JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол, описанные здесь основан на количественное определение генома общесистемной вновь синтезированной мРНК, очищенного от дрожжевых клеток с 4-thiouracil. Этот метод позволяет измерять синтез мРНК, расцеплено от гниения мРНК и, таким образом, обеспечивает точное измерение II транскрипции РНК-полимеразы.

Аннотация

Глобальные дефекты в транскрипции РНК полимеразой II может игнорировать транскриптомики исследований, анализа установившегося РНК. Действительно было показано глобальное снижение синтеза мРНК компенсироваться одновременным снижением деградации мРНК для восстановления нормального уровня устойчивого состояния. Следовательно количественного определения генома широкий синтез мРНК, независимо от распада мРНК, является лучшим прямым отражением РНК полимеразой II транскрипционный анализ деятельности. Здесь мы рассмотрим метод, с помощью не нарушается метаболизм маркировки зарождающейся РНК в Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Конкретно клетки культивировали на 6 мин с урацила аналоговые, 4-thiouracil, и обозначенные недавно транскрипции РНК очищенный и количественно определить показатели синтеза всех отдельных мРНК. Кроме того, с помощью помечены Делящиеся дрожжи клетки как внутренний стандарт позволяет, сравнение синтез мРНК в различных S. cerevisiae штаммов. Используя этот протокол и установку данных с динамической кинетической модели, соответствующие показатели распада мРНК могут быть определены.

Введение

Клетки реагируют на эндогенных и экзогенных подсказки, через динамические изменения их программы выражения гена. В последние годы огромное развитие генома общесистемной методологии позволяет точное и всеобъемлющее описание транскриптом изменения в различных условиях. В большинстве исследований транскриптомики microarray гибридизации или высок объём последовательности используются для количественного определения уровня РНК от общей доли РНК установившегося. Transcriptional изменений под конкретные возмущения может отображать широкий спектр возможных результатов, с большой спектр генов вверх - или downregulated или изменения выражения определенного гена. Экспрессия генов является результатом точного равновесия — или стационарном — между синтез РНК, РНК-полимеразы и других процессов, влияющих на уровень РНК. Транскрипции РНК-полимераза II, включая его три этапа (инициации, элонгации и прекращение), высоко и неразрывно связан с обработки, цитоплазматических экспорта, перевод и деградации мРНК.

Несколько недавних исследований показали, что синтез мРНК и распада спаренных механизмы и показал, что транскрипционный анализ эффектов после мутации или под стимулы могут быть пропущены при количественной оценки общего устойчивого состояния РНК. Во-первых обнаружение transcriptional изменений путем анализа установившегося уровни mRNA всегда зависит от mRNAs half-life. Как только вводится возмущений, устойчивого состояния уровня мРНК с долгий период полураспада чем те мРНК с короткие периоды полураспада затронет гораздо меньше. Таким образом обнаружения изменений в синтез РНК является сильно предвзятым в пользу недолго стенограммы, в то время как анализ видов повериям мРНК могут не выявить динамических изменений курса транскрипции. Во-вторых несколько докладов показали, что, как в дрожжей и млекопитающих, могут игнорировать глобальные изменения в транскрипции, при анализе установившегося уровни mRNA. Это, вероятно, за счет механизмов, которые связывают синтез мРНК и деградации, что приводит к буферизации мРНК. Это побудило разработки новых протоколов для количественного определения синтез мРНК, расцеплено от деградации, путем анализа вновь трансляции мРНК. В последние годы были представлены несколько вариантов, включая глобальные выбега последовательности (GRO-seq)1и родной удлинение Стенограмма виртуализации (NET-seq)2,3. Здесь мы представляем протокол изначально разработанный в mammalian клетках4,5,6 и затем адаптирована к дрожжи7,8,9,10, 11, которая основана на РНК, маркировки с thiolated нуклеозидов или базовый аналоговый, 4-thiouridine (4СУ) или 4-thiouracil (4tU), соответственно.

