimado 10.000 lesiones de ADN¹. Esta amenaza existencial nos pone en riesgo de mutaciones, oncogénesis, así como la célula muerte. Para proteger la fidelidad de genoma, células de mamíferos han evolucionado para responder a daños en el ADN con una compleja serie de asociaciones de proteínas y modificaciones. Esta respuesta está organizada en múltiples vías, conocidas colectivamente como la DNA daños respuesta (DDR)^2,3. El DDR consiste en la acumulación de proteínas de reparación del ADN en las lesiones del ADN, coordinadas tanto temporal como espacialmente. DDR con frecuencia induce arresto del ciclo celular para evitar la propagación o la intensificación de los daños que pueden ocurrir durante la replicación del ADN dañado^2,de^4,5. A su vez, también es necesario para la viabilidad celular desactivar la detención del ciclo celular por desvincularlo complejos de reparación después de concluida la reparación.

Entre los distintos tipos de daños en el ADN, distritales son los más perjudiciales. Distritales de reparación, pueden fallar los cambios del cromosoma o eliminaciones a gran escala tales como la pérdida de los brazos del cromosoma entero. La reparación de los distritales se divide en dos vías^6,7,8. Recombinación homóloga (HR) requiere una hermana cromosoma para utilizar como una plantilla de ADN y por lo tanto se limita a últimas fases S y G2/M del ciclo celular^9,10. No homólogos se terminan uniendo (NHEJ) no tiene estas restricciones, pero puede causar pequeñas canceladuras al reparar distritales^11,12.

Reparación de DSB específicamente y el DDR en general son áreas activas de investigación. A pesar de ser organizados en vías convenientemente separadas, hay una gran cantidad de redundancia. De hecho, muchas proteínas (BRCA1, BRCA2 y el EPR complejo por ejemplo) están implicadas en múltiples vías^13,14,15,16. La reparación de una lesión por una vía, puede llevar a un daño intermedio que debe ser reparado por otro camino¹⁴. El entrelazamiento de estas vías, combinadas con su compleja tarea de reclutar las proteínas adecuadas para el lugar correcto para la cantidad exacta de tiempo necesario, requiere de un proceso regulador multi-con gradas.

Un informe reciente destaca las complejidades de DDR demostrando la formación de complejos de reparación, la resolución y localización de cada uno por separado que pueden deteriorada¹⁷. El objetivo general del siguiente protocolo es diseccionar definitivamente la capacidad de las células para reparación de DSB. Usando microscopia de la inmunofluorescencia, acumulación de proteínas de reparación en los sitios de daño puede ser visualizada en los puntos de tiempo representativo después de la inducción de los consejos escolares distritales.

Esta técnica tiene varias ventajas a los enfoques utilizados. Con frecuencia, es investigado en momentos solo e incapaz de representar el proceso dinámico de ensamblaje y disociación de complejos de reparación. Observar la gama completa de la reparación de la activación inicial de la resolución asegura que un retraso en la reparación no es identificado erróneamente como inhibición completa. Por el contrario, asegura que la inducción de una respuesta de reparación que no es capaz de inactivar dicha respuesta no identificado erróneamente como la normal o la activación excesiva.

Formación de complejos proteína retrasada y la localización errónea de proteínas de reparación, sin embargo, no se puedan claramente distinguir con este enfoque. Para determinar si las proteínas de reparación mal localizadas versus demora en su localización, se puede introducir un OSD de "larga duración" a través de la hendidura enzimática del ADN celular. La lesión resultante se corte de nuevo cada vez que se repara, resultando en un enfoque distinto reparación nuclear grande y eliminar la restricción temporal de contratación. Esto puede lograrse mediante la modificación de lo existente con el uso de una endonucleasa de corte raro (p. ej., SceI) para inducir un DSB de larga duración. La longevidad de los consejos escolares distritales permite la visualización de las proteínas de difícil reparación por microscopia de la inmunofluorescencia. La mayor abundancia también podría mejorar la visualización cuando la detección se ve obstaculizada por la limitación en la calidad de anticuerpos, una característica que puede ser útil cuando menos proteínas estudiadas se identifican como teniendo un impacto en la reparación del ADN.

