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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der genomweiten Quantifizierung der neugebildete mRNA von Hefezellen mit 4-Thiouracil beschriftet gereinigt. Diese Methode ermöglicht die Messung der mRNA-Synthese von mRNA Decay abgekoppelt und schafft somit eine genaue Messung der RNA-Polymerase II Transkription.

Zusammenfassung

Globale Mängel in der RNA-Polymerase II Transkription könnte durch transkriptomischen Studien analysieren stationären RNA überblickt werden. Der weltweite Rückgang der mRNA-Synthese ist in der Tat nachweislich durch eine gleichzeitige Abnahme der mRNA Abbau zu normalen stationären wiederherstellen kompensiert werden. Daher ist die genomweite Quantifizierung der mRNA-Synthese, unabhängig von mRNA Decay, die beste direkte Reflexion der RNA-Polymerase II transkriptionelle Aktivität. Hier diskutieren wir eine Methode verwenden, nicht störend metabolische Kennzeichnung der im Entstehen begriffenen RNAs in Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae). Insbesondere die Zellen sind für 6 min. mit einem Uracil analog, 4-Thiouracil kultiviert, und die beschrifteten neu transkribierten RNAs sind gereinigt und quantifiziert, um die Synthese von allen einzelnen mRNA zu bestimmen. Darüber hinaus mit Schizosaccharomyces Pombe Zellen beschriftet, als interner Standard ermöglicht Vergleich der mRNA-Synthese in verschiedenen S. Cerevisiae Stämme. Mithilfe dieses Protokolls und Anpassung der Daten mit einem dynamischen kinetischen Modell, können die entsprechende mRNA Decay Tarife ermittelt werden.

Einleitung

Zellen reagieren auf endogene und exogene Signale durch die dynamische Veränderung ihrer Gen-Ausdruck-Programm. In den letzten Jahren ermöglicht eine enorme Entwicklung der genomweiten Methoden die genaue und umfassende Beschreibung der Transkriptom Änderungen unter verschiedenen Bedingungen. In den meisten transkriptomischen Studien Microarray-Hybridisierung oder Hochdurchsatz-Sequenzierung werden verwendet, um RNA Levels von einem gesamten stationären RNA Bruchteil zu quantifizieren. Transcriptional Änderungen unter einer bestimmten Störung können eine Vielzahl von Möglichkeiten, mit Veränderungen der spezifischen Genexpression oder ein großes Spektrum von Genen wird entweder auf- oder herunterreguliert anzeigen. Gen-Ausdrucks ergibt sich aus einem fein abgestimmten Gleichgewicht – oder stationären — zwischen RNS-Synthese von RNA-Polymerasen und andere Prozesse, die RNA-Ebene. RNA-Polymerase II Transkription, einschließlich seiner drei Phasen (Einleitung, Verlängerung und Kündigung) ist hoch und aufwendig mit mRNA Verarbeitung, zytoplasmatischen Export, Übersetzung und Abbau verbunden.