Этот метод специально очищает недавно транскрипции РНК из клеток, в которых РНК, пульс помечены 4СУ практически без вмешательства в гомеостаза клетки. Таким образом после того, как клетки подвергаются 4СУ, молекула является быстро освоен, фосфорилированных 4СУ трифосфата и включены в РНК транскрипции. После того, как пульс меткой, это можно извлечь всего клеточной РНК (соответствующий уровень установившегося РНК), и, впоследствии, фракция 4СУ меченых РНК тиоловых специально изменены, приводит к образованию дисульфидных связей между биотина и Недавно транскрипции РНК4,5. Однако 4СУ только может быть освоен, выражая нуклеозидный транспортер, как человека equilibrative нуклеозидный транспортер (hENT1), предотвращая ее немедленного использования бутонизации или деления дрожжевой клетки. Хотя одно может выразить hENT1 S. pombe или S. cerevisiae, более простой подход может быть достигнуто с помощью измененный базовый 4tU, так как клетки дрожжей может занять до 4tU, без необходимости выражения нуклеозидный транспортер10, 11 , 12 , 13. В самом деле, метаболизм 4tU требует активности фермента урацила phosphoribosyltransferase (UPRT). В нескольких организмов, в том числе дрожжи, но не млекопитающих UPRT имеет важное значение для пути спасения пиримидина, переработка урацила в уридина монофосфат.

Важное значение смещения в транскриптомики исследования могут быть введены по нормализации отношений между различными образцы, проанализированы параллельно. Действительно, многие иные факторы могут повлиять на сравнительный анализ транскриптом мутант и дикого штаммов: эффективность лизис клеток, различия в добыче и восстановления РНК, и разницы в калибровка сканера для microarray анализ , среди других. Как говорилось выше, такие различия может быть особенно заблуждение, когда глобальные последствия для транскрипции РНК полимеразой II, как ожидается. Элегантный значит точно сравнить ставки синтез мРНК между различными образцами был разработан с использованием дрожжей отдаленно связанные деления Делящиеся дрожжи как внутренний стандарт. Для этого, фиксированное количество помечены S. pombe ячеек добавляется образцы S. cerevisiae , одичал тип или мутант клетки, до лизис клеток и РНК добыча10. Впоследствии как статических, так и заново синтезированные РНК от S. pombe и S. cerevisiae количественно RT-ПЦР или через использование высокопроизводительного секвенирования10или обломоки microarray. Сочетание этих данных с кинетического моделирования, абсолютное ставки мРНК синтеза и распада в многообещающий дрожжей могут быть измерены.

В рамках этой рукописи мы покажем, как анализ недавно транскрипции РНК позволил выявить глобальную роль для комплексов coactivator Сага и TFIID в транскрипции РНК полимеразой II в многообещающий дрожжей,14,15 16. Важно отметить, что последние исследования количественно уровни mRNA установившегося в S. cerevisiae и предложил, что сага играет функцию преобладающим на ограниченный набор генов дрожжей, которые сильно пострадавших от мутации в Сага, но относительно устойчив к TFIID мутации17,18,19. Удивительно Сага ферментативную деятельность были продемонстрированы действовать в целом транскрипции генома, предлагая более широкую роль для этого совместного активатор транскрипции РНК полимеразой II. Снижение РНК полимеразой II найма на наиболее выраженное генов было отмечено по инактивации Сага или TFIID, предполагая, что эти коактиваторы работать вместе на большинство генов. Следовательно количественная оценка недавно трансляции мРНК показали, что Сага и TFIID необходимы для транскрипции почти всех генов РНК полимеразы II14,,1516. Осуществление компенсационных механизмов возникает как способ для клетки, чтобы справиться с глобальным снижением синтеза мРНК, который буферизуется одновременное снижение глобальной деградации мРНК. Сага добавляет в список факторов, имеющих глобальный эффект на транскрипции РНК полимеразой II, например, РНК Pol II подразделения10, посредник coactivator комплекс20, Генеральный транскрипционным фактором TFIIH21,22 и косвенно, элементы10,9,механизм деградации мРНК23. В Сага мутантов, приходится скромные и ограниченные изменения в стационарном уровни mRNA несмотря на глобальных и серьезным снижением синтеза мРНК14универсально наблюдались такие компенсационные мероприятия. Были также подобные анализы в BRE1 исключить деформации, что приводит к полной потере гистона H2B ubiquitination. Интересно, что гораздо мягче, но последовательно глобальный эффект на транскрипции РНК полимеразой II могут быть обнаружены в отсутствие Bre1, указав, что метаболические маркировки недавно транскрипции РНК в дрожжи можно обнаружить и количественно оценить широкий спектр изменений в мРНК синтез ставки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. клетки культивирования и истощение Rapamycin субъединицы Сага

