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摘要

这里描述的协议是基于全基因组的定量的新合成的 mRNA 纯化的酵母细胞标记为 4-硫尿嘧啶。这种方法允许测量 mrna 合成与 mrna 衰变分离, 从而提供了 RNA 聚合酶 II 转录的精确测量。

摘要

转录组研究稳态 rna 可能忽略 rna 聚合酶 II 转录的全球缺陷。事实上, mrna 合成的全球减少被证明是通过同时减少 mrna 退化来恢复正常的稳态水平而得到补偿的。因此, 全基因组定量的 mrna 合成, 独立于 mrna 衰变, 是 RNA 聚合酶 II 转录活性的最佳直接反映。在这里, 我们讨论了一种使用非扰动代谢标记的新的 rna 在酿酒酵母(酵母) 的方法。具体来说, 细胞培养6分钟与尿嘧啶模拟, 4-硫尿嘧啶, 和标记的新转录 rna 被纯化和量化, 以确定所有个体 mRNA 的合成率。此外, 使用标记粟粟细胞作为内部标准允许比较不同的酵母菌株的 mRNA 合成。利用该协议和动态动力学模型拟合数据, 可以确定相应的 mRNA 衰减率。

引言

细胞通过基因表达程序的动态改变对内源和外源性线索作出反应。近年来, 全基因组方法的巨大发展允许在不同的条件下对转录的准确和全面的描述。在大多数转录组研究中, 微阵列杂交或高通量测序用于从总稳态 rna 分数中量化 rna 水平。在特定的摄动下转录改变可以显示出广泛的可能的结果, 与特定基因表达变化或大范围的基因要么上升或下调。基因表达是由 rna 聚合酶和影响 rna 水平的其他过程的 rna 合成之间的微调平衡或稳态的结果。RNA 聚合酶 II 转录, 包括其三不同的阶段 (起始, 伸长, 和终止), 是高度和错综复杂的与 mRNA 处理, 细胞质出口, 翻译和降解相关。

最近的一些研究表明, mRNAs 合成和衰变是耦合机制, 并表明在量化总稳态 RNA 时, 可以忽略对突变或刺激下的转录效应。首先, 通过对 mRNA 稳态水平的分析, 对转录变化的检测始终取决于 mRNAs 半衰期。一旦引入扰动, 长期半衰期的 mRNAs 的稳态水平将比短半衰期 mRNAs 的影响要小得多。因此, RNA 合成变化的可检测性强烈偏向于短寿命转录, 而较长存活的 mRNA 种类的分析可能无法揭示转录速率的动态变化。其次, 一些报告表明, 在酵母和哺乳动物中, 在分析 mRNA 的稳态水平时, 可能会忽略转录的全球变化。这可能是由于链路 mrna 合成和退化导致 mrna 缓冲的机制。这促使开发新的协议, 以量化 mrna 合成与降解分离, 通过对新转录 mrna 的分析。近年来, 提出了几种替代方案, 包括全球运行时序 (GRO)1和本机伸长率转录序列 (NET seq)2、3。在这里, 我们提出的协议最初开发的哺乳动物细胞4,5,6 , 然后适应酵母7,8,9,10, 11, 这是基于 RNA 标记与巯基核苷或基础模拟, 4-thiouridine (4sU) 或 4-硫尿嘧啶 (4tU), 分别。

这种方法专门净化新转录的 rna 从细胞的 rna 是脉冲标记与4sU 几乎没有干扰细胞稳态。因此, 一旦细胞暴露在 4sU, 分子迅速小白菜植株吸, 磷酸化到4苏三磷酸盐, 并纳入 rna 被转录。一旦脉冲标记, 它是可能提取总细胞 rna (对应于稳定状态的 rna), 并随后, 4 su 标记的 rna 分数是硫醇-特别修改, 导致生物素之间的二硫键的形成和新转录的 RNA4,5。然而, 4sU 只能由表达核苷转运体的细胞小白菜植株吸, 如人类要核苷转运 (hENT1), 防止其立即在萌芽或裂变酵母中使用。虽然可以在粟或s. 酵母中表达 hENT1, 但使用改良的碱4tU 可以实现更简便的方法, 因为酵母细胞可以占用 4tU, 而不需要核苷转运体10的表达,11,12,13. 事实上, 4tU 的新陈代谢需要酶尿嘧啶核糖 (UPRT) 的活性。在几个有机体, 包括酵母, 但不是哺乳动物, UPRT 是一个嘧啶打捞途径, 回收尿嘧啶尿苷单磷酸的关键。