Mehrere neuere Studien gezeigt, dass mRNAs Synthese und Verfall gekoppelten Mechanismen und zeigte, dass transkriptionelle Effekte auf Mutation oder unter Reize bei der Quantifizierung der gesamten stationären RNA übersehen werden können. Erstens hängt die Erkennung von transcriptional Änderungen durch die Analysen der Steady-State Ebenen der mRNA immer mRNAs Halbwertszeit. Sobald die Störung eingeführt wird, werden die Steady-State Ebenen der mRNAs mit langen Halbwertszeiten viel weniger als die der mRNAs mit kurzen Halbwertszeiten betroffen sein. Daher ist die Nachweisbarkeit der Veränderungen in der RNS-Synthese stark zu Gunsten der kurzlebigen Transkripte, voreingenommen, während die Analyse der langlebigeren mRNA-Spezies Scheitern könnte, um dynamische Veränderungen der Transkription Rate zu offenbaren. Zweitens: mehrere Berichte haben gezeigt, dass sowohl in Hefe und Säugetiere, globale Veränderungen in der Transkription übersehen werden könnten, wenn die Steady-State Ebenen der mRNA zu analysieren. Dies ist wahrscheinlich auf die Mechanismen, die mRNA-Synthese und Degradation mRNA Pufferung zu verknüpfen. Dies veranlasste die Entwicklung neuer Protokolle, mRNA-Synthese, die losgelöst vom Abbau durch die Analyse der neu transkribierte mRNA zu quantifizieren. In den letzten Jahren wurden mehrere Alternativen vorgestellt, darunter globale Nachlauf Sequenzierung (GRO-Seq)1und native Dehnung Transkript Sequenzierung (NET-Seq)2,3. Hier präsentieren wir ein Protokoll zunächst in Säugerzellen4,5,6 entwickelt und dann an Hefe7,8,9,10, 11, basiert auf RNA, die Kennzeichnung mit einem Thiolated Nukleosid oder base Analog, 4-Thiouridine (4sU) oder 4-Thiouracil (4tU), beziehungsweise.

Diese Methode reinigt speziell neu transkribierten RNA aus den Zellen in die RNA mit 4sU mit praktisch keine Einmischung in die Zelle Homöostase Puls gekennzeichnet sind. Daher, sobald die Zellen 4sU ausgesetzt sind, ist das Molekül schnell Uptaken, um 4sU-Triphosphat phosphoryliert, und in RNA transkribiert wird. Sobald Puls-Label, es ist möglich, insgesamt zelluläre RNA (entsprechend Steady-State Ebenen der RNA) extrahieren und anschließend mit der Bezeichnung von 4sU RNA ist Thiol-speziell modifiziert, was zur Bildung einer Disulfid Bindung zwischen Biotin und die neu transkribierten RNA4,5. 4sU kann jedoch nur Uptaken durch die Zellen einen Nukleosid-Transporter, wie der menschliche equilibrative Nukleosid-Transporter (hENT1), verhindert den unmittelbaren Einsatz in Knospung oder Spaltung Hefe zum Ausdruck zu bringen. Während eines hENT1 in S. Pombe oder S. Cerevisiaeausdrücken könnte, kann ein einfacher Ansatz erreicht werden durch die modifizierte base 4tU da 4tU, ohne die Notwendigkeit des Ausdrucks eines Nukleosid-Transporter-10, Hefe-Zellen aufnehmen kann 11 , 12 , 13. In der Tat, der Stoffwechsel von 4tU erfordert die Aktivität des Enzyms Uracil-Phosphoribosyltransferase (UPRT). In einigen Organismen, einschließlich Hefe aber keine Säugetiere ist UPRT für eine Pyrimidine Salvage Pathway recycling Uracil, Uridin Monophosphate.

Eine wichtige Voreingenommenheit in transkriptomischen Studien kann durch die Normalisierung zwischen verschiedenen Proben analysiert parallel eingeführt werden. In der Tat können viele abweichende Faktoren beeinflussen die vergleichende Analyse des transkriptoms Mutanten und Wildtyp Stämme: die Effizienz der Zelle Lysis, Unterschiede in der Gewinnung und Verwertung von RNA und Abweichungen in der Scanner-Kalibrierung für Microarray Analysen , unter anderem. Wie oben besprochen, können solche Schwankungen besonders irreführend sein, wenn globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription zu erwarten sind. Eine eleganteste Mittel genau mRNA Synthese Preise zwischen verschiedenen Proben vergleichen wurde mithilfe der weitläufig verwandten Spalthefe Schizosaccharomyces Pombe als interner Standard entwickelt. Dafür eine feste Anzahl von S. Pombe beschriftet S. Cerevisiae Proben, Wildtyp oder mutierte Zellen vor der Zelle Lysis und RNA-Extraktion10Zellen hinzugefügt wird. Anschließend werden Steady-State und neugebildete RNAs von S. Pombe und S. Cerevisiae durch RT-qPCR oder über die Verwendung von Microarray-Chips oder Hochdurchsatz-Sequenzierung10quantifiziert. Zusammenführung dieser Daten mit kinetische Modellierung, können absolute Preise der mRNA-Synthese und des Verfalls in der angehenden Hefe gemessen werden.

Im Rahmen dieser Handschrift zeigen wir, wie die Analyse der neu transkribierten RNA erlaubt, um eine globale Rolle zu offenbaren, weil die Coactivator komplexe SAGA und TFIID RNA Polymerase II Transkription in angehende-14,15Hefe, 16. Wichtig ist, frühere Studien Steady-State mRNA-Niveaus in S. Cerevisiae quantifiziert und vorgeschlagen, dass SAGA spielt eine vorherrschende Funktion auf eine begrenzte Anzahl von Hefe Gene die stark betroffenen durch Mutationen im SAGA, aber relativ resistent gegenüber TFIID Mutationen,17,18,19. Überraschenderweise zeigten die SAGA enzymatischen Aktivitäten auf dem gesamten transkribierten Genom, was auf eine größere Rolle für diese Coaktivator in RNA Polymerase II Transkription handeln. Verminderte RNA Polymerase II Rekrutierung an am meisten exprimierten Genen wurde beobachtet, bei der Inaktivierung von SAGA oder TFIID, was darauf hindeutet, dass diese Koaktivatoren auf die meisten Gene zusammenarbeiten. Daher zeigte die Quantifizierung der neu transkribierte mRNA, SAGA und TFIID für die Transkription von fast allen Genen durch RNA-Polymerase II14,15,16erforderlich. Die Umsetzung der Kompensationsmechanismen entpuppt sich als eine Möglichkeit für die Zellen mit einem globalen Rückgang der mRNA-Synthese durch eine gleichzeitige weltweite Abnahme der mRNA Abbau gepuffert ist zu kämpfen. SAGA fügt in die Liste der Faktoren, die eine globale Auswirkung auf RNA Polymerase II Transkription, wie z. B. RNA Pol II Untereinheiten10, der Mediator Coactivator Komplex20, die allgemeine Transkription Faktor TFIIH21,22 , und indirekt, Elemente der mRNA Abbau Maschinen9,10,23. In SAGA Mutanten, Bilanzierung von bescheiden und begrenzte Änderungen im Steady-State mRNA-Niveaus trotz eines globalen und schweren Rückgangs der mRNA-Synthese-14wurden allgemein solche kompensatorische Ereignisse beobachtet. Ähnliche Untersuchungen wurden auch in einem BRE1 Löschung Stamm, was zu einem vollständigen Verlust des Histon H2B Ubiquitination durchgeführt. Interessanterweise konnte wesentlich milder, aber konsequente globale Auswirkungen auf RNA-Polymerase II Transkription nachgewiesen werden, bei fehlender Bre1, darauf hinweist, dass metabolische Kennzeichnung neu transkribierten RNA in Hefe erkennen und eine Vielzahl von Änderungen in mRNA zu quantifizieren Synthese-Preise.