  1. Для каждого штамма S. cerevisiae и репликации включая одичал тип или управления штаммов, прививать единую колонию из свежих пластину на 5 мл среды YPD (2% Пептон, экстракт дрожжей 1% и 2% раствор глюкозы).
  2. Рост клеток S. cerevisiae ночь в 30 ° C с постоянным перемешиванием (150 об/мин).
  3. Измеряют оптическую плотность на 600 Нм (600ОД) и развести культуры ОД600 приблизительно 0,1 в 100 мл YPD среднего и пусть растут до од600 составляет около 0,8.
  4. Параллельно, прививать единой колонии клеток S. pombe из свежих пластину на 50 мл среды Да (0,5% экстракт дрожжей; 250 мг/Л аденин, гистидина, урацила, лейцин и лизин; 3% глюкозы) и расти клетки на ночь на 32 ° C с постоянным перемешиванием (150 об/мин).
  5. Измерить ОД600 S. pombe ночь культуры и разбавить культуры ОД600 приблизительно 0,1 в 500 мл среды да и пусть растут до од600 примерно 0,8.
  6. Для каждого штамма S. cerevisiae якорь прочь и репликации включая одичал тип или управления штаммов, прививать единую колонию из свежих пластину на 5 мл среды YPD (2% Пептон, экстракт дрожжей 1% и 2% раствор глюкозы).
  7. Рост клеток на ночь на 30 ° C с постоянным перемешиванием (150 об/мин).
  8. На следующее утро, измерить ОД600, разбавить культуры ОД600 приблизительно 0,1 в 100 мл YPD среднего и пусть растут до OD600≈ 0.8.
  9. 100 мкл rapamycin культуре от Стоковый раствор 1 мг/мл (окончательный rapamycin концентрация составляет 1 мкг/мл) и пусть Инкубируйте на 30 ° C с постоянным перемешиванием на время, необходимое для протеина интереса к условно истощены от ядра (клетки как правило 30 мин адекватной). Для элемента управления используйте аналогичные культуры дрожжей, но вместо добавления rapamycin, добавьте эквивалентный объем диметилсульфоксида (ДМСО).

2. 4tU маркировки с S. pombe как Спайк в (подсчет)

  1. Готовить свежий раствор 2 M 4-thiouracil. После подготовки, держите его при комнатной температуре и вдали от света.
    1. Точно взвесить 64,1 мг 4-thiouracil для каждой культуры S. cerevisiae и растворить его в 250 мкл диметилформамида (DMF) или 250 мкл ДМСО.
    2. Для культуры S. pombe использоваться как Спайк в весят 320.5 мг 4-thiouracil и растворить его в 1250 мкл ДМСО.
  2. Добавьте решение 4-thiouracil S. cerevisiae и S. pombe культур для конечной концентрации 5 мм и инкубировать их за 6 мин с постоянным перемешиванием в 30 ° C до 32 ° C, соответственно.
  3. Через 6 мин удалите небольшой Алиготе каждой культуры для подсчета клеток. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматическое клеток или Нойбауэр камеры.
  4. Собрать клетки путем центрифугирования (2500 x g) за 5 мин при 4 ° C.
  5. Отбросить супернатанта, вымыть клетки с ледяной ПБС и снова центрифуги (2500 x g, 4 ° C, 5 мин).
  6. Рассчитайте общее количество клеток в каждом из образцов S. cerevisiae и S. pombe .
  7. Ресуспензируйте клетки в 5 мл ледяной ПБС и смешайте S. cerevisiae с S. pombe клетки с соотношении 3:1.
  8. Центрифуга клетки (2500 x g, 4 ° C, 5 мин), удалите PBS, флэш замораживание клеток в жидком N2и хранить образца при температуре-80 ° C до дальнейшего использования.