En particular, ofrecemos instrucciones explícitas de una imagen libre procesamiento y análisis de software (por ejemplo, ImageJ). Esto elimina una barrera financiera importante en análisis de imagen, apertura de la interrogación de la reparación del daño de ADN a un público más amplio.

Protocolo

Nota: el presente Protocolo es escrito para U2OS celdas que contengan un-SceI reconocimiento sitio¹⁸. Las células no necesitan ser U2OS pero deben contener el sitio SceI. El protocolo puede necesitar ser ajustado (p. ej., número de células sembradas y tiempos de incubación) dependiendo del tipo de células utilizadas.

1. definir la cinética de formación de complejos de reparación DSB

1. Cultivar células de U20S-DRGFP en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm hasta 85-90% confluente.
2. Retire los medios de comunicación e incubar a temperatura ambiente (RT) en 3 mL de EDTA por 2 min.
3. Vuelva a colocar EDTA con 1 mL de tripsina e incubar a 37 ° C durante 5 minutos, asegúrese de que las células son separadas de la superficie de la placa por visualización al microscopio. Neutralizar la tripsina con 5 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina.
4. Determinar la concentración de células en la suspensión usando un hemocitómetro y el método de exclusión azul de tripano.
5. 6 x 10³ células/pozo en 200 μL de una placa de 96 pocillos de fondo de cristal de la semilla. Por otra parte, semilla 4 x 10⁶ células en 8 mL de 12 mm cubreobjetos colocan en una placa de 10 cm.
   Nota: Cada bien o cubreobjetos representa un momento único, incluyendo el control.
6. Crecen las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO₂.
7. Inducción de distritales
   1. Sustituir los medios de comunicación de la fuente de placa de 96 pocillos, 10 cm H₂O₂ diluida a una concentración de 25 μm con DMEM + 10% FBS e incubar a 37 ° C durante 1 h.
   2. Lavar las células 3 x 1 x PBS y reemplazar con DMEM fresco suplementados con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina. Incube las células a 37 ° C durante 0, 1, 4, 8, 24 y 48 h. Asegúrese que las diluciones frescas de H₂O₂ se utilizan para cada experimento.
      Nota: Para evitar matar a las células de la concentración de H₂O₂ usado aquí, asegúrese de que la dosis de daños es baja bastante que la mayor parte de las células será evitar la apoptosis y la senescencia. Es fundamental para observar el proceso de recuperación. Esto se logra mejor mediante la medición de sensibilidad a una gama de dosis. Realizar un ensayo MTT u otro ensayo de viabilidad celular para determinar la concentración mínima de peróxido de hidrógeno que se puede utilizar.
8. Fijación y permeabilizing células
   1. Lavar las células 3 veces con PBS 1 x. Retirar un cubreobjetos de la placa de 10 cm para cada momento y lugar en un único pozo de una placa de 24 pocillos para la fijación. Utilice la aguja y pinzas para extraer cuidadosamente el cubreobjetos y evitar rayar las células de la superficie del cubreobjetos.
   2. Fijar las células por incubar durante 15 min con paraformaldehído al 4% (PFA) en señalan momentos después de 1 h de H₂O₂ exposición y recambio de DMEM fresco (0, 1, 4, 8, 24 y 48 h).
   3. Lavar los cubreobjetos fija 3 veces con PBS. Permeabilizar las células con detergente no iónico 0,5% diluido en 1 x PBS. Incubar por 15 min a temperatura ambiente, antes de lavar 3 veces con PBS.
      Nota: Después de permeabilización, almacenamiento de cubreobjetos es posible en PBS a 4 ° C durante por lo menos una semana.
9. Reparación compleja visualización
   1. Bloque de la placa de 96 pocillos/cubreobjetos en una solución de 3% albúmina de suero bovino (BSA) y detergente no iónico 0.1% diluido en PBS 1 x (solución de BSA 3%) durante 1 h a TA.
   2. Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a la proteína de reparación del interés, diluido según las especificaciones del fabricante en una solución de BSA 3% durante 1 h a temperatura ambiente, antes de lavar 3 veces con PBS 1 x.
   3. Incubar la placa de 96 pocillos/cubreobjetos con anticuerpo secundario diluido según protocolo del fabricante de la solución de BSA 3%. Confirman que los fluoróforos secundarias no tienen excitación superpuesta o espectros de emisión.
   4. Después de lavar las células con PBS 3 veces añadir DAPI, diluido según las especificaciones del fabricante de 1 x PBS e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   5. Coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos con una gota de agente de montaje, asegurándose de que las caras laterales de la celda hacia abajo. Presione con cuidado el cubreobjetos y empaparse de cualquier agente de montaje exceso con una toallita.