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Protokoll

(1) Zelle Kultivierung und Rapamycin Erschöpfung der SAGA-Untereinheit

  1. Für jede S. Cerevisiae -Stamm und replizieren impfen einschließlich der Wildtyp oder vergleichslinien, eine einzige Kolonie von einem frischen Teller auf 5 mL YPD Medium (2 % Pepton, Hefeextrakt 1 % und 2 % Glukose).
  2. S. Cerevisiae Zellen über Nacht bei 30 ° C mit ständiger Bewegung (150 u/min) wachsen.
  3. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 von ca. 0,1 in 100 mL YPD Medium und lassen es wachsen, bis die OD600 um 0,8 ist.
  4. Parallel, impfen eine einzige Kolonie von S. Pombe Zellen aus einem frischen Teller auf 50 mL ja Medium (0,5 % Hefeextrakt; 250 mg/L Adenin, Histidin, Uracil, Leucin und Lysin; 3 % Glukose) und wachsen die Zellen über Nacht bei 32 ° C mit ständiger Bewegung (150 u/min).
  5. Messen die OD600 S. Pombe über Nacht Kultur und verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 von ca. 0,1 in 500 mL ja Medium und lassen es wachsen, bis die OD600 ca. ist 0,8.
  6. Für jeden Anker-away S. Cerevisiae -Stamm und replizieren impfen einschließlich der Wildtyp oder vergleichslinien, eine einzige Kolonie von einem frischen Teller auf 5 mL YPD Medium (2 % Pepton, Hefeextrakt 1 % und 2 % Glukose).
  7. Wachsen Sie die Zellen über Nacht bei 30 ° C mit ständiger Bewegung (150 u/min).
  8. Am nächsten Morgen Messen Sie OD600, verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 von ca. 0,1 in 100 mL YPD Medium und lassen Sie es wachsen, bis die OD600≈ 0,8.
  9. Die Kultur von einer Stammlösung von 1 mg/mL (endgültige Rapamycin Konzentration von 1 µg/mL) 100 µL Rapamycin hinzu und lassen Sie die Zellen, die bei 30 ° C mit ständiger Bewegung für die notwendige Zeit für das Protein von Interesse für bedingt aufgebraucht sein, aus dem Zellkern (inkubieren in der Regel reicht 30 min). Verwenden Sie für das Steuerelement eine ähnliche Hefekultur, aber anstatt Rapamycin hinzuzufügen, fügen Sie die gleiche Menge an Dimethyl Sulfoxid (DMSO).

2. 4tU Etikettierung mit S. Pombe als Spike-in (zählen)

  1. Bereiten Sie eine frische Lösung von 2 M 4-Thiouracil. Nachdem vorbereitet, halten Sie es bei Raumtemperatur und vor Licht.
    1. Genau wiegen Sie 64,1 mg 4-Thiouracil für jede Kultur S. Cerevisiae und lösen Sie es in 250 µL Dimethylformamid (DMF) oder 250 µL von DMSO.
    2. Für die S. Pombe Kultur als Spike-in verwendet werden wiegen 320,5 mg 4-Thiouracil und in 1.250 µL von DMSO auflösen.
  2. S. Cerevisiae und S. Pombe Kulturen für eine Endkonzentration von 5 mM 4-Thiouracil-Lösung hinzu und inkubieren sie 6 min mit ständiger Bewegung bei 30 ° C und 32 ° C, beziehungsweise.
  3. Entfernen Sie nach 6 min eine kleine Aliquot der jeweiligen Kultur für Zellzählung. Zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zelle Zähler oder eine Neubauer-Kammer.
  4. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation (2.500 X g) für 5 min bei 4 ° C.
  5. Verwerfen Sie den überstand, waschen Sie die Zellen mit eiskalten 1 X PBS und Zentrifuge wieder (2.500 X g, 4 ° C, 5 min).
  6. Die Gesamtzahl der Zellen in jedem der S. Cerevisiae und S. Pombe Proben zu berechnen.
  7. Die Zellen in 5 mL eiskaltes 1 X PBS aufschwemmen und S. Cerevisiae mit S. Pombe Zellen mit einem Verhältnis von 3:1 mischen.
  8. Zentrifugieren der Zellen (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), entfernen Sie die PBS Schockfrosten der Zellen in flüssigem N2und die Probe bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.