3. РНК добыча и обработка DNase

  1. Оттепель клетки на льду для приблизительно 20 – 30 мин.
  2. Продолжите извлечение RNA, с использованием дрожжей РНК добыча комплект (Таблица материалов) с несколько адаптаций.
  3. За каждого образца наливайте 750 мкл ледяной циркония бисера в 1,5 мл колпачок трубки поставляется с комплектом. Имейте в виду, что за каждой трубы, могут быть эффективно извлечены РНК от9 до 10 клеток. Следовательно Подготовьте количество трубок, необходимых для каждого образца. Например, S. cerevisiae культуры по 100 мл (OD600≈ 0,8) может оказать9 около 2 x 10-3 х 109 клеток, вплоть до в общей сложности 2,7 х 109 -4 x 109 клеток в общей сложности (после всплеска в треть S. pombe клетки). В этом случае будет потребоваться до 3-4 реакции трубок каждого образца/состояние/мутант/репликацию.
  4. За каждый 1 x 109 клеток добавьте 480 мкл буфера lysis, комплект, 48 мкл 10% SDS и 480 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта (25:24:1, v/v/v).
  5. Смешать ячейки, используя вихревой смеситель и перенести их в пробирки, содержащие ледяные шарики циркония.
  6. Размещения труб на вихревой смеситель адаптер, повернуть vortex на максимальной скорости и бить в течение 10 минут, чтобы лизировать клетки дрожжей (в комнате на 4 ° C). Кроме того выполните лизис клеток в автоматической шарик колотушки.
  7. Центрифуга для трубы на 16000 x g 5 мин при комнатной температуре и тщательно собирать Верхний этап (этап РНК содержащих) свежие 15 мл трубки сокола. Обычно, объем, восстановленные в каждую пробирку составляет около 500-600 мкл.
  8. Для 15 мл пробирки, содержащие частично очищенный РНК добавьте привязки буфер, предоставленный с комплектом и смесь тщательно. За каждый 100 мкл раствора РНК, мкл 350 привязки буфера (то есть, когда объем водной фазе раствора составляет 600 мкл, 2.1 мл буфера привязки должны быть добавлены).
  9. К предыдущей смеси добавить 100% этанола и тщательно перемешать. За каждый 100 мкл раствора РНК, мкл 235 100% этанола (то есть, когда объем водной фазе раствора составляет 600 мкл, добавить 1.41 мл этанола).
  10. Примените до 700 мкл в смеси с шагом 3,9 картриджа фильтра собранные в коллекции трубку, предоставлены в комплект.
  11. Центрифуги для 1 мин на 16000 x g. Если продолжительность центрифугирования не было достаточно для общего объема пройти через фильтр, повторите центрифугирования для 30 s.
  12. Отказаться от потока через и повторно же коллекции трубки. Добавьте еще 700 мкл RNA-связывая буфера этанола раствор для фильтрации и центрифугирования снова на 16000 x g за 1 мин.
  13. Отказаться от потока через и повторите шаги 3.11 и 3.12 до тех пор, пока раствор РНК закончена.
  14. Промойте фильтр 2 x с 700 мкл концентрированного моющего раствора 1. Собирать стиральной решение через центрифугирования в 16000 x g за 1 мин и всегда держать трубку коллекции.
  15. Промойте фильтр 2 x с 500 мкл концентрированного моющего раствора 2. Собирать стиральной решение через центрифугирования в 16000 x g за 1 мин и всегда держать трубку коллекции.
  16. Центрифуга трубы еще раз на 16000 x g за 1 мин до полностью высушите фильтр.
  17. Передать окончательный коллекции трубки (РНК соответствующие трубки) картриджа фильтра и элюировать РНК с 50 мкл DEPC-лечение, бесплатные РНКазы H2O (разогретую до 100 ° C).
  18. Центрифуги для 1 мин на 16000 x g.
  19. Элюировать РНК снова (чтобы же трубки) с 50 мкл разогретой DEPC-лечение, бесплатные РНКазы H2O. Убедитесь в том, что весь объем прошло через фильтр; в противном случае центрифуги для более длительных периодов.
  20. Если используются несколько трубок для одного единого образца, объединить их все в одной из труб.
  21. Количественно оценить и проверить чистоту образца с помощью соответствующего оборудования.
    Примечание: Хотя 4tU только включены в недавно синтезированных РНК, есть шанс мелкие загрязнения с ДНК. По этой причине, это всегда целесообразно рассматривать образцы с DNase I. Для этого используйте реагенты, РНК добыча комплект (Таблица материалов) следуя рекомендациям изготовителя.