   6. Selle el cubreobjetos con esmalte transparente de secado rápido y asegurar un sellado completo del cubreobjetos con la diapositiva.
   7. Tomar las imágenes de microscopio confocal, centrándose en el canal DAPI, antes de otros canales (con señales de gene de la reparación del ADN de interés) para evitar la introducción de sesgos en el experimento.
   8. Alternativamente, se pueden adquirir imágenes Z-secciones de la región deseada y la imagen de condensación en un solo plano para visualizar todos los focos detectables.
      Nota: Si la resolución del OSD o la proteína de interés no se observa en los puntos de tiempo elegidos, determinar cuándo distritales resolución seleccionando inicialmente una amplia gama de puntos de tiempo (0-48 h post inducción OSD). Los puntos de tiempo de interés variará según el método de inducción de OSD y la proteína de reparación del interés.
10. Uso libre de software ImageJ para definir los núcleos de las imágenes de microscopía de inmunofluorescencia.
    Nota: Para abrir imágenes de microscopio, debe instalarse el plugin de Bio-formatos en ImageJ.
    1. Abra las imágenes confocales (.czi o .tif) arrastrando el archivo de imagen en la ventana de ImageJ, o seleccionando "Bio-formatos importador" de la barra "Plugin" en ImageJ.
       Nota: Aparecerá la ventana de "Opciones de importación de Bio-formatos".
    2. Seleccione "Dividir canales" para dividir la imagen en DAPI constitutiva e imágenes fluorescentes dentro de la ventana de "Opciones de importación de Bio-formatos".
    3. Seleccione "Colorized" en "Opciones de Color" en el menú desplegable. Seleccione "OK" para abrir la DAPI e histona H2AX (H2AX) imágenes como separar de windows y escoge la imagen DAPI.
    4. Selecciona la barra de herramientas "Imagen" y "Umbral de ajuste" para seleccionar los núcleos.
       Nota: Aparecerá una ventana de "Umbral".
    5. Ajustar el umbral de la imagen deslizando la barra inferior de la ventana de "Umbral" completamente a la derecha. Ajuste la barra superior hasta que los núcleos aparecen completamente rojos con distintos esquemas y el negro de fondo. NO seleccione aplicar. Cierre la ventana "Ajustar umbral".
    6. Selecciona la barra de herramientas de "Analizar" y "Analizar partículas". Ver una ventana de "Analizar las partículas" que aparecen en la pantalla.
    7. De entrada el tamaño mínimo de un núcleo.
       Nota: Las partículas por debajo del tamaño introducido no contará como núcleos.
    8. En el menú desplegable de "Mostrar", seleccione "Contornos". Seleccione la opción "Agregar al administrador". Haga clic en "Aceptar" para abrir una ventana de "Administrador de ROI".
       Nota: Esquemas de núcleos aparecerá en una ventana independiente.
    9. Asignar a números a los núcleos que pueden seleccionarse desde la ventana de "Administrador de ROI".
11. Utilizar ImageJ para cuantificar H2AX focos en imágenes de microscopia de la inmunofluorescencia.
    1. Seleccione la ventana de focos "H2AX" (teñida con fluorescente conjugado anticuerpo secundario). Luego, seleccione la barra de herramientas de "Proceso" y elegir "Buscar Maxima" para encontrar los focos dentro de los núcleos.
       Nota: Se abrirá una ventana de "Buscar la Maxima".
    2. Elige la opción "Solo puntos" en el menú desplegable de "Tipo de salida" y seleccionar "Selección de puntos de vista previa" para visualizar los maxima/focos. De entrada un valor de "Tolerancia de ruido" dependiendo de la intensidad de la fluorescencia de la imagen (figura 1). Compruebe el aspecto de una ventana blanca con puntos negros pequeños.
       Nota: Estos puntos representan la focos/maxima H2AX que han sido detectada. El valor de tolerancia de ruido debe mantenerse constante para todas las imágenes analizadas. Una tolerancia baja/ruido representan también muchos/pocos maxima (focos) dentro del núcleo y no será una representación exacta de los focos dentro del núcleo.
    3. Seleccionar los núcleos para que H2AX focos se deben cuantificar para desde la ventana de "Administrador de ROI". Seleccione todos los núcleos marcando la opción "Mostrar todos".
    4. Seleccione "Medida" para medir el número de máximos/focos dentro de los núcleos seleccionados.
       Nota: El número de focos de maxima aparece como múltiplos de 255, es decir, un máximo tiene una lectura de "RawIntDen" (densidad integrado) de 255.
    5. Copiar los valores de "RawIntDen" y pegarlos en software para análisis de datos.