(3) RNA-Extraktion und DNase-Behandlung

  1. Auftauen der Zellen für ca. 20-30 min auf Eis.
  2. Fahren Sie mit der RNA-Extraktion mit einem Hefe-RNA-Extraktion-Kit (Table of Materials) mit ein paar Anpassungen.
  3. Pro jede Probe Gießen Sie 750 µL eiskalte Zirkonia Perlen in ein 1,5 mL Schraubverschluss-Röhrchen mit dem Kit geliefert. Denken Sie daran, dass pro jedes Rohr RNA aus bis zu 109 Zellen effizient extrahiert werden kann. Bereiten Sie daher die Anzahl der Rohre notwendig für jede Probe. Beispielsweise kann eine Kultur von S. Cerevisiae 100 ml (OD600≈ 0,8) ca. 2 x 10-9 , 3 x 10-9 -Zellen, im Vorfeld insgesamt 2,7 x 10 Rendern9 , 4 x 10-9 -Zellen insgesamt (nach dem Spike-in einem Drittel der S. Pombe Zellen). In diesem Fall wäre bis zu 3-4 Reaktionsgefäßen pro jede Probe/Zustand/Mutant/Replikation erforderlich.
  4. Fügen Sie pro jeweils 1 x 10-9 -Zellen 480 µL des Puffers Lyse zur Verfügung gestellt mit dem Kit, 48 µL 10 % SDS und 480 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1, V/V/V).
  5. Mischen Sie die Zellen mit einem Vortex-Mixer und übertragen Sie sie auf das Röhrchen mit der eiskalten Zirkonia Perlen.
  6. Platz für die Rohre auf einen Vortex-Mixer-Adapter, drehen Sie den Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit und schlagen für 10 min in die Hefezellen (in einem Raum bei 4 ° C) zu lösen. Alternativ führen Sie Lyse der Zellen in eine automatische Wulst-Schläger.
  7. Zentrifugieren Sie Rohre bei 16.000 X g für 5 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie sorgfältig die obere Phase (RNA-haltigen Phase) zu einem frischen 15 mL Falcon-Röhrchen. Das Volume wiederhergestellt pro jedes Rohr ist in der Regel um 500 – 600 µL.
  8. Die 15 mL-Röhrchen mit teilweise gereinigtes RNA, die Bindung Puffer zur Verfügung gestellt mit dem Kit und Mischung gründlich. Pro jeweils 100 µL RNA-Lösung hinzufügen 350 µL Puffer Bindung (d. h., wenn die wässrige Phase Lösung Volumen 600 µL, 2,1 mL des Puffers Bindung sollte hinzugefügt werden).
  9. Zu den vorherigen Mischung die 100 % Ethanol und mischen Sie gründlich. Pro jeweils 100 µL RNA-Lösung hinzufügen 235 µL 100 % Ethanol (d. h., wenn die wässrige Phase Lösung Volumen 600 µL addieren 1,41 mL Ethanol).
  10. Bewerben Sie bis zu 700 µL der Mischung aus Schritt 3,9 zu eine Filterpatrone montiert in einem Sammelrohr, beide mit dem Kit versehen.
  11. Zentrifuge für 1 min bei 16.000 X g. Wenn die Zentrifugation Dauer nicht genug für das Gesamtvolumen der Filter durchlaufen wurde, wiederholen Sie die Zentrifugation für 30 s.
  12. Die Flow-through zu verwerfen Sie und wiederverwenden Sie, die gleiche sammelröhrchen. Am Filter und Zentrifuge wieder bei 16.000 X g für 1 min eine weitere 700 µL RNA-bindende Puffer-Ethanol-Lösung hinzufügen.
  13. Verwerfen Sie der durchströmten und wiederholen Sie die Schritte 3.11 und 3.12 bis die RNA-Lösung abgeschlossen ist.
  14. Waschen Sie den Filter 2 X mit 700 µL Waschlösung 1. Sammeln Sie waschen Lösung per Zentrifugation bei 16.000 X g für 1 min zu und behalten Sie immer das sammelröhrchen.
  15. Waschen Sie den Filter 2 X mit 500 µL Waschlösung 2. Sammeln Sie waschen Lösung per Zentrifugation bei 16.000 X g für 1 min zu und behalten Sie immer das sammelröhrchen.
  16. Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei 16.000 X g für 1 min den Filter vollständig trocknen.
  17. Übertragen Sie die Filterpatrone auf dem endgültigen Sammelrohr (RNA-geeignete Röhre) und eluieren Sie RNA mit 50 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O (bis 100 ° C vorgewärmt).
  18. Zentrifuge für 1 min bei 16.000 X g.
  19. Eluieren Sie RNA wieder (mit dem gleichen Rohr) mit 50 µL vorgewärmten DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O. Stellen Sie sicher, dass das Volumen des Filters durchlaufen hat; Zentrifugieren Sie andernfalls über einen längeren Zeitraum.
  20. Wenn mehrere Rohre für ein einzelnes Sample verwendet werden, bündeln sie alle in eine Röhre.
  21. Quantifizieren Sie und überprüfen Sie die Reinheit der Probe mit der entsprechenden Ausrüstung.
    Hinweis: Während 4tU nur innerhalb neu synthetisierte RNA eingebaut wird, gibt es eine Chance, kleine Verunreinigungen mit DNA. Aus diesem Grund, es ist immer ratsam, die Proben mit DNase behandeln ich. Verwenden Sie die Reagenzien zur Verfügung gestellt mit dem RNA-Extraktion Kit (Table of Materials) nach den Empfehlungen des Herstellers.