转录组研究中的一个重要偏差可以通过平行分析的不同样本之间的规范化来引入。事实上, 许多偏离因素可能影响突变体和野生型菌株转录组的比较分析: 细胞裂解的效率、RNA 提取和恢复的差异, 以及用于微阵列分析的扫描器校准差异, 等等。如上所述, 当预期全球对 RNA 聚合酶 II 转录产生影响时, 这种变化会特别误导人。以远亲相关裂变酵母粟粟为内部标准, 设计了一种精确比较不同样品间 mRNA 合成速率的优雅的平均值。为此, 在细胞裂解和 RNA 提取之前, 将固定数量的标记的粟细胞添加到s. 酵母样本中, 即野生型或突变细胞.随后,粟和s 酵母的稳态和新合成的 rna 可以通过 rt-pcr 或通过微阵列芯片或高通量测序10进行量化。将这些数据与动力学建模相结合, 可以测量发芽酵母中 mRNA 合成和衰变的绝对速率。

在本手稿的框架中, 我们将展示新转录 rna 的分析如何能够揭示辅激活因子配合物佐贺和 TFIID 在萌芽酵母14,15, rna 聚合酶 II 转录中的全球作用, 16。重要的是, 过去的研究量化了S 酵母的稳态 mRNA 水平, 并建议佐贺在有限的酵母基因上发挥主导作用, 这一组受佐贺突变的强烈影响, 但相对抗 TFIID突变17,18,19。令人惊讶的是, 佐贺酶活性被证明对整个转录基因组起作用, 这表明在 RNA 聚合酶 II 转录中这一共同激活剂的作用更广泛。减少 RNA 聚合酶 II 在大多数表达基因的招募在佐贺或 TFIID 的灭活时观察到, 表明这些辅活化因子在大多数基因一起工作。因此, 新转录 mRNA 的定量显示, 佐贺和 TFIID 是需要的转录几乎所有基因的 RNA 聚合酶 II14,15,16。补偿机制的实施成为一种方法, 使细胞能够应对全球 mrna 合成减少, 这是由于 mrna 退化同时全球减少而缓冲的。佐贺添加了全球影响 rna 聚合酶 ii 转录的因素列表, 如 rna Pol ii 亚基10、调解人辅激活因子复合20、一般转录因子 TFIIH21、22和间接地, mRNA 降解机械的元素9,10,23。这种补偿性事件在佐贺突变体中普遍可见, 尽管 mrna 合成14的全球和严重减少, 但稳定状态 mRNA 水平的变化不大且有限。类似的分析也进行了BRE1删除应变, 导致完全丧失组蛋白 H2B 泛素化。有趣的是, 在缺乏 Bre1 的情况下, 可以检测到 rna 聚合酶 II 转录的温和但一致的全球影响, 这表明在酵母中新转录的 rna 的代谢标记可以检测和量化 mRNA 的广泛变化范围。合成率。

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研究方案

1. 佐贺亚基细胞培养和雷帕霉素耗竭

  1. 对于每个S. 酵母菌株和复制, 包括野生型或控制菌株, 接种一个单一的殖民地从新鲜的盘子到5毫升的 YPD 培养基 (2% 蛋白胨, 1% 酵母提取物, 和2% 葡萄糖)。
  2. 以恒定搅拌 (150 rpm) 在30摄氏度的夜间生长酵母细胞。
  3. 测量 600 nm (od600) 的光学密度, 并将培养液稀释到外径600约0.1 在100毫升的 YPD 培养基中, 让其生长直到 OD600约0.8。
  4. 同时, 将粟细胞从新鲜的盘子中接种到50毫升的是培养基 (0.5% 酵母提取物; 250 毫克/升腺嘌呤, 组氨酸, 尿嘧啶, 亮氨酸和赖氨酸; 3% 葡萄糖), 在32摄氏度下过夜, 持续搅拌 (150rpm)。
  5. 测量的 od600的粟过夜文化和稀释的文化到 od600约0.1 在500毫升的是中等, 让它长大, 直到 OD600约0.8。
  6. 对于每个S. 酵母锚离菌株和复制, 包括野生型或控制菌株, 接种一个单一的殖民地从新鲜的盘子到5毫升的 YPD 培养基 (2% 蛋白胨, 1% 酵母提取物, 和2% 葡萄糖)。
  7. 以恒定搅拌 (150 rpm) 在30摄氏度的夜间生长细胞。
  8. 第二天早上, 测量 od600, 稀释培养到 od600约0.1 在100毫升的 YPD 培养基, 让它生长, 直到 OD600约0.8。
  9. 从1毫克/毫升 (最终雷帕霉素浓度为1µg/毫升) 的股票溶液中添加100µL 雷帕霉素, 让细胞在30摄氏度孵育, 持续搅拌, 以使感兴趣的蛋白质有条件地从原子核中耗尽 (通常, 30 分钟是足够的)。对于控制, 使用类似的酵母培养, 但不是添加雷帕霉素, 添加等效体积的二甲基亚砜 (DMSO)。

