利用数字图像分析系统测量草坪的茎和根状茎

摘要

基于软件的图像分析系统为研究石斑鱼和根状茎物种的形态提供了一种替代方法。该协议允许测量石子和根状茎的长度和直径, 并可应用于具有大量生物量的样品和种类繁多的物种。

摘要

石子或根状茎的长度和直径通常使用简单的标尺和卡钳进行测量。这个程序是缓慢和费力的, 所以它经常被用于有限数量的石子或根状茎。因此, 这些性状在植物形态表征中的用途有限。数字图像分析软件技术的使用可以克服人为错误造成的测量误差, 随着样本数量和尺寸的增加, 测量误差往往会增加。该协议可用于任何类型的作物, 但特别适用于饲料或草, 那里的植物很小, 很多。草坪样本包括地上生物量和上土层的最大根状茎发展的深度, 这取决于感兴趣的物种。在研究中, 样品从土壤中清洗, 用数字图像分析软件进行分析前手工清洗石柱。样品在实验室加热炉中进一步干燥, 以测量干重;因此, 对于每个样本, 生成的数据是总长度、总干重和平均直径。扫描的图像可以在分析前进行校正, 方法是排除可见的无关部分, 例如在清洗过程中未去除的剩余根或叶子。事实上, 这些碎片的直径通常比石柱或根状茎小得多, 因此, 通过确定不考虑物体的最小直径, 可以很容易地将它们排除在分析之外。然后, 可以根据样本大小计算单位面积的 stolon 或根茎密度。该方法的优点是快速有效地测量了大量石柱或根茎样本的长度和平均直径。

引言

植物形态学的研究主要涉及植物科学的所有学科, 包括生态学、农学、生物学和生理学。植物根系因其在耐压、土壤稳定性、植物生长和生产力等方面的重要性而得到广泛研究。茎石和根状茎在植物繁殖策略、恢复能力和碳水化合物储存中的作用也得到了广泛的研究。茎和根状茎是经修饰的茎, 水平生长, 无论是地面 (石石) 或地下 (根状茎)。茎和根状茎还包含正常间隔的节点和节间, 以及能够产生新的根和芽¹的分生节点。已经有大量的研究不同的主题, 调查根, 石棒和根状茎^的各种植物^{2,3, 4}, 5,^{6,7, 8}。研究了草坪的根系、茎和根状茎, 因为它们在草坪质量上的重要性^{分别为 9}、冬季休眠后的春季绿化¹⁰、穿着耐受性和调理能力¹¹。此外, 还在其他作物、水稻12、大豆⁴和玉米¹³等草皮和侧茎在土壤侵蚀控制中发挥关键作用的牧场5中对这些器官进行了研究.

根长度密度 (每个土壤体积的根长度) 和平均直径通常使用扫描软件^3,4,5^{,9,14, 15, 16,17,18}。相反, 石子或根状茎的长度和直径通常是用尺子和卡尺 3^,19,^{20 ,需要}大量的时间和劳动^21,22^,23,24. 因此, 它们往往是以数量有限的石子或根茎^{11、20、25 进行}测量的, 而且往往仅限于间隔植物的形态特征。对成熟树冠中的茎石和根状茎性状的研究涉及对大量生物量进行取样, 因此通常只测定茎和根茎干重密度 (每单位表面干重) 7^,11,26,27. 事实上, 通过在烤箱中干燥样品, 可以比茎长和直径更容易测量斯托龙干质量。然而, 石龙长度是一个重要的物种和品种特征, 与干质量没有很好的关系。最近一项关于蠕动多年生黑麦草 (lolium perenne) 的研究表明, 长的高石龙密度的样品不一定具有较高的石龙重量密度⁶。

图像分析系统使分析根系更快^28,29, 更准确, 更不容易人为错误 30, 21 比传统的手动方法^{31,32, 33}. 此外, 这些系统提供了高度灵活性和易于使用的工具, 包括光线、光学设置和分辨率, 这些工具通常针对每个扫描图像^进行校准34。pornaro等人²⁴证明 winrhizo 系统是专门为测量水根而设计的图像分析系统, 它可以通过克服目前的方法, 为更全面地分析茎和根茎性状提供一种替代方法。人为错误造成的测量误差。对于石龙和根茎生长的形态描述和定量信息, 图像分析系统可用于快速分析大量样本, 即使有大量的生物量, 从而提高统计精度。因此, 根分析软件包为研究不同植物品种24的石子和根状茎的生长和形态提供了一种替代的、可靠的、快速的方法。

本文在意大利东北部进行了一项实验, 研究了四个品种的茎龙和根茎的发育. 这项研究旨在增加对种子 ("lpaloma" 和 "ykon") 和植物品种 ("爱国者" 和 "tifway") 中石斑鱼和根状茎品种发育的了解。该试验于2013年5月建立, 每年在三个采样日期采集草皮样本, 从2013年3月到2015年夏季 (3月 (绿色上升前)、7月 (完整生长季节) 和 10月 (冬季休眠前)]。为了描述和解释这种方法, 我们使用了在第二个生长季节 (2014年7月) 夏季采集的样本, 因为此时样本的大量生物量证明需要进行快速分析。winrhizo 是专门为水根测量而设计的数字图像分析软件工具, 用于确定茎长密度和平均直径。

研究方案

1. 生物质样品的收集

1. 收集样本, 包括地上生物量和根据物种具有适当深度的土层 (对于草皮物种, 15 厘米深一般足够), 以确保收集石柱和根状茎。
   注: 在启动研究之前, 必须考虑整体地块大小, 因为将采集破坏性样本。一般来说, 实验进行的时间越长, 所需的绘图大小就越大。
2. 在采集样品之前检查土壤条件: 如果土壤太干燥, 特别是在土壤肥沃的土壤中, 可能很难采集样品。在这种情况下, 在收集之前对图进行灌溉, 以软化样品层。
3. 使用土芯取样器 (≥8厘米直径) 采集样品, 或定义用框架 (≥10 x 10 厘米) 收集的表面积, 并用铁锹采集样本。用实验室胶带标记每个样品。
4. 每块土地收集几个随机样本, 使它们代表植物种群。
5. 在整个实验中使用相同的采样器, 并记录每个样品所代表的面积, 以计算茎和根茎密度。
   注意: 该协议可以在这里暂停, 样品可以存放在塑料袋中, 并保存在-18°c 以下的温度下。

2. 清洁生物质样品

1. 根据茎或根状茎大小的不同, 将样品放在一个 0.5-1.5 mm 开口的大筛子中。开口应足够小, 以保留所有的石柱和根状茎, 但足够大, 可以去除土壤颗粒。对于沙质土壤, 两个不同开口的筛子, 一个放在另一个上面, 可以实现更好的精度和效率。
2. 用足够的能量清除样品, 以清除土壤颗粒, 而不会损坏植物。
3. 检索已清洗的样品, 并将其放入纸盒中, 并使用纸巾, 请注意适当地贴上托盘的标签。
   注意: 该协议可以在这里暂停, 样品可以存放在塑料袋中, 并保存在-18°c 以下的温度下。
4. 用剪刀去除根部和叶子, 进一步清洁样品。在此过程中, 如果需要, 将石子和根茎分开, 并记录每个植物的植物数量、分耕机和石子等其他信息。
   注意: 从茎和根状茎中去除所有的根和叶组织将提高精度。细根是很难去除的;但是, 通过数字图像分析, 可以使用软件应用程序将直径小于选定值的器官排除在外, 因为该方法是根据对图像的观察相当准确地定义的, 可以将其排除在分析之外在屏幕上复制。
5. 将石子和根状茎放入纸袋中。
   注意: 该协议可以在这里暂停, 样品可以存放在塑料袋中, 并保存在-18°c 以下的温度下。