4. Thiol-spezifische Biotinylierungen neu synthetisierte RNA

  1. Passen Sie die Konzentration der RNA mit Abschnitt 3 des Protokolls bis 2 mg/mL erzielt. Aliquoten 200 µg von Gesamt-RNS, für 10 min bei 60 ° C erhitzen und kühlen es sofort für 2 min auf Eis.
  2. Hinzufügen der RNA aliquoten, Reagenzien, die in der folgenden Reihenfolge unten genannten: 600 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O, 100 µL biotinylierungen-Puffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] und 10 mM EDTA, in DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O) und 200 µL Biotin-HPDP aus einem Bestand von 1 mg/mL Biotin-HPDP in DMSO oder DMF.
    1. In einigen Situationen tendenziell die Biotin-HPDP-Lösung auszufällen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Löslichkeit in Wasser. In diesem Fall erhöhen Sie die Lautstärke von DMSO/DMF bis zu 40 % das Reaktionsvolumen (RNS-Probe hinzufügen 400 µL DEPC-behandeltem H2O, 100 µL biotinylierungen-Puffer und 400 µL Biotin-HPDP aus einem Bestand von 0,5 mg/mL).
  3. Die Probe bei Raumtemperatur inkubieren und lichtgeschützt für 3 h, mit sanften Agitation.
  4. Nach der Inkubation der Rohre ein etwa gleiches Volumen von Chloroform hinzu und mischen Sie kräftig.
  5. Drehen Sie die Probe bei 13.000 X g für 5 min bei 4 ° C. Dieser Schritt erlaubt die Entfernung von überschüssigen Biotin, die nicht Biotinylate die RNA hat. Alternativ führen Sie diesen Schritt mit Phase-Lock Röhren (schwer). Dafür spin-down Phase-Lock Röhren für 1 min bei 13.000 X g, fügen Sie die RNA-Mischung und eine gleiche Menge von Chloroform, mischen sie kräftig und Zentrifugieren sie 13.000 x g für 5 min bei 4 ° C.
  6. Übertragen Sie die obere Phase in neuen 2 mL Röhrchen sorgfältig.
  7. Ein Zehntel des Volumens von 5 M NaCl und Mischen der Probenmaterials.
  8. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Isopropanol, durchmischen der Probenmaterials und drehen es mit 13.000 X g für mindestens 30 min, bei 4 ° c
  9. Vorsichtig entfernen Sie den überstand zu und fügen Sie 1 mL eiskaltem 75 % Ethanol.
  10. Drehen Sie mit 13.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
  11. Sorgfältig überstand, Quick-Spin den Schlauch entfernen Sie und die restlichen Ethanol-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die RNA-Pellet nicht eintrocknet.
  12. Hängen Sie die RNA in 100 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O.

5. Reinigung der neugebildete Bruchteil von insgesamt und unbeschriftete RNA mit magnetischen Beads Streptavidin beschichteten

  1. Erhitzen Sie biotinylierte RNA für 10 min bei 65 ° C und dann kühlen Sie die Proben für 5 min auf Eis.
  2. Die biotinylierte RNA (bei einem Endvolumen von 200 µL) 100 µL Streptavidin beschichteten magnetische Beads hinzufügen. Insbesondere empfiehlt es sich, die Perlen, die in der Tabelle der Materialien, da nach Gesprächen mit anderen Labors, diese schien angegeben verwenden, um die konsistente und zuverlässige.
  3. Inkubieren Sie die Probe mit leichten Schütteln für 90 min bei Raumtemperatur.
  4. Legen Sie die Spalten mit dem Kit (Table of Materials) in den Magnetstativ zur Verfügung gestellt.
  5. Fügen Sie 900 µL Raumtemperatur waschen Puffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, und 0,1 % Tween 20 in DEPC-behandeltem, RNase-freie H2O) auf die Spalten (Pre-laufen und equilibrate).
  6. Perlen/RNA Mischung (200 µL) auf die Spalten anwenden.
  7. Der Durchfluss in 1,5 mL Röhrchen sammeln und wieder auf die gleiche magnetische Spalte anwenden. Bei Bedarf halten Sie diese durchströmten da es den unbeschrifteten RNA-Anteil darstellt.
  8. Waschen Sie die Spalten 5 X mit steigender Datenmengen Waschpuffer (600, 700, 800, 900 und 1.000 µL).
  9. Eluieren Sie die neugebildete RNA mit 200 µL 0.1 M DTT.
  10. Führen Sie eine zweite Elution, 3 min später mit ein gleiches Volumen von 0,1 M DTT.
  11. Nach eluierenden RNA, 0,1 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,2), 3 Bände von eiskalten 100 % Ethanol und 2 µL von 20 mg/mL Glykogen (RNA-Klasse) und lassen Sie die RNA Niederschlag über Nacht, bei-20 ° C.
  12. Wiederherstellen der RNS durch Zentrifugieren (13.000 X g für 10 min bei 4 ° C) und in 15 µL DEPC-behandeltem, RNase-freie H20 aufzuwirbeln. Der Anteil der beschriftet, Total RNA wird voraussichtlich rund 2 % - 4 % (in der Regel mehr am unteren Ende), ca. 2,0 µg neu synthetisierte RNA rendern. Diese Menge reicht mehrere qPCR-Experimente, sowie für Microarray/Sequenzierung Analysen machen.

(6) RT-qPCR Validierung der verschiedenen Fraktionen

  1. CDNA von 2 µg Gesamt-RNS oder 10 µL beschrifteten RNA mit zufälligen Hexamers und die Reverse Transkriptase Wahl, nach den Anweisungen des Herstellers (Table of Materials) zu synthetisieren.
  2. Verstärken Sie die cDNA durch Echtzeit-qPCR Standardprotokolls (Table of Materials).
    Hinweis: Alle Beispiele sollten in dreifacher Ausfertigung von einem Minimum von zwei biologischen Wiederholungen ausgeführt werden. Korrigieren Sie alle Rohwerte für den Ausdruck von S. Pombe Tubulin.