2. 4tU粟标记 (计数)

  1. 准备2米4硫尿嘧啶的新鲜溶液。一旦准备好, 保持它在室温和远离光。
    1. 准确称重64.1 毫克 4-硫尿嘧啶为每个S. 酵母培养和溶解在250µL 的二甲基甲酰胺 (DMF) 或在250µL 的 DMSO。
    2. 对于粟文化被用作穗入, 重320.5 毫克 4-硫尿嘧啶和溶解它在1250µL 的 DMSO。
  2. 将 4-硫尿嘧啶溶液添加到酿酒酵母和粟培养液中, 最终浓度为 5 mM, 并在30摄氏度和32摄氏度的恒定搅拌下孵育6分钟。
  3. 6分钟后, 删除每个区域性的小等分以进行细胞计数。使用自动单元格计数器或 Neubauer 室计数单元格。
  4. 通过离心 (2500 x g) 收集细胞, 5 分钟, 4 摄氏度。
  5. 丢弃上清液, 用冰冷 1x PBS 洗涤细胞, 再离心 (2500 x g, 4 摄氏度, 5 分钟)。
  6. 计算每个粟和 s .酵母样品中的细胞总数。
  7. 在5毫升冰冷的 1x PBS 中重悬细胞, 并将 粟细胞与3:1 的比例混合在一起。
  8. 离心细胞 (2500 x g, 4 摄氏度, 5 分钟), 取出 PBS, 在液体 N2中闪冻细胞, 并将样品储存在-80 摄氏度, 直至进一步使用。

3. RNA 提取和 DNase 处理

  1. 在冰上解冻细胞约20–30分钟。
  2. 使用酵母 rna 萃取试剂盒 (材料表) 进行 RNA 提取, 并进行一些适应。
  3. 根据每个样品, 将750µL 的冰氧化锆珠倒入带套件的 1.5 mL 螺帽管中。请记住, 每管, RNA 从多达 109细胞可以有效地提取。因此, 准备每个样品所需的管数。例如, 100 毫升的酿酒酵母培养 (OD6000.8) 可以渲染大约 2 x 10 9 到 3 x 109细胞, 总共总共 2.7 x 109到 4 x 109的细胞 (在尖峰后与第三个s. 粟单元格)。在这种情况下, 每个样品/条件/突变体/复制需要多达 3-4 个反应管。
  4. 每个 1 x 109细胞, 添加480µL 的裂解缓冲液提供与试剂盒, 48 µL 的 10% SDS, 和480µL phenol:chloroform:isoamyl 酒精 (25:24:1, a/v/v)。
  5. 使用涡流混合器混合电池, 并将其转移到含有冷氧化锆珠的管子中。
  6. 调节涡旋混频器适配器上的管, 以最大速度转动涡旋, 并跳动10分钟以裂解酵母细胞 (在室温下为4摄氏度)。或者, 在自动串珠搅拌器中进行细胞裂解。
  7. 离心管在室温下 1.6万x g 5 分钟, 并仔细收集上阶段 (含 RNA 的阶段) 到新鲜的15毫升猎鹰管。通常情况下, 每管恢复的体积是围绕500–600µL。
  8. 对于含有部分纯化 RNA 的15毫升管, 添加与试剂盒一起提供的结合缓冲液并彻底混合。每100µL RNA 溶液, 添加350µL 的结合缓冲液 (即, 当水相溶液体积为600µL 时, 应添加2.1 毫升的结合缓冲液)。
  9. 对以前的混合物, 添加100% 乙醇和彻底混合。每100µL RNA 溶液, 添加235µL 100% 乙醇 (即, 当水相溶液体积为600µL, 加入1.41 毫升乙醇)。
  10. 将步骤3.9 中的混合物的700µL 应用于收集管中组装的过滤器盒, 两者均随试剂盒一起提供。
  11. 离心1分钟, 1.6万 x g。如果离心时间不足以使总体积通过过滤器, 请重复离心三十年代。
  12. 丢弃流过并重复使用同一收集管。再添加700µL RNA 结合缓冲液乙醇溶液到过滤器, 再离心 1.6万 x g 1 分钟。
  13. 丢弃流过, 重复步骤3.11 和 3.12, 直到 RNA 溶液完成。
  14. 用700µL 洗涤液1清洗过滤器2x。通过离心 1.6万 x g收集洗涤液1分钟, 并始终保持收集管。
  15. 用500µL 洗涤液2清洗过滤器2x。通过离心 1.6万 x g收集洗涤液1分钟, 并始终保持收集管。
  16. 再次离心管在 1.6万 x g 1 分钟, 完全干燥过滤器。
  17. 将滤芯转移至最终收集管 (RNA 适当管) 和洗脱 RNA, 50 µL DEPC 处理的无核糖核酸酶 H2O (预热至100摄氏度)。
  18. 离心1分钟, 1.6万 x g。
  19. 洗脱 RNA 再次 (对同一管) 与50µL 预热的 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H2o. 确保所有卷已通过过滤器;否则, 离心机的时间更长。
  20. 如果使用单个样本的多个管, 请将它们全部放在一个管中。
  21. 使用适当的设备量化并检查样品的纯度。
    注意: 虽然4tU 只纳入新合成的 RNA, 有可能与 DNA 的轻微污染。因此, 最好用 DNase i 来处理样品。为此, 请根据制造商的建议使用 RNA 萃取试剂盒 (材料表) 提供的试剂。

4. 新合成 RNA 的硫醇特异生物素化

  1. 调整获得的 RNA 浓度3的协议, 2 毫克/毫升。等分200µg 总 RNA, 加热10分钟, 在60摄氏度, 并立即在冰上冷却2分钟。
  2. 对于 RNA 等分, 按照以下顺序添加下列试剂: 600 µL DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H2O, 100 µL 生物素化缓冲液 (100 毫米三盐酸 [pH 7.5] 和10毫米 EDTA, 在 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H2O), 200 µL生物素-HPDP 从1毫克/毫升生物素-HPDP 在 DMSO 或 DMF 的股票。
    1. 在某些情况下, 生物素 HPDP 溶液趋于沉淀, 可能是由于其在水中溶解度低。在这种情况下, 增加高达40% 的反应体积的 DMSO/DMF 的体积 (对 RNA 样本, 增加400µL DEPC 处理的 H2O, 100 µL 生物素化缓冲液, 和400µL 的生物素-HPDP 从0.5 毫克/毫升的股票)。
  3. 在室温下孵育样品, 3 小时保护光线, 柔和搅拌。
  4. 孵育后, 将大约等量的氯仿添加到试管中, 用力搅拌。
  5. 在 1.3万 x g旋转样品5分钟, 在4摄氏度。此步骤允许去除没有 biotinylate RNA 的过量生物素。或者, 使用锁相管 (重) 执行此步骤。为此, 在 1.3万 x g下旋下锁相管1分钟, 加入 RNA 混合物和等量氯仿, 用力混合, 并在 1.3万 x g处离心5分钟, 在4摄氏度。
  6. 小心地将上一阶段转移到新的2毫升管中。
  7. 添加1/10 的体积5米氯化钠和混合样品。
  8. 添加相等的异丙醇体积, 彻底混合样品, 并在 1.3万 x g旋转它至少30分钟, 在4摄氏度。
  9. 小心去除上清液, 加入1毫升冰冷75% 乙醇。
  10. 旋转在 1.3万 x g 10 分钟, 在4摄氏度。
  11. 小心地除去上清液, 快速旋转管子, 除去剩余的乙醇溶液。确保 RNA 颗粒不干燥。
  12. 将 RNA 悬浮在100µL 的 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H2O。

5. 使用链霉素涂层磁珠纯化全无标记 RNA 中新合成的分数

  1. 在65摄氏度下加热生物素化 RNA 10 分钟, 然后在冰上冷却样品5分钟。
  2. 添加100µL 链霉素涂层磁性珠子到生物素化 RNA (最终体积为200µL)。具体地说, 建议使用材料表中所示的珠子, 因为在与其他实验室进行对话后, 这些磁珠似乎更加一致和可靠。
  3. 在室温下以轻微摇晃的90分钟孵育样品。
  4. 将所提供的列与工具包 (材料表) 放在磁性支架中。
  5. 添加900µL 的室温洗涤缓冲液 (100 毫米三盐酸 [pH 7.5], 10 毫米 EDTA, 1 M 氯化钠, 0.1% 补间 20, 在 DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H2O) 到列 (预运行和平衡)。
  6. 将珠子/RNA 混合物 (200 µL) 涂在柱子上。
  7. 收集1.5 毫升管中的流量, 并再次应用于同一磁性柱。如有必要, 请保持此流通过, 因为它表示未标记的 RNA 分数。
  8. 使用不断增加的洗涤缓冲液 (600、700、800、900和1000µL) 洗涤柱5x。
  9. 洗脱新合成的 RNA, 200 µL 0.1 M DTT。
  10. 进行第二次洗脱, 3 分钟后, 与同等体积 0.1 M DTT。
  11. 在洗脱 RNA 后, 添加0.1 卷3米显 (pH 5.2), 3 卷冰冷100% 乙醇, 2 毫克/毫升糖原 (rna 级) µL, 让 rna 沉淀过夜, 在20摄氏度。
  12. 通过离心恢复 RNA (1.3万 x g 10 分钟, 在4摄氏度) 和重悬在15µL DEPC 处理, 无核糖核酸酶 H20。标记到总 rna 的比例预计约为 2%-4% (通常更接近低端), 呈现约2.0 µg 新合成的 rna。这个数量足以做几个 qPCR 实验, 以及微阵列/测序分析。

6. 不同馏分的 rt-pcr 验证

  1. 根据制造商的说明 (材料表), 使用随机六聚体和逆转录酶的选择, 合成2µg 总 rna 或10µL 标记 rna 的 cDNA。
  2. 使用标准协议 (材料表), 通过实时的 qPCR 放大 cDNA。
    注: 所有样品均应以三份, 最少两次生物复制运行。更正粟微管蛋白表达式的所有原始值。

7. 微阵列杂交

  1. 根据制造商的说明, 将 RNA 样本杂交到首选芯片芯片上 (对于此特定协议, 请参阅材料表)。简要地说, 根据制造商的说明, 使用卓越的 rna 放大试剂盒 (材料表) 准备 150 ng rna 的生物素化 cRNA 靶点。杂交4毫克的碎片 cRNAs 16 h 在45摄氏度和 60 rpm 芯片芯片。
  2. 使用指定的工作站和扫描仪 (材料表) 清洗、染色和扫描芯片。使用命令控制台 (AGCC, 版本 4.1.2) 从扫描的图像中提取原始数据 (CEL 强度文件)。
  3. 进一步处理与表达式控制台软件版本1.4.1 的 CEL 文件, 以计算探针集信号强度, 使用基于统计的算法 MAS 5.0 与默认设置和全局缩放为规范化方法。
    注意: 每个芯片的修剪平均目标强度被任意设置为100。使用至少两个独立的生物复制进行所有实验。将原始数据规范化为粟信号, 并计算总计和新合成的 RNA 水平的折叠变化。

8. 使用现有 R 管道进行数据分析

  1. 使用管道和 Bioconductor 包 (如前面描述的810) 计算合成和衰减率。

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结果

当对新转录的 RNA 进行代谢标记时, 需要控制几个方面: 标记的时间和效率、峰值比例、提取协议和生物素化效果 (包括信噪比),等。其他7,10,11, 这些条件已经广泛和有条不紊地显示。在这里, 我们主要关注通过 rt-pcr、微阵列或测序处理样品后可以进行的解释和即时分析。对不同突变菌株的分析表明, 该方...

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讨论

虽然基因组范围的工具来分析转录的变化仍在改善, 但通过定量的 rna 的稳态水平的定量分析对转录的分析可能无法准确地反映 rna 聚合酶 II 活性的变化。事实上, mRNA 水平不仅受 RNA 合成的调控, 而且还受其成熟和降解的制约。为了测量 mrna 合成与 mrna 降解的不耦合性, 近年来开发出了不同的实验方法, 用于分析酵母和哺乳动物中的新生转录。

对新生转录进行定量的最广泛使用?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢他的支持和诉费舍尔, k. 舒马赫和 f. El Saafin 的讨论。肺结核由 ITN (PITN-GA-2013-606806, NR) 和基金会 ARC 支持。这项工作得到了法新社谜 (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) 的资金支持。这项研究也得到了 ANR-10-LABX-0030-INRT 的支持, 法国国家基金是由法新社谜在审批 d ' 艾文莉 ANR-10-IDEX-0002-02 框架计划下管理的。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-ThiouracilSigma-AldrichCat# 440736
RapamycinEuromedexCat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell CounterThermoFisherN/A
RiboPure RNA Purification kit, yeastThermoFisherCat# AM1926
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermoFisherND-2000
TURBO DNA-free KitThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotinThermoFisherCat# 21341
ThiolutinAbcamab143556
µMACS Streptavidin kitMiltenyi BiotecCat# 130-074-101
Transcriptor Reverse TranscriptaseRoche03 531 295 001
SYBR Green I MasterRoche4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Fluidics Station 450ThermoFisher00-0079
GeneChip Scanner 3000 7GThermoFisher00-0210

参考文献

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