3. 样品的扫描和图像分析

1. 将样品放在 winrhizo 标准扫描设备的透明塑料托盘上。使用实验室钳子手动放置石子和根状茎, 以最大限度地减少重叠。大型样本可能需要拆分为子样本。
2. 不要在托盘中加水 (建议为根部), 因为石柱和根状茎有足够的刚性, 以避免过度接近器官, 这可能会导致阅读错误, 这通常发生在精细的根。
3. 将纸盒放在扫描仪表面。
4. 打开扫描仪并开始运行该程序。
5. 在"图像" 菜单中检查图像 dpi , 命令图像获取参数, 以便在保存的图像中进行可能的进一步控制。
6. 检查 "分析" 中的阈值, 命令"根 & 背景区分", 以便对属于扫描器官的像素进行良好分类。
7. 检查是否将在 "图像" 菜单中扫描整个纸盒表面, 并命令"图像获取" 参数。
8. 检查在扫描图像上方的图形区域中显示的每个直径的器官分布的直径等级。通过单击图形的水平轴, 选择 20个 0.1 mm 间隔的等宽类。当石龙或根状茎没有得到完美清洗时, 这一功能允许排除属于根或小器官的数据。文献报道, 草皮品种的大多数根系直径低于0.2 毫米。
   注: 可以修改类别的宽度和数量, 同时考虑到所分析样本的石柱和根状茎的平均直径以及这一均值的变异性。应在某些样品中进行控制, 以确定要排除的最小直径。
9. 运行第一个示例扫描, 并检查编辑是否允许进行良好的分析。
10. 按照软件说明保存图像和进行了分析。使用示例标签对图像进行标记和分析。
11. 继续扫描所有样品。
    注意: 该协议可以在这里暂停, 样品可以存放在塑料袋中, 并保存在-18°c 以下的温度下。

4. 干重的测量

1. 使用精确的电子天平, 将扫描的样品放入一个经过说明的铝制托盘中。
2. 对所有扫描的示例重复步骤4.1。
3. 将所有样品放入设定在105°c 的烤箱中, 并将其干燥24小时。
4. 取出样本, 等待组织重量稳定。
5. 用他们的义务对所有的样品进行称重。
6. 从记录的重量中减去铁, 以获得每个样品的净重。

5. 数据校正和长度及重量密度的计算

1. 长度和平均直径的校正
   1. 将使用 winrhizo 进行分析后产生的. txt 文件转换为. csv 文件。
   2. 使用直径类分组的结果, 以排除小于 0.2 mm 的器官的数据 (根、叶子的一部分或托盘上的划痕)。
   3. 对于每个 winrhizo 读数 (行. txt 文件), 求和直径大于 0.2 mm 的直径类记录的所有长度。使用此校正计算的长度是用于进一步数据处理的有效长度。
   4. 对于每个 winrhizo 读数, 将直径超过0.2 毫米的投影面积相加。长度与投影面积的比例给出了除直径小于0.2 毫米的器官的平均直径校正方法。
2. 如果样品已拆分为子样本, 则将最终长度计算为所有子样本长度的总和, 并将最终平均直径计算为所有子样本长度之和与所有子样本投影区域之和之间的比例。
3. 必要时, 根据样本大小计算单位表面积的长度和重量密度。
4. 使用获得的数据进行统计分析。

结果

2013年秋建立了一个实地试验, 比较四个石斑鱼品种的茎和根茎发育情况, 其中包括两个种子品种 ("lpaloma" 和 "ykon") 和两个无菌植物杂交种 ("爱国者" 和 "tifway")。实验设计是一个随机的完整块, 有三个复制, 共12个地块 (2 x 2 米)。

从每个草坪类型的品种和野生石草中随机采集了14个石柱和14个根状茎, 并从在地块附近生长的野生黄花草植物中随机采集, 共有70个石柱和70个根状茎。在进一步测量之前, 所有的石沉岩和根状茎都按照协议 (步骤 2) 的描述进行了清洗。分别用卡尺和尺子测量节间直径和长度, 计算每个茎或根茎的节数。还记录了用尺子和卡尺清洗和测量茎和根状茎样品所需的时间。用所有节间直径的测量方法计算了 stolon 和根状茎直径。总茎长和总根茎长度计算为所有节间长度之和。此外, 使用数字图像分析系统测量了每个石沉结肠和根茎的总扫描长度和扫描直径, 如步骤3和5所述。记录了数字分析系统测量茎突和根茎性状所需的时间。然后用剪刀将每个茎和根状茎切割成节间, 并使用节间估计扫描的节点间直径, 如步骤3和5所述。在测量长度和扫描长度之间计算了皮尔逊和根状茎 (n = 70个石子, n = 70个根状茎)、测量和扫描的直径、节点数以及测量值与根状茎之间的绝对值差的绝对值。扫描直径, 测量直径和扫描节点间直径。用尺子测量的长度被用来校准通过数字图像分析系统估计的长度。

回归分析表明, stolon 扫描长度与测量长度之间存在高度相关性 (图 1a), 斜率为 1.03, 截距为-4.22, 根状茎扫描长度与测量长度 (图 1a) 之间,坡度为 1.03, 截距为4.22。手工清洁, 14个石龙和14个根状茎的平均时间分别为21分钟和24秒以及11分钟和12秒。用尺子和卡尺测量长度和直径的平均时间为14分钟和 6秒, 根状茎的平均时间为13分钟和35秒。使用 winrhizo 对样品进行扫描和软件分析, 平均为11分钟的石子, 12分钟和4分钟的根状茎。

测量和扫描的直径在石沉岩和根状茎中也有显著的相关性。测量直径与扫描直径之间的关系接近 1:1, 表明数据很适合 (图 2a和2a)。然而, 截取表明, 数字图像分析系统高估了测量直径, 特别是较低的值, 更高的根状茎直径值被低估。这种高估可能是由于软件扫描的 stolon 节点, 影响了用于计算直径的总投影表面 (总投影面与总长度之间的比率), 而是在测量时排除了这些节点。用卡钳做的两种方法 (测量和扫描) 获得的节点数与直径值之间的差异之间的相关性仅在石柱中显著 (图 3a);节点数量的变化只解释了这种差异变化的一小部分 (r² = 14%)。扫描的节间直径与测量直径之间存在显著相关性 (石柱和根状茎的坡度分别为1.01 和 0.98; 截获量接近零) (图 4a和4a) 表明节间直径只要删除节点, 就可以通过数字图像分析系统进行准确的估计。因此, 使用数字图像分析系统可以方便、准确地量化由大量石柱或根茎组成的样品的总石沉量和平均直径。

作为正在进行的实验的一部分, 从2013年秋季到2015年夏季, 在每个地块上季节性收集了一个草皮样本 (20 x 20 x 15 厘米深度), 并按照议定书的说明进行处理。图 5显示了2014年7月采集的样本单位表面积 (长度密度) 和单位表面积重量 (重量密度)。在植物繁殖的品种 ("爱国者" 和 "tifway") 和种子品种 ("la paloma" 和 "y空 kon") 之间观察到了石沉旅馆长度密度的差异。"爱国者" 显示出最高的根状茎长度密度, 其次是 "tifway" 和种子品种。所有品种的石质重量密度不同, "爱国者" 的价值最高, 其次是 "tifway"、"la paloma" 和 "ykon"。植物繁殖品种的根状茎重量密度也高于种子品种。图 6报告了在整个研究期间, 每单位表面积 (长度密度) 和单位表面积重量 (重量密度) 的发展情况。stolon 长度密度在2014年3月至2014年7月期间有所增加, 2014年7月至2015年7月没有变化。在2013年10月和2014年3月采集的样本中只发现了少数根状茎。根状茎长度密度在2104年7月增加, 达到最高值, 但在2014年10月再次下降。2014年3月至7月, 斯托龙重量密度略有增加;然而, 2014年7月至10月的增幅较快, 随后于2015年3月有所下降。根状茎重量密度与根状茎长度密度有类似的趋势, 2014年7月的最高值。

该软件包括在分析中扫描的图像中的所有对象。下面介绍了 winrhizo 软件的数字图像分析布局示例 (图 7), 其中不同颜色叠加对象 (石柱) 的线具有不同的直径, 用于计算每个直径类的总长度。我们可以观察到, 分析考虑到了根或叶的碎片。如步骤3.9 中所述, 可以限制所分析的直径类的宽度和数量。直方图显示长度分布到选定的直径类别中 (图 7)。此直方图可用于评估要排除的最小直径类。在屏幕图像的上半部分, 对此图的可视观察突出显示, 长度在平均直径类周围有正态分布, 但前两个类显示的值高于与适合法线的类的类除外分布。即使样品经过仔细清洁, 包括这些较小的类别, 数据分析也可能会影响结果, 高估长度密度, 低估平均直径。结果表明, 较小类别 (直径 < 0.2 mm) 的长度占软件分析得出的根状茎总长度值的 13-32 (表 1)。此外, 平均直径从2-17 被低估 (表 1)。

图 1: 用尺子测量长度值的回归分析, 与黑木草石根数字图像分析系统^估计的数值进行回归分析 24 (a) 和) 根状茎 (b).虚线表示1:1 的比率。a 小组已从 pornaro等人修改.²⁴.请点击此处查看此图的较大版本.

图 2: 用卡尺测量的直径值的回归分析, 与使用 bermudagrass 石柱 24 (a) 和根状茎 ( b) 的数字图像分析系统估计的值进行回归分析.虚线表示1:1 的比率。a 小组已从 pornaro等人修改.²⁴.请点击此处查看此图的较大版本.

图 3: 对 bermudagr字号 24 (a) 和根状茎 ( b) 节点数的回归分析, 相对于数字图像分析系统估计的直径之间的绝对值进行回归分析, 并用卡尺测量.虚线表示1:1 的比率。a 小组已从 pornaro等人修改.²⁴.请点击此处查看此图的较大版本.

图 4: 仅对节间的 bermudagrass 石柱 24 (a) 和根状茎 (b) 的数字图像分析系统估计的直径值进行回归分析.虚线表示1:1 的比率。a 小组已从 pornaro等人修改.²⁴.请点击此处查看此图的较大版本.

图 5: 对四个草坪草 (爱国者、蒂夫威、拉帕洛马、育空) 进行实地试验的石柱和根茎长度和重量密度的实例.茎长密度 (a)、根状茎长度密度 (b)、茎重密度 (c) 和根状茎重量密度 (d)。垂直条表示六个复制的标准错误。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6: 石柱和根状茎的长度和重量密度的结果, 从一个实地试验显示石斑鱼和根状茎的发展的马库马田品种.茎长密度 (a)、根状茎长度密度 (b)、茎重密度 (c) 和根状茎重量密度 (d)。垂直条表示六个复制的标准错误。请点击这里查看此图的较大版本.

图 7: 来自 winrhizo 软件的数字图像分析示例布局.前景中的扫描图像和屏幕图像上半部分的条形图显示选定直径类的长度分布。彩色线条表示图像分析, 每种颜色对应于条形图中报告的直径类的颜色。请点击这里查看此图的较大版本.

品种	块	根状茎长度 (2)			平均直径 (毫米)
		< 0.2 毫米	总	比a	< 0.2 毫米	总	比例b
爱国者	1	231	278	16。9	1.6 37846	1.5994	97。7
爱国者	2	304	349	12。8	1.6 20667	1.588371	98。0
爱国者	3个	304	366	16。8	1.649918	1.6 21367	98。3
蒂夫威	1	184	231	20。6	2.149745	1.9951	92。8
蒂夫威	2	155	193	19。9	1.8 66253	1.76605	94。6
蒂夫威	3个	119	150人	20。9	1.8 77386	1.75865	93。7
拉帕洛马	1	17	23	24。4	2.139019	1.8904	88。4
拉帕洛马	2	26	38	31。6	2.101385	1.7455	83。1
拉帕洛马	3个	34	47	27。5	2.033729	1.7354	85。3
育 空	1	32	44	28。0	1.77 00155	1.4945	87。9
育 空	2	17	25	33。2	1.68 339	1.4 284	84。9
育 空	3个	67	87	23。6	1.844721	1.6774	90。9
a类的长度≤0.2 mm/total
b类总直径直径≤0.2 mm

表 1: 根状茎长度密度和根状茎平均直径, 直径较小和没有较小的直径类别.长度密度, 包括直径小于0.2 毫米的直径类及其比率 (类的长度≤0.2 mm/total 长度);和平均直径, 包括直径小于0.2 毫米的直径等级和直径 (直径包括 0.2/直径 <, 不包括直径类别 < 0.2 毫米)。