2. Análisis de localización a una rotura de ADN de doble cadena de larga duración

1. Células de semilla en 96 pocillos platos/cubreobjetos como se describe en las secciones 1.1 y 1.2.
2. Inducción de roturas del DNA de doble cadena
   1. Transfectar las células con el vector de expresión-SceI utilizando un reactivo de transfección basada en lípidos según las especificaciones del fabricante. Espere 24-72 h después de transfección para maximizar la expresión de la endonucleasa. Determinar si la transfección tuvo éxito localizando las células con un enfoque singular gran nuclear γ-H2AX.
3. Adquisición de imágenes
   1. Fijar, permeabilizar, bloquear y lave la placa de 96 pocillos/cubreobjetos, como se describe en la sección 1.8.
   2. Co incubar las células con un anticuerpo contra γ-H2AX y la proteína de reparación del interés (aquí, un anticuerpo primario contra RAD51 fue utilizado) diluido según las especificaciones del fabricante en la solución de BSA 3%.
   3. Lave la placa de 96 pocillos/cubreobjetos 3 veces con PBS 1 x. Incubar la placa de 96 pocillos/cubreobjetos con anticuerpo secundario diluido según protocolo del fabricante de la solución de BSA 3%. Confirman que los fluoróforos secundarias no tienen excitación superpuesta o espectros de emisión.
   4. Identificar las células que tienen un foco grande γ-H2AX nuclear. Sólo tomar fotografías de estas células para evitar el sesgo.
4. Análisis de larga duración-SceI inducida focos
   1. Analizar los focos de larga duración manualmente, contando el número de células que tienen los focos grandes de γ-H2AX y co localizados focos de la proteína de reparación del interés.

Resultados

La figura 1 muestra la selección de la discriminación de ruido correcto para la cuantificación de maxima/focos con ImageJ. Las imágenes combinadas de DAPI y la proteína de reparación del interés están en el panel izquierdo. Figura 1A muestra una discriminación de ruido de 90 y marca el número correcto de focos. Los núcleos en el borde (representado con una flecha de color rosa) y focos fuera de los núcleos (representa...

Discusión

El análisis de ADN reparación de daños en general y la reparación de roturas del DNA de doble hebra es específicamente un área activa de investigación porque sus consecuencias abarcan tumorigenesis biología básica^6,20. Datos de este manuscrito un enfoque que disecciona con precisión la contribución de proteínas RAD51 y H2AX γ a la resolución de los consejos escolares distritales a través de horas esperando, este método puede utilizarse para aclara...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm Coverslips	VWR	89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908
24-well plate	VWR	82050-892
96-well glass bottom plate	Cellvis	P96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488	EMD Millipore	05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10)	Cell Signaling Technology	8875S
Bio-formats plugin for ImageJ	National Institute of Health (NIH)		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306
DMEM, High Glucose	ThermoFisher Scientific	12100046
EDTA	Invitrogen	15576-028
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	89510-194
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Hydrogen Peroxide	sigma-Aldrich	216763-100ML
ImageJ Software	National Institute of Health (NIH)		https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI Expression Vector	Addgene	26477
Nail Polish- Insta Dri	Sally and Hansen	Clearly Quick (103)
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio Basic	PD8117
ProLong Gold Antifade Reagent	Life Technologies	P36930
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
TurboFect Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	R0531
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500