מדידת Stolons המלבלבים של Turfgrasses באמצעות מערכת ניתוח תמונה דיגיטלי

Summary

מערכת ניתוח תמונה המבוססת על תוכנה מספק שיטה חלופית ללמוד המורפולוגיה של מינים stoloniferous rhizomatous. פרוטוקול זה מאפשר מדידה של קוטר של stolons ושל המלבלבים לאורכה, יכול להיות מיושם דגימות עם כמות גדולה של ביומסה, מגוון רחב של מינים.

Abstract

אורך וקוטר stolons או המלבלבים נמדדים בדרך כלל באמצעות סרגלים פשוטה מחוגה. הליך זה הוא איטי ולא מייגעת, כך זה משמש לעתים קרובות על מספר מוגבל של stolons או המלבלבים. מסיבה זו, תכונות אלה מוגבלים בשימוש שלהם לצורך אפיון מורפולוגי של צמחים. השימוש בטכנולוגיה תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלי עלול להתגבר על שגיאות מדידה עקב טעויות אנוש, אשר נוטים להגדיל גם המספר והגודל של דגימות גם להגדיל. הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל סוג של חיתוך אבל זה מתאים במיוחד עבור מזון או עשבים, שבו צמחים קטנים ורבים. השטח דוגמאות מורכבות של ביומסה מעל פני הקרקע, שכבת הקרקע העליונה לעומק של התפתחות קנה שורש מרבי, בהתאם למין עניין. במחקרים, דגימות נשטפים מן האדמה, stolons/המלבלבים מנוקים באופן ידני לפני ניתוח על-ידי תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית. הדוגמאות עוברות ייבוש נוסף במעבדה חימום תנור למדידת משקל יבש; לכן, עבור כל דגימה, הנתונים הנובעת הן האורך הכולל, משקל יבש סך קוטר ממוצע. ניתן לתקן תמונות שנסרקו לפני הניתוח על ידי למעט חלקים שאינם שייכים גלויים, כגון הנותרים שורשים או עלים לא יוסרו עם תהליך ניקוי. אכן, קטעים אלה בדרך כלל יש קטרים הרבה יותר קטן מאשר stolons או המלבלבים, כך שהם יכולים בקלות לא ייכללו ניתוח על ידי תיקון הקוטר המינימלי שמתחתיו לא נחשבים לאובייקטים. Stolon או קנה שורש צפיפות ליחידת שטח ואז ניתן לחשב בהתבסס על גודל המדגם. היתרון של שיטה זו הוא מהיר ויעיל במדידת קוטר ממוצע של המספרים גדולים דוגמת stolons או המלבלבים לאורכה.

Introduction

המחקר מורפולוגיה של הצמח מופנית בעיקר בכל התחומים של המדע צמחים כולל אקולוגיה, גידולי שדה, ביולוגיה, פיזיולוגיה. מערכת השורשים של הצמח הוא נרחב למד במשך חשיבותה מתח סובלנות, יציבות הקרקע, צימוח, ואת הפרודוקטיביות. Stolons, המלבלבים נלמדים גם נרחב על התפקיד שמילאו צמח בעת הפצת אסטרטגיות, יכולת שכעבור ואחסון פחמימות. Stolons המלבלבים הם גבעולים ששונה לגדול בצורה אופקית, או מעל הקרקע (stolons) או (המלבלבים) מתחת לקרקע. Stolons, המלבלבים גם להכיל צמתים המרווחות באופן קבוע, פרקי הגבעולים, כמו גם צמתי meristematic המסוגלים והוליד שורשים חדשים ויורה¹. היו מספר רחב של מחקרים בנושאים שונים, חוקר שורשים stolons, המלבלבים של מגוון צמחים^{2,3,4,5,6,7, 8}. מערכות שורשים stolons, המלבלבים של turfgrasses נלמדים בגלל חשיבותן איכות הדשא⁹, אביב ירוק-up לאחר החורף תרדמה¹⁰, ועל סובלנות ללבוש יכולת שכעבור¹¹. יתר על כן, האיברים האלה נלמדים גם גידולים אחרים, turfgrasses כגון אורז¹², סויה⁴, ו תירס¹³מרעה שבו נובעת לרוחב לשחק תפקיד מפתח אדמת הסחף בקרה⁵.

צפיפות אורך הבסיס (אורך הבסיס לכל אמצעי אחסון קרקע), קוטר ממוצע בדרך כלל נמדדים באמצעות סריקה תוכנות^{3,4,5,9,14,15, 16,17,18}. לעומת זאת, בקוטר של stolons או המלבלבים לאורכה נמדדים בדרך כלל עם סרגל caliper^3,19,20 , דורש זמן ניכר ואת העבודה^{21,22 , 23 , 24}. לפיכך, הם נמדדים לעתים קרובות במספר מוגבל של stolons או המלבלבים^11,20,25 , מוגבלים אפיון מורפולוגי של צמחים במרווחים רק לעיתים קרובות. המחקר של תכונות stolon, קנה שורש בחופה בוגרת כרוך דגימה כמות גדולה של ביומסה כך בדרך כלל רק stolon ולא קנה שורש משקל יבש צפיפות (משקל יבש לכל יחידת השטח) הם נחושים^{7,11, 26 , 27}. מסה יבש stolon, למעשה, יכול להיות נמדד בקלות רבה יותר מאשר אורך stolon, קוטר ע י ייבוש דגימות בתנור. עם זאת, אורך stolon הוא מינים חשובים אחרים תו שאינו קשורות היטב למיסה יבש. מחקר שנערך לאחרונה על זוחל רב-שנתי ryegrass (perenne זון) הוכיח כי דגימות עם צפיפות אורך stolon גבוהה לא היה בהכרח צפיפות משקל גבוה stolon⁶.

תמונות-ניתוח מערכות לבצע הניתוח של שורשים מהיר^28,29, מדויקת יותר, ונוטים פחות טעויות אנוש^30,21 מאשר בשיטות מסורתיות, ידני^{31,32, 33}. יתר על כן, מערכות אלו מספקים flexibility גבוהה, כלי קל לשימוש כולל את האור, אופטי הקמה ברזולוציה, אשר לעיתים קרובות מכוילים עבור כל סריקה תמונה³⁴. . Pornaro et al. ²⁴ הדגימו כי מערכת WinRHIZO, מערכת ניתוח התמונה שתוכננה במיוחד עבור מדידת שטף שורשים, עשוי לספק שיטה חלופית כדי לנתח תכונות stolon, קנה שורש מלא יותר שיטות הנוכחי על ידי התגברות שגיאות המדידה הנגרמת על ידי טעויות אנוש. תיאור מורפולוגי, מידע כמותי על צמיחה stolon, קנה שורש, התמונה-ניתוח מערכות ניתן לנתח מספר רב של דוגמאות במהירות, אפילו עם כמות גדולה של ביומסה, המאפשר דיוק סטטיסטי מוגברת. לכן, חבילות תוכנה ניתוח שורש לספק חלופה אמינה ומהירה בשיטת ללמוד את הצמיחה ואת המורפולוגיה של stolons ו המלבלבים של מינים של צמחים שונים²⁴.

אנו מציגים ניסוי ביצעו בצפון מזרח איטליה ללמוד stolon והתפתחות קנה שורש של ארבעת הזנים של bermudagrass (spp.יבלית ). המחקר להגברת הידע על הפיתוח של stolons ושל המלבלבים הזריעה ("LaPaloma" ו "יוקון") ואת הזנים וגטטיבי ("פטריוט" ו- "Tifway") של bermudagrass. הניסוי הוקמה בשנת 2013 מאי, ואת השטח דגימות נאספו מעל שלושה דייטים דגימה בשנה, מ סתיו 2013 לקיץ שנת 2015 [March (לפני למעלה ירוק), יולי (העונה הגוברת מלאה) ואוקטובר (לפני החורף תרדמה)]. עבור תיאור והסבר של שיטה זו, השתמשנו הדגימות שנאספו בקיץ של עונת הצמיחה השנייה (יולי 2014), כפי ביומסה גדול של הדגימות בשלב זה מוצדק לצורך ניתוח מהיר. WinRHIZO, כלי תוכנה וניתוח תמונות דיגיטלי שתוכנן במיוחד עבור מדידות שורש שטף, שימש לקביעת צפיפות אורך stolon, קוטר ממוצע.

Protocol

1. אוסף של דוגמאות ביומסה

1. לאסוף דגימות ביומסה מעל פני הקרקע כולל שכבת אדמה בעלי המתאים בהתאם מינים (עבור השטח מינים, עומק 15 ס מ יספיקו בדרך כלל) כדי להבטיח אוסף של stolons והן המלבלבים.
   הערה: באופן כללי גודל מגרש יש לקחת בחשבון לפני ייזום המחקר, מאז דגימות הרסני יילקחו. באופן כללי, ככל הניסוי שנערך, גדול יותר גודל מגרש הנדרש.
2. לבדוק בתנאי קרקע לפני איסוף הדגימה: אם האדמה יבשה מדי, בעיקר בקרקעות כבדות, ייתכן שתתקשה לאסוף דגימות. במקרה זה, להשקיית החלקות לפני אוסף כדי לרכך את דגימת השכבות.
3. לאסוף דגימות באמצעות דוגמאות הליבה אדמה (≥ 8 ס"מ קוטר) או להגדיר את פני השטח כדי לאסוף עם מסגרת (≥ 10 x 10 ס מ), ולאסוף הדגימות עם בשמו. תווית כל דגימה עם קלטת מעבדה.
4. לאסוף דוגמאות אקראי לכל מגרש ולכן הם מייצג של האוכלוסייה הצמח.
5. השתמש את הדוגם אותו על הניסוי כולו ולהקליט את השטח שמייצג כל מדגם לחישוב הצפיפות stolon, קנה שורש.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, הדגימות ניתן לאחסן בשקיות פלסטיק, נשמר בטמפרטורה פחות מ-18 ° C.

2. ניקוי ביומסה דגימות

1. מקם את הדגימה בתוך מסננת גדולה עם 0.5-1.5 מ מ פתחים בהתאם לגודל stolon או קנה שורש. הפתחים צריך להיות קטן מספיק כדי לשמור על כל stolons, המלבלבים, אך גדול מספיק כדי לאפשר חלקיקי הקרקע יוסרו. עבור חולי בנוטריינטים, שתי הנפות עם פתחים שונים, מניחים אחד השני, עשוי לאפשר דיוק ויעילות יותר.
2. לנקות את הדגימות עם זרם מים עם מספיק כוח כדי להסיר חלקיקי קרקע מבלי להזיק לצמחים.
3. אחזר את הדגימות נקי ומניחים במגש עם מגבות נייר, מטפל לתייג את המגשים כראוי.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, הדגימות ניתן לאחסן בשקיות פלסטיק, נשמר בטמפרטורה פחות מ-18 ° C.
4. עוד יותר לנקות את הדוגמאות על-ידי הסרת שורשים ועלים עם מספריים. במהלך תהליך זה, נפרדים stolons, המלבלבים, במידת הצורך, לתעד מידע נוסף כגון המספרים של צמחים, עובדי stolons לכל צמח.
   הערה: הסרת רקמת השורש ועלה כל stolons ו המלבלבים תוכלו לשפר דיוק. בסדר. השורשים קשה להסיר; עם זאת, באמצעות הניתוח של תמונה דיגיטלית, זה ניתן להשמיט אותם מן הניתוח באמצעות יישום תוכנה שתואמות איברים בקוטר פחות ערך שבחרת (ראה שלב 5.1), וזה מוגדר די במדויק על בסיס תצפיות של תמונות מרובה על המסך.
5. Stolons מקום, המלבלבים בעיתון בתווית שקיות.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, הדגימות ניתן לאחסן בשקיות פלסטיק, נשמר בטמפרטורה פחות מ-18 ° C.

3. סריקה של ניתוח דוגמאות של תמונה

1. מניחים את הדגימה על מגש פלסטיק שקוף של תקן WinRHIZO ציוד סריקת. שאמקם את stolons ואת המלבלבים באמצעות מלקחיים מעבדה כדי למזער חפיפה. דגימות גדולות ייתכן שיהיה צורך לפצלה ל- subsamples.
2. לא להוסיף מים למגש (כפי מומלצת שורשים), מכיוון של stolons ושל המלבלבים קשיחות מספיק כדי למנוע קרבה מוגזמת של איברים אשר עלולה לגרום לשגיאות קריאה, וזה קורה בדרך כלל עם שורשים בסדר.
3. מניחים את המגש על משטח הסורק.
4. הפעל את הסורק ולהתחיל הפעלת התוכנית.
5. בדוק dpi תמונה בתפריט תמונה , הפקודה תמונה רכישה פרמטר, עבור פקד נוסף אפשרי בתוך התמונה.
6. בדוק הסף ניתוח, הפקודה Root & רקע ההבחנה, לסיווג טוב של פיקסל השייכים האברים שנסרקו.
7. בדוק כי השטח כל המגש ייסרקו בתפריט תמונה , הפקודה תמונה רכישה פרמטר.
8. בדוק קוטר הכיתה מוצג להפצה האיברים לפי קוטר, באזור גרפי שמעל התמונה הסרוקה. בחר מחלקות שוות ברוחב 20 עם מרווחי 0.1 מ מ על-ידי לחיצה על הציר האופקי של הגרף. פונקציה זו מאפשרת הדרה של הנתונים השייכים שורשים או איברים קטנים, כאשר stolons או המלבלבים היו לא לגמרי נקיות. בספרות מדווח כי רוב שורשי הדשא מינים יש קטרים נמוך מ 0.2 מ מ.
   הערה: רוחב ומספר מחלקות ניתן לשנות תוך התחשבות קוטר ממוצע של stolons ושל המלבלבים עבור השתנות סביב זה אומר ודוגמאות שנותחה. פקד צריך לנהל כמה דוגמאות כדי לקבוע את הקוטר המינימלי ייכללו.
9. הפעל את הסריקה המדגם הראשון וסמנו כי העריכה מאפשר למנתח טוב.
10. בצע את ההוראות תוכנה עבור שמירת התמונה, עיבוד ניתוח. תווית את התמונה ואת ניתוח עם התווית הדגימה.
11. להמשיך עם סריקה של כל הדגימות.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, הדגימות ניתן לאחסן בשקיות פלסטיק, נשמר בטמפרטורה פחות מ-18 ° C.

4. מדידת משקל יבש

1. באמצעות איזון אלקטרוני מדויק, למקם את הדגימות סרוקים מגש אלומיניום tared.
2. חזור על שלב 4.1 עבור כל הדגימות שנסרקו.
3. הכנס כל הדגימות לתוך תנור מוגדר 105 ° C, לייבש אותם במשך 24 שעות ביממה.
4. הסר את הדגימות והמתן עד משקל הרקמה התייצב.
5. שוקלים את כל הדגימות עם טרה שלהם.
6. להחסיר טרה ממשקל מוקלטות כדי להשיג את המשקל נטו של כל דגימה.

5. תיקון של נתונים, חישוב של אורך וצפיפות משקל

1. תיקון של האורך ואת קוטר בממוצע
   1. המרת הקובץ. txt המתבררת מניתוח עם WinRHIZO לקובץ csv.
   2. להשתמש בתוצאות מקובצות לקורסים קוטר כדי לא לכלול נתונים של איברים קטן מ- 0.2 מ מ (שורשים, עלים, או שריטות על המגש).
   3. עבור כל WinRHIZO (שורות של קובץ. txt) סכום קוראת כל אורך נרשם לקורסים בקוטר גדול מ- 0.2 מ מ. אורך מחושב עם תיקון זה הוא האורך יעיל כדי לשמש לעיבוד מידע נוסף.
   4. כל קריאה WinRHIZO, סכום האזורים הקרנה הקליטה עבור קוטר כיתות יותר מ- 0.2 מ מ. היחס בין אורך ואזור הקרנה נותן את קוטר ממוצע מתוקנות על אי-הכללה של איברים עם קטרים פחות מ 0.2 מ מ.
2. אם המדגם התפצל subsamples, לחשב את האורך הסופי כסכום של כל אורכי subsample ולא לחשב את הקוטר הממוצע הסופי כמו היחס בין סכום אורכי subsample כל סכום בכל התחומים הקרנה subsample.
3. בעת הצורך, לחשב את אורך ומשקל הצפיפות ליחידת שטח משטח בהתבסס על גודל המדגם.
4. להשתמש על נתונים שהושגו לשם ניתוח סטטיסטי.

תוצאות

ניסוי שדה הוקמה סתיו 2013 להשוות stolon והתפתחות קנה שורש של ארבעת הזנים bermudagrass, כולל שני סוגי הזריעה ("LaPaloma" ו- "יוקון"), שני כלאיים וגטטיבי סטרילי ("פטריוט" ו- "Tifway"). הנבחנים היה בלוק שלם אקראי עם שכפולי שלוש, עבור סכום כולל של 12 מגרשים (2 x 2 מ').

Stolons ארבע עשרה, ארבע עשרה המלבלבים לדבורי כל סוג הדשא, את bermudagrass פראי שנאספו באקראי החלקות, כמו גם מצמחים bermudagrass פראי גדל ליד החלקות, עבור סכום כולל של 70 stolons ו 70 המלבלבים. Stolons וכל המלבלבים נוקו כמפורט בפרוטוקול (שלב 2) לפני עוד מדידה. Internode קוטר ואורך נמדדו עם קליבר, שליט, בהתאמה, נספר מספר הצמתים עבור כל stolon או קנה שורש. הזמנים הנחוצים לנקות ולמדוד את דגימות stolon קנה שורש עם סרגל, caliper נרשמו גם. קטרים stolon, קנה שורש חושבו כאמצעי כל קטרים internode נמדד. Stolon סה כ ו קנה שורש הכולל אורכי חושבו כסכום של כל אורכי internode. יתר על כן, סה כ שנסרקו אורכים, קטרים סרוקים של כל stolon וכל קנה שורש נמדדו באמצעות מערכת ניתוח תמונה דיגיטלי, כפי שתואר בשלבים 3 ו- 5. הזמן הדרוש כדי למדוד תכונות stolon, קנה שורש על ידי מערכת ניתוח דיגיטלי נרשמו. כל stolon וכל קנה שורש ואז נחתכו עם מספריים כדי להפריד בין פרקי הגבעולים מצמתים, פרקי הגבעולים שימשו כדי להעריך את הקוטר שנסרק internode כמתואר בשלבים 3 ו- 5. מקדמי המתאם של פירסון חושבו עבור stolons ו המלבלבים (n = 70 stolons, n = המלבלבים 70) בין נמדד שנסרקו אורכים, ולא שנסרקו קטרים, מספר צמתים ואת הערך המוחלט של ההבדל בין נמדד ו קטרים סרוקים, קטרים נמדד, קטרים internode שנסרקו. המרחק נמדד עם הסרגל שימשו כדי לכייל את אורך משוער דרך מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית.

ניתוח רגרסיה המצוין מתאם גבוה בין אורך stolon שנסרקו נמדד אורך (איור 1 א'), עם מדרון של 1.03 וחיתוך של-4.22, כמו גם בין אורך קנה שורש שנסרקו נמדד אורך (איור 1b), עם השיפוע של 1.03 וחיתוך של 4.22. ניקוי בעבודת יד, 14 stolons, 14 המלבלבים לקחו זמן ממוצע של 21 דקות ו 24 s ו 11 דקות ו-12 s, בהתאמה. הזמן הממוצע כדי למדוד אורך קוטר עם סרגל, caliper היה 14 דקות ו- 6 s עבור stolons ו- 13 דקות ו-35 s עבור המלבלבים. ניתוח סריקה של התוכנה של דגימות באמצעות WinRHIZO לקח בממוצע 11 דקות עבור stolons ו- 12 דקות ו- 4 s עבור המלבלבים.

נמדד, קטרים סרוקים היו בקורלציה משמעותי גם הן stolons והן המלבלבים. קשרי הגומלין בין קוטר נמדד וסקר היו קרוב ל- 1:1, המציין התאמה טובה של הנתונים (איור 2a ו- 2b). עם זאת, החיתוך ציין כי מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית הפרזתי נמדד קוטר, במיוחד עבור ערכים נמוכים יותר, ולא ערכים גבוהים יותר מקוטר קנה שורש היו ממעיט. מופרזת זה יכול להיות בגלל צמתי stolon נסרקים על-ידי התוכנה, המשפיעים על פני השטח הכולל היטל המשמש לחישוב קוטר (יחס בין משטח ההקרנה סה כ סה כ אורך), ולא במקום אינם נכללים בשעת מדידות עשוי caliper. המתאם בין מספר הצמתים ההבדל בין ערכים קוטר מתקבל על ידי שתי השיטות (נמדד וייסרק) היה משמעותי רק ב stolons (איור 3 א); בנוסף, בווריאציות מספר הצמתים הסביר רק חלק קטן הווריאציות של ההבדל הזה (R² = 14%). המתאם משמעותיים נמצאו בין שנסרקו internode קוטר, נמדד קוטר (מדרונות 1.01 0.98 stolons, המלבלבים, בהתאמה; יירוטים של כמעט אפס) (איור 4a , 4b) מדגים את קוטר internode יכול להיות במדויק מוערך באמצעות מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית כל עוד צמתים יוסרו. לכן, קוטר אורך וממוצע stolon הכולל של דגימות הולחן על ידי רבים stolons או המלבלבים ניתן בקלות ובדייקנות לכמת באמצעות מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית.

במסגרת ניסוי מתמשך, דוגמא אחת השטח (20 x 20 x 15 ס מ עומק) נאספה כל מגרש עונתיות מ סתיו 2013 לקיץ 2015, טופלה כמפורט בפרוטוקול. לאורך stolon, קנה שורש לכל יחידת שטח (אורך צפיפות), משקל לכל יחידת שטח (צפיפות משקל) של הדגימות שנאספו יולי 2014 מוצגים באיור5. הבדלים בצפיפות אורך stolon נצפו בין הזנים וגטטיבית שעבר בירושה ("פטריוט" ו- "Tifway"), נזרע אלה ("La Paloma" ו- "יוקון"). "פטריוט" מוצג בצפיפות אורך קנה שורש הגבוהה, ואחריו "Tifway", של הזנים הזריעה. צפיפות משקל stolon היה שונה עבור כל הזנים, "פטריוט" מציג את הערך הגבוה ביותר ואחריו "Tifway", "La Paloma" ו- "יוקון". הזנים וגטטיבית שעבר בירושה מוצגים גם צפיפות משקל קנה שורש גבוה יותר מאשר הזנים הזריעה. הפיתוח של אורך stolon, קנה שורש לכל יחידת שטח (אורך צפיפות) ושל משקל לכל יחידת שטח (צפיפות משקל) של לדבורי פטריוט לאורך כל תקופת לימוד הן דיווחו איור 6. Stolon אורך צפיפות להציג עלייה ממרץ 2014 ל יולי 2014, זה לא משתנה מיולי 2014 ל יולי 2015. רק כמה המלבלבים נמצאו הדגימות שנאספו אוקטובר 2013 ומרץ 2014. קנה שורש אורך צפיפות עלה בחודש יולי 2104, להגיע הערכים הגבוהים שלו, אבל ירד שוב בשנת 2014 באוקטובר. צפיפות