讨论

本文为草坪草的研究开发和评价了该方案。然而, 它可以用于一系列的石炭纪或根状茎物种, 并根据其形态特征、环境条件和样品清洗精度进行必要的调整。

该协议估计的平均直径不能与用卡尺测量的节间直径进行比较。数字图像分析包括平均直径计算中的节点和节点间, 即总投影面与总长度的比率。正如 pornaro等人所讨论的那样.²⁴、winr拉斯系统的石草石子的平均直径高估了节点间的卡尺测量的平均直径值。stolon 直径通常用于描述 stolon 节间的直径, 是植物学描述 18^,25的常用参数。为此, pornaro等人.²⁴指出, 通过 winrhizo 系统估计的平均直径和手工测量的节间直径描述了两个不同的形态方面。

执行此协议所需的时间仍然是常规分析的限制因素。最耗时的阶段是样品的清洁 (步骤 2.4)。根据我们的经验, 清洁一个含有大量生物量 (即20 x 20 厘米) 的草皮样本需要大约3人工作2至4小时。如协议所述, 无论是数字分析系统还是使用卡尺和标尺时, 清洗过程都是必要的。当样本由数量有限的石草根组成时, 用这两种方法收集数据所需的时间是相似的。但是, 随着样本大小的增加, 基于软件的方法不会有后续的时间增加, 因为唯一的限制因素是扫描仪的表面积。相反, 用尺子和卡钳测量器官所需的时间随着组成样本的石子或根状茎的数量而增加。

成熟草坪上的茎石和根状茎性状的研究一直是基于节点间长、^直径和质量^{干重 7、11、26、27 的}测量。由于处理样品所需的时间很长, 而且随着样品尺寸的增加, 精度降低, 人工测量应限制在少量的石子或根茎^11、20、25。因此, 它们可能只适合单株实验。与传统方法相比, 图像分析系统的优点是可以测量大的茎石或根茎样品的长度, 计算长度密度和比 (重量长度比)。

该协议允许测量大生物量样品中的茎长和根茎长度, 并计算长度密度 (其中的茎龙或根茎重量是目前用于形态学描述的唯一参数)。在许多研究中, stolon 和/或根状茎长度可能是一个重要的参数, 不能用目前的技术来估计。最近对不同草皮品种⁶的研究表明, 茎重和长度密度并不总是相关的, 这表明测量多个参数以充分评估茎子和根状茎系统可能是可取的。该方法应特别适用于品种或文化管理实践的比较。

该协议中的几个步骤对于成功估计石柱和根状茎的长度和平均直径至关重要。由于植物形态在不同环境条件下的高度变异性, 应仔细评估应取样的样品数量 (样本大小) 和地面面积尺寸 (样本尺寸), 并尽可能具有代表性。以减少数据的可变性。此外, 在分析之前清理石子上的根部和叶子是细致的工作, 需要特别注意, 以避免过度估计。最后, 在处理图像之前, 建议使用软件选项仔细选择直径等级和最小直径的宽度, 以便从分析中排除所有不是石头或根茎的内容。每项试验都需要选择最小直径, 因为直径因物种和环境条件而异, 包括文化习俗。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
laboratory tape	Any	NA	Tags may be used to label samples
plastic bags	Any	NA	Any plastic bag can be used to keep samples until they have been cleened
paper bags	Any	NA	Any paper bag can be used to keep cleaned samples to avoid mold formation
paper towels	Any	NA	After samples have been washed with water and before to clean them with scissors it is helpful to put them on a paper towel to absorb water
scissor	Any	NA	Any scissor with fine tips
aluminium box	Any	NA	Any aluminium box large enough to contain the sample
trays	Any	NA	It is helpful to use plastic tray to hold samples during the cleaning process
sieve with 0.5-1.5 mm openings	Any	NA	Any sieve
soil core sampler	Any	NA	We use core sampler for soil collection with diameter of at least 8 cm
squared frame	Any	NA	To collect large samples we use squared frame (10 x 10 cm, or 15 x 15 cm, or 20 x 20 cm)
spade	Any	NA	We use spade to pull out samples delimited with squared frame
precision electronic balance	Any	NA	Any precision electronic balance
laboratory oven	Any	NA	Any laboratory oven
freezer	Any	NA	Any freezer
WinRHIZO software	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	Excluded the "basic" version
WinRHIZO scanner	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	WinRHIZO system includes a scanner calibrated for the software
WinRHIZO scanner accessories	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	WinRHIZO system includes accessories, as plastic tray and positioner, to be used with the scanner