4. тиоловых конкретных Biotinylation недавно синтезированных РНК

  1. Регулировка концентрации РНК, полученные с разделом 3 Протокола до 2 мг/мл. Аликвота 200 мкг всего РНК, тепло его на 10 мин при 60 ° C и сразу же охладить на льду на 2 мин.
  2. Для РНК Алиготе, добавьте реагентов, упомянутых ниже в следующем порядке: 600 мкл DEPC-лечение, бесплатные РНКазы H2O, 100 мкл буфера biotinylation (100 мм трис-HCl [pH 7.5] и 10 мм ЭДТА, в DEPC-лечение, RNase свободный H2O) и 200 мкл биотин HPDP от запас биотин HPDP 1 мг/мл в ДМСО или функцию DMF.
    1. В некоторых ситуациях биотин HPDP решение, как правило, осадок, вероятно из-за его низкой растворимостью в воде. В этой ситуации, увеличить объем ДМСО/DMF до 40% от объема реакции (на пример РНК, мкл 400 DEPC-лечение H2O, 100 мкл буфера biotinylation и 400 мкл биотин HPDP из запаса 0.5 мг/мл).
  3. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре и защищены от света для 3 h, с нежным агитации.
  4. После инкубации добавьте примерно равное количество метилхлороформа трубы и смесь энергично.
  5. Спиновые образца на 13 000 x g за 5 мин, при 4 ° C. Этот шаг позволяет удаление избыточного биотина, что сделал не biotinylate РНК. Кроме того выполните этот шаг, используя фазы lock трубы (тяжелый). Для этого спина вниз трубы упора фаза 1 мин на 13 000 x g, добавьте смесь РНК и равное количество метилхлороформа, смешать их энергично и центрифуги их на 13 000 x g за 5 мин, при 4 ° C.
  6. Тщательно перенесите Верхний этап в новые трубы 2 мл.
  7. Добавить одну десятую от объема 5 М NaCl и перемешайте образец.
  8. Добавить равное количество изопропиловый спирт, тщательно перемешать образца и спина его на 13 000 x g для по крайней мере 30 мин, при 4 ° C.
  9. Осторожно удалить супернатант и добавьте 1 mL ледяной 75% этанола.
  10. Спина на 13 000 x g за 10 мин., на 4 ° C.
  11. Тщательно удалите супернатанта, быстро спин трубки и остальные этанола раствор. Убедитесь, что гранулы РНК не сухой.
  12. Приостановить РНК в 100 мкл DEPC-лечение, бесплатные РНКазы H2O.

5. Очистка фракции заново синтезированные от всего и непомеченного РНК с помощью стрептавидина покрытием магнитные бусы

  1. Тепла биотинилированным РНК в течение 10 минут при температуре 65 ° C и затем охладить образцы на льду на 5 мин.
  2. Добавьте 100 мкл стрептавидина покрытием магнитные бусы биотинилированным РНК (на окончательный объем 200 мкл). В частности рекомендуется использовать бусы, указано в Таблице материалов, поскольку, после разговоров с другими лабораториями, эти, казалось, чтобы быть более последовательным и надежным.
  3. Инкубируйте образца с небольшой тряски 90 мин, при комнатной температуре.
  4. Разместите столбцы, комплект (Таблица материалов) в магнитного стенд.
  5. 900 мкл-комнатной Отмывающий буфер (100 мм трис-HCl [pH 7.5], ЭДТА 10 мм, 1 M NaCl и 0,1% Tween-20, в DEPC-лечение, RNase свободный H2O) со столбцами (предварительно запустить и сбалансировать).
  6. Применять смесь бусы/РНК (200 мкл) к столбцам.
  7. Сбор потока через в 1,5 мл пробирок и применить его вновь на один и тот же магнитный столбец. При необходимости, держите этот поток через, как он представляет собой немеченого фракция РНК.
  8. Вымойте колонки 5 x с увеличением объемов отмывающего буфера (600, 700, 800, 900 и 1000 мкл).
  9. Элюировать заново синтезированные РНК с 200 мкл 0,1 м DTT.
  10. Выполните второй элюции, 3 минуты позже, с равным объемом 0,1 М DTT.
  11. После элюирующие РНК, добавить 0,1 объема 3 M NaOAc (рН 5.2), 3 тома ледяной 100% этанола и 2 мкл 20 мг/мл гликогена (РНК класс) и пусть РНК осадка на ночь, при-20 ° C.
  12. Восстановить РНК путем центрифугирования (13 000 x g 10 минут, при температуре 4 ° C) и Ресуспензируйте в 15 мкл DEPC-лечение, бесплатные РНКазы H20. Ожидается, что доля РНК помечены всего около 2% - 4% (как правило, больше в нижнем конце), оказание около 2,0 мкг недавно синтезированных РНК. Этого количества достаточно, чтобы сделать несколько ПЦР экспериментов, а также для анализа microarray/последовательности.

6. RT-ПЦР проверки различных фракций

  1. Синтез cDNA от 2 мкг всего РНК или 10 мкл помечены РНК, с использованием случайных hexamers и обратная транскриптаза выбора, согласно инструкциям производителя (Таблица материалов).
  2. Увеличьте cDNA на ПЦР в реальном времени, используя стандартный протокол (Таблица материалов).
    Примечание: Все образцы должны выполняться в трех экземплярах из как минимум двух биологических реплицирует. Исправьте все необработанные значения для выражения тубулин S. pombe .

7. Microarray гибридизации

  1. Гибридизируйте образцов РНК на обломоки microarray предпочтительным согласно инструкциям производителя (для этого конкретного протокола, см. Таблицу материалы). Вкратце, подготовить биотинилированным cRNA цели от 150 нг РНК с помощью премьер комплекта амплификации РНК (Таблица материалов), согласно инструкциям производителя. Гибридизируйте 4 мг фрагментированных cRNAs для 16 h 45 ° c и 60 rpm на обломоки microarray.
  2. Вымойте, пятно и сканировать фишки, используя указанные станции и сканера (Таблица материалов). Извлечение исходных данных (CEL интенсивности файлов) из отсканированных изображений, с помощью командной консоли (AGCC, версия 4.1.2).
  3. Далее процесс CEL файлы с версией программного обеспечения консоли выражение 1.4.1 для вычисления зонда набор интенсивности сигнала, с использованием алгоритмов на основе статистики MAS 5.0 с параметрами по умолчанию и Глобальный Скейлинг как метод нормализации.
    Примечание: Подстриженные средний целевой интенсивности каждого чипа был произвольно равным 100. Выполнение всех экспериментов с использованием по крайней мере двух независимых биологических реплицирует. Нормализовать необработанные данные на S. pombe сигнал и рассчитать раза изменения уровня общей и заново синтезированные РНК.

8. анализ данных с помощью существующего трубопровода R

  1. Рассчитать синтеза и распада ставки с помощью конвейера и R/Bioconductor пакета публично доступны, как описано в8,10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

При выполнении метаболических маркировки недавно транскрипции РНК, некоторые аспекты необходимо контролировать: время и эффективности маркировки, Спайк в пропорции, извлечение протокола и biotinylation эффективности (включая соотношение сигнал шум), среди других. Эти усло...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В то время как генома общесистемной инструментов для анализа изменений в транскрипции по-прежнему улучшается, единственным анализ транскриптом путем количественной оценки устойчивого состояния уровня РНК не точно может отражать изменения РНК полимеразой II деятельности. Действитель...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Tora Ласло за его поддержку и V. Фишер, K. Schumacher и F. El Saafin для их обсуждения. Т.б. была поддержана Мари Кюри-ITN стипендий (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) и Фонд дуги. Эта работа была поддержана средств от Agence Nationale de la Recherche (АНР-15-CE11-0022 SAGA2). Это исследование было также поддержано АНР-10-LABX-0030-INRT, французский государственный фонд управляется Agence Nationale de la Recherche под рамки программы Investissements будущее АНР-10-IDEX-0002-02.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4-ThiouracilSigma-AldrichCat# 440736
RapamycinEuromedexCat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell CounterThermoFisherN/A
RiboPure RNA Purification kit, yeastThermoFisherCat# AM1926
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermoFisherND-2000
TURBO DNA-free KitThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotinThermoFisherCat# 21341
ThiolutinAbcamab143556
µMACS Streptavidin kitMiltenyi BiotecCat# 130-074-101
Transcriptor Reverse TranscriptaseRoche03 531 295 001
SYBR Green I MasterRoche4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Fluidics Station 450ThermoFisher00-0079
GeneChip Scanner 3000 7GThermoFisher00-0210

Ссылки

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857(2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741(2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822(2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140S cerevisiae4 thiouracilII

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены