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Resumo

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Resumo

O reparo de quebras de dupla-hélice (DSBs) no DNA é um processo altamente coordenado, exigindo a formação e a resolução de complexos de proteína multi reparo. Este processo é regulado por uma miríade de proteínas que promovem a associação e dissociação de proteínas para essas lesões. Graças, em grande parte para a capacidade de executar telas funcionais de uma vasta biblioteca de proteínas, há uma maior valorização dos genes necessários para a reparação de ruptura do DNA dobro-costa. Telas de inibidor frequentemente nocaute ou química identificam proteínas envolvidas em processos de reparação usando toxicidade aumentada como um marcador para uma proteína que é necessária para o reparo de ORL. Embora úteis para identificar novas proteínas celulares envolvidas na manutenção da fidelidade do genoma, análise funcional exige a determinação de se a proteína de interesse promove a resolução de complexos de reparação, formação ou localização.

O acúmulo de proteínas de reparo pode ser prontamente detectado como distintos focos nucleares pela microscopia de imunofluorescência. Assim, a associação e dissociação destas proteínas nos locais de dano do ADN podem ser acessados por observando estes focos nucleares em intervalos representativos após a indução de quebras de DNA dobro-costa. Esta abordagem também pode identificar proteínas fator de reparação mal localizadas, se a reparação de defeitos não ocorrer simultaneamente com incompletos atrasos na reparação. Neste cenário, quebras de DNA dobro-Costa duradouro podem ser projetadas por expressando uma endonuclease corte raros (por exemplo, eu-SceI) nas células onde o site de reconhecimento para a referida enzima foi integrado no genoma celular. A lesão resultante é particularmente difícil de resolver como fiel reparação irá reintroduzir o sítio de reconhecimento da enzima, solicitando mais uma rodada de clivagem. Como resultado, as diferenças na cinética de reparação são eliminadas. Se não são formados complexos de reparação, localização tem sido impedida. Este protocolo descreve a metodologia necessária para identificar alterações na cinética de reparação, bem como a localização da proteína de reparo.

Introdução

Cada dia, cada célula no corpo humano é bombardeada com um número estimado de 10.000 DNA lesões1. Esta ameaça existencial coloca-nos em risco de mutações, mixomas, bem como a célula morte. Para proteger a fidelidade do genoma, células de mamíferos evoluíram para responder ao dano do ADN com uma complexa série de associações de proteína e modificações. Esta resposta é organizada em várias vias, conhecidas coletivamente como o DNA danos resposta (DDR)2,3. A DDR consiste em acúmulo de proteínas de reparo do DNA em lesões do ADN, coordenadas tanto temporal e espacialmente. DDR frequentemente induz a detenção do ciclo celular para evitar a propagação ou a intensificação de danos que podem ocorrer durante a replicação do DNA danificado2,4,5. Por sua vez, também é necessário para a viabilidade celular desligar a detenção do ciclo celular desassociando complexos de reparação após o reparo foi concluído.

Entre os vários tipos de dano do ADN, DSBs são os mais deletérios. Reparar DSBs pode resultar em rearranjos cromossômicos ou exclusões em grande escala, como a perda dos braços do cromossoma inteiro. A reparação de DSBs é dividida em duas vias6,7,8. Recombinação homóloga (HR) requer uma irmã cromossomo para usar como um modelo de DNA e, portanto, é limitado a fases tardias, S e G2/M do ciclo celular9,10. Non-homologous final juntando (NHEJ) não tem essas restrições, mas pode causar pequenas exclusões ao reparar DSBs11,12.

DSB reparar especificamente e o DDR em geral são ativas áreas de investigação. Apesar de ser organizados em percursos convenientemente separados, há uma grande quantidade de redundância. Com efeito, muitas proteínas (BRCA1, BRCA2 e o RPA complexo por exemplo) estão envolvidas em vários caminhos13,14,15,16. O reparo de uma lesão por uma via, pode levar a um dano intermediário que deve ser reparado por um outro caminho14. O entrelaçamento destas vias, combinadas com sua complexa tarefa de recrutar as proteínas certa para o local correto para a quantidade exacta de tempo necessário, requer um processo de regulamentação de várias camadas.

Um recente relatório destaca os meandros das DDR demonstrando que reparação complexante, resolução e localização podem cada um separadamente ser prejudicada17. O objectivo geral do seguinte protocolo é definitivamente dissecar a capacidade das células para reparar o ORL. Usando microscopia de imunofluorescência, acúmulo de proteínas de reparo aos sítios de dano pode ser visualizado nos pontos de tempo representativo após a indução de DSBs.

Esta técnica tem várias vantagens para abordagens comumente usadas. Frequentemente, reparação é investigado em pontos de tempo único e incapaz de representar o dinâmico processo de montagem e dissociação dos complexos de reparação. Observando a gama completa de reparação de ativação inicial para a completa resolução garante que um atraso na reparação não é incorrectamente identificado como inibição completa. Por outro lado, assegura que a indução de uma resposta de reparação que é incapaz de inativar resposta disse não é incorrectamente identificada como o normal ou a ativação excessiva.

Formação do complexo proteína retardada e a mis localização das proteínas de reparo, no entanto, podem não ser inequivocamente distinguidos com esta abordagem. Para determinar se as proteínas de reparo são mis localizadas contra um atraso em sua localização, um "long-lasting" ORL pode ser introduzido através de clivagem enzimática do DNA celular. A lesão resultante é recut cada vez que está consertado, resultando em um foco distinto grande reparação nuclear e removendo a restrição temporal do recrutamento. Isto pode ser conseguido modificando a abordagem existente com o uso de uma endonuclease de corte raro (por exemplo, eu-SceI) para induzir um ORL de longa duração. A longevidade de DSBs permite a visualização de proteínas de reparo indescritível pela microscopia de imunofluorescência. A maior abundância também poderia melhorar a visualização quando deteção é prejudicada pela limitação da qualidade do anticorpo, um recurso que pode ser útil quando menor proteínas estudadas são identificadas como tendo um impacto na reparação do DNA.

Notavelmente, nós fornecemos instruções explícitas para um software livre imagem processamento e análise (por exemplo, ImageJ). Isso remove a maior barreira financeira na análise de imagem, abrindo o interrogatório de reparação de danos de DNA para um público mais vasto.

Protocolo

Note-se, este protocolo escrito para U2OS células contendo um eu-SceI reconhecimento local18. As células não precisam ser U2OS, mas devem conter o site eu-SceI. O protocolo pode precisar ser ajustada (por exemplo, número de células semeadas e tempos de incubação) dependendo do tipo de células utilizadas.

1. definir a cinética de ORL reparação complexante

  1. Desenvolvem-se células de U20S-DRGFP em uma placa de cultura de tecido de 10cm até 85-90% confluentes.
  2. Remova a mídia e incubar à temperatura ambiente (RT) em 3 mL de EDTA por 2 min.
  3. Substituir o EDTA com 1 mL de tripsina e incubar a 37 ° C por 5 min. Certifique-se de que as células são desanexadas da superfície da chapa por visualização sob um microscópio. Neutralize a tripsina com 5 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
  4. Determine a concentração de células em suspensão usando um hemocytometer e o método de exclusão azul trypan.
  5. Sementes de 6 x 103 células/poço em 200 µ l de uma placa de 96 poços de fundo de vidro. Como alternativa, células de semente 4 x 106 em 8 mL em lamelas de 12mm colocado em uma placa de 10 cm.
    Nota: Cada bem ou lamela representa um ponto único de tempo, incluindo o controle.
  6. Crescem as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
  7. Indução de DSBs
    1. Substitua os meios de comunicação do prato placa de 96 poços/10 cm H2O2 diluído a uma concentração de 25 µM com DMEM + 10% FBS e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
    2. Lave as células 3 x com 1X PBS e substituir com DMEM fresco suplementados com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina. Incube as celulas em 37 ° C para 0, 1, 4, 8, 24 e 48 h. Certifique-se de que o frescas diluições de H2O2 são utilizadas para cada experimento.
      Nota: Para evitar matar células a concentração de2 H2O usado aqui, certifique-se que a dose de danos é baixa bastante de modo que a maior parte das células vai evitar a apoptose e senescência. É fundamental observar o processo de recuperação. Isto é melhor conseguido através da medição da sensibilidade a uma gama de doses. Realize um ensaio de MTT ou outro ensaio da viabilidade celular para determinar a concentração mínima de peróxido de hidrogênio que pode ser usado.
  8. Fixação e permeabilizing células
    1. Lave as células 3 vezes com PBS 1x. Remova a placa de 10 cm para cada ponto de tempo uma lamela e colocá-lo em um único poço de uma placa de 24 para fixação. Use a agulha e a pinça para retirar cuidadosamente a lamela e evitar coçar as células da superfície da lamela.
    2. Fix as células incubando por 15 min com paraformaldeído 4% (PFA) no designado vezes após 1 h de exposição de2 H2O e substituição de DMEM fresca (0, 1, 4, 8, 24 e 48 h).
    3. Lave as lamínulas fixas 3 vezes com PBS. Permeabilize as células com 0,5% de detergente não-iônico diluído em 1X PBS. Incube durante 15 min em RT, antes de lavar 3x com PBS.
      Nota: Após a permeabilização, armazenamento de lamelas é possível em PBS a 4 ° C pelo menos uma semana.
  9. Visualização complexa de reparação
    1. Bloquear as placa de 96 poços/lamelas em uma solução de 3% albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de detergente não-iônico diluído em PBS 1x (solução de 3% BSA) por 1h no RT
    2. Incube com os anticorpos primários que visam a reparação de proteína de interesse, diluída de acordo com as especificações do fabricante em solução de BSA 3% para 1 h no RT, antes de lavar 3 vezes com PBS 1x.
    3. Incube as placa de 96 poços/lamelas com anticorpo secundário diluído de acordo com o protocolo do fabricante em solução de BSA de 3%. Confirme que o fluorophores secundários não têm sobreposição de excitação ou espectros de emissão.
    4. Depois de lavar as células com PBS 3 vezes adicionar DAPI, diluída de acordo com as especificações do fabricante em 1X PBS e incubam a RT por 5 min.
    5. Monte as lamelas em slides com uma gota de agente de montagem, certificando-se as faces laterais de célula para baixo. Pressione as lamelas com atenção e absorva qualquer agente de montagem em excesso com uma limpeza.
    6. Selar as lamelas com esmalte secagem rápida transparente e garantir uma vedação completa da lamela com o slide.
    7. Com as imagens do microscópio confocal, centrando-se no canal de DAPI, antes de outros canais (com sinais de gene de reparo do DNA de interesse) para evitar a introdução de viés para o experimento.
    8. Alternativamente, imagens podem ser adquiridas por tomar Z-seções da região desejada e condensando a imagem em um único plano para Visualizar todos os focos detectáveis.
      Nota: Se não for observada resolução DSB ou proteína de interesse em pontos de tempo escolhidos, determinar quando DSBs resolver selecionando uma ampla gama de pontos de tempo inicialmente (0 – 48 h após a indução de ORL). Pontos de interesse de tempo irão variar pelo método de indução de ORL e a reparo de proteína do interesse.
  10. Use software livre ImageJ para definir os núcleos nas imagens de microscopia de imunofluorescência.
    Nota: Para abrir imagens de microscópio, o Bio-formatos plug-in deve ser instalado no ImageJ.
    1. Abra as imagens confocal (.czi ou. tif), arrastando o arquivo de imagem para a janela do ImageJ, ou selecionando "Bio-formatos importador" na barra de ferramentas "Plugin" no ImageJ.
      Nota: A janela de "Bio-formatos opção de importação" irá aparecer.
    2. Selecione "Split canais" para dividir a imagem em DAPI constitutiva e imagens fluorescentes dentro da janela de "Bio-formatos opção de importação".
    3. Selecione "Colorized" em "Opções de cores" no menu suspenso. Selecione "Okey" para abrir o DAPI e H2AX de histona (H2AX) imagens como separar windows e escolha a imagem DAPI.
    4. Selecione a barra de ferramentas "Imagem" e "Ajustar o limiar" Selecione opção para núcleos.
      Nota: Vai aparecer uma janela de "Limiar".
    5. Ajuste o limite de imagem deslizando a barra inferior da janela do "Limiar" completamente para a direita. Ajuste a barra superior até os núcleos aparecem completamente vermelhos com contornos distintos e o fundo preto. Não selecione aplicar. Feche a janela "Ajustar o limiar".
    6. Selecione a opção de "Analisar partículas" e "Analisar" barra de ferramentas. Ver uma janela de "Analisar partículas" aparece na tela.
    7. O tamanho mínimo de um núcleo de entrada.
      Nota: Partículas abaixo o tamanho digitada não serão contadas como núcleos.
    8. No menu suspenso "Show", selecione "Contornos". Selecione a opção "Adicionar ao Gerenciador". Clique em "Okey" para abrir uma janela de "ROI Manager".
      Nota: Os contornos dos núcleos irão aparecer em uma janela separada.
    9. Atribua números para os núcleos que podem ser selecionados na janela "Gerenciador de ROI".
  11. Use o ImageJ para quantificar H2AX focos em imagens de microscopia de imunofluorescência.
    1. Selecione a janela de focos de "H2AX" (manchada com anticorpo secundário conjugado fluorescente). Em seguida, selecione barra de ferramentas "Processo" e escolha "Como encontrar a Maxima" para encontrar os focos dentro dos núcleos.
      Nota: Abrirá uma janela de "Encontrar Maxima".
    2. Escolha a opção "Single pontos" no menu suspenso "Tipo de saída" e selecione "Seleção de ponto de visualização" para visualizar os maxima/focos. Entrada de um valor de "Tolerância de ruído", dependendo da intensidade de fluorescência da imagem (Figura 1). Verifique a aparência de uma janela branca com pequenos pontos pretos.
      Nota: Estes pontos representam os focos de H2AX/máximos que foram detectados. O valor de tolerância de ruído deve ser mantido constante para todas as imagens sendo analisadas. Uma tolerância de ruído de baixa/alta vai retratar também muitos/poucos maxima (focos) dentro do núcleo e não será uma representação precisa dos focos dentro do núcleo.
    3. Selecione os núcleos para os quais H2AX focos devem ser quantificados da janela "Gerenciador de ROI". Selecione todos os núcleos, marcando a opção "Mostrar tudo".
    4. Selecione "Medida" para medir o número de maxima/focos dentro dos núcleos selecionados.
      Nota: O número de maxima/focos aparece como múltiplos de 255, ou seja, um máximo tem uma leitura de "RawIntDen" (densidade integrada) de 255.
    5. Copiar os valores de "RawIntDen" e colá-los em software para análise de dados.

2. análise de localização para uma pausa de longa duração Double-strand DNA

  1. Células de sementes em placas de 96 poços/lamelas conforme descrito nas seções 1.1 e 1.2.
  2. Indução de quebras de DNA dobro-costa
    1. Transfect células com o vetor de expressão do eu-SceI usando um reagente de Transfeccao de lipídios-baseado de acordo com as especificações do fabricante. Espere 24-72 h após a transfeccao para maximizar a expressão endonuclease. Determine se a transfeccao foi bem sucedido, localizando-se células com um foco singular grande nuclear γ-H2AX.
  3. Aquisição de imagens
    1. Corrigir, permeabilize, bloquear e lavar as placa de 96 poços/lamelas conforme descrito na seção 1.8.
    2. Co, incubar as células com um anticorpo contra γ-H2AX e a reparação de proteína de interesse (aqui, um anticorpo primário contra RAD51 foi usado) diluído de acordo com as especificações do fabricante em solução de 3% BSA.
    3. Lave as placa de 96 poços/lamelas 3 vezes com PBS 1x. Incube as placa de 96 poços/lamelas com anticorpo secundário diluído de acordo com o protocolo do fabricante em solução de BSA de 3%. Confirme que o fluorophores secundários não têm sobreposição de excitação ou espectros de emissão.
    4. Identifica as células que têm um foco grande γ-H2AX nuclear. Apenas tire fotos dessas células para evitar o viés.
  4. Análise de longa duração-SceI induzido focos
    1. Analise os focos de longa duração manualmente, pela contagem do número de células que possuem o γ-H2AX grandes focos e co localizados focos da reparação proteína de interesse.

Resultados

Figura 1 descreve a seleção da discriminação correta do ruído para quantificação de maxima/focos usando o ImageJ. As imagens mescladas de DAPI e a proteína de reparo de interesse estão no painel esquerdo. A figura 1A mostra uma discriminação de ruído de 90 e marca o número correto de focos. Núcleos na borda (retratado com uma flecha-de-rosa) e focos fora dos núcleos (representados com uma seta amarela) não são co...

Discussão

A análise do DNA reparação de danos em geral e o reparo de quebras de DNA dupla-hélice especificamente é uma área ativa de pesquisa porque suas consequências abrangem tumorigênese de biologia básica6,20. Este detalhes de manuscrito, uma abordagem que disseca com precisão a contribuição das proteínas RAD51 e γ-H2AX para a resolução de DSBs através de HR olhando para a frente, esse método pode ser usada para elucidar as funções adicionais de pro...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos Joel Sanneman e Dr. Philine Wangemann do núcleo microscopia Confocal, financiado pelo Kansas estado Universidade faculdade de medicina veterinária, pelo apoio dos esforços para desenvolver esta técnica. pCBASceI foi um presente de Maria Jasin (plasmídeo Addgene # 26477) 30. U2OS DR-GFP células foram um presente tipo de Maria Jasin18.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm CoverslipsVWR89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA)ThermoFisher Scientific28908
24-well plateVWR82050-892
96-well glass bottom plateCellvisP96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488EMD Millipore05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10) Cell Signaling Technology8875S
Bio-formats plugin for ImageJNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR97061-416
DAPIThermoFisher ScientificD1306
DMEM, High GlucoseThermoFisher Scientific12100046
EDTAInvitrogen15576-028
Fetal Bovine Serum (FBS)VWR89510-194
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594ThermoFisher Scientific A-11012 
Hydrogen Peroxidesigma-Aldrich216763-100ML
ImageJ SoftwareNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI Expression VectorAddgene26477
Nail Polish- Insta DriSally and HansenClearly Quick (103)
Phosphate Buffered Saline (PBS)Bio BasicPD8117
ProLong Gold Antifade ReagentLife TechnologiesP36930
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049-500ML
TurboFect Transfection ReagentThermoFisher ScientificR0531
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

Referências

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