(7) Microarray-Hybridisierung

  1. Hybridisieren RNA-Proben auf bevorzugte Microarray-Chips nach den Anweisungen des Herstellers (für dieses spezielle Protokoll Siehe Tabelle of Materials). Kurz, bereiten biotinylierte cRNA Ziele von 150 ng RNA mit dem Premier RNA Amplifikation Kit (Table of Materials), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Hybridisieren Sie 4 mg fragmentierten cRNAs für 16 h bei 45 ° C und 60 u/min auf Microarray-Chips.
  2. Waschen Sie, Färben Sie, und Scannen Sie die Chips unter Verwendung der angegebenen Station und Scanner (Table of Materials). Extrahieren Sie die Rohdaten (CEL-Intensität-Dateien) aus den gescannten Bildern unter Verwendung der Befehlskonsole (AGCC, Version 4.1.2).
  3. Die CEL-Dateien mit Ausdruck Konsole Softwareversion 1.4.1 berechnen Sonde Signalintensitäten, mit den Statistiken basierende Algorithmen MAS 5.0 mit Standardeinstellungen und global-scaling-als Normalisierung Methode gesetzt weiter zu verarbeiten.
    Hinweis: Die getrimmte mittlere Ziel Intensität jeder Chip wurde willkürlich auf 100 festgelegt. Durchführen Sie alle Experimente mit mindestens zwei unabhängige biologische Wiederholungen. Raw-Daten mit dem S. Pombe Signal zu normalisieren und Falte Veränderungen im gesamten und neu synthetisierte RNA-Ebene zu berechnen.

8. Daten Analyse mit einer bestehenden R-Pipeline

  1. Berechnen Sie Synthese und Verfall der Preise mit einer Rohrleitung und R/Bioconductor Paket öffentlich zugänglich, wie zuvor beschrieben8,10.

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Ergebnisse

Bei der metabolischen Kennzeichnung neu transkribierten RNA mehrere Aspekte kontrolliert werden müssen: die Zeit und Effizienz die Kennzeichnung der Spike-Anteil, die Extraktion-Protokoll und die biotinylierungen Wirksamkeit (einschließlich Signal-Rausch-Verhältnis), unter anderem. Diese Bedingungen wurden ausgiebig und methodisch von anderen7,10,11gezeigt. Hier konzentrieren wir uns hauptsäc...

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Diskussion

Während genomweite Tools, um Veränderungen in der Transkription zu analysieren noch zu verbessern sind, könnte die einzige Analyse des transkriptoms durch die Quantifizierung der Steady-State Ebenen der RNA nicht Änderungen in RNA Polymerase II Aktivität widerspiegeln. MRNA-Niveaus sind in der Tat nicht nur durch die RNA-Synthese, sondern auch durch ihre Reifung und Abbau geregelt. Zur Messung der mRNA-Synthese von mRNA Abbau abgekoppelt wurden unterschiedliche Protokolle in den letzten Jahren für die Analyse der i...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Laszlo Tora für seine Unterstützung und V. Fisher, K. Schumacher und F. El Saafin für ihre Gespräche. T.B. wurde unterstützt durch ein Stipendium der Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) und der Fondation Bogen. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der Agence Nationale De La Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) unterstützt. Diese Studie wurde auch von ANR-10-LABX-0030-INRT, französische Staat von der Agence Nationale De La Recherche unter den Rahmen Programm Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02 verwalteten Fonds unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4-ThiouracilSigma-AldrichCat# 440736
RapamycinEuromedexCat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell CounterThermoFisherN/A
RiboPure RNA Purification kit, yeastThermoFisherCat# AM1926
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermoFisherND-2000
TURBO DNA-free KitThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotinThermoFisherCat# 21341
ThiolutinAbcamab143556
µMACS Streptavidin kitMiltenyi BiotecCat# 130-074-101
Transcriptor Reverse TranscriptaseRoche03 531 295 001
SYBR Green I MasterRoche4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Fluidics Station 450ThermoFisher00-0079
GeneChip Scanner 3000 7GThermoFisher00-0210

Referenzen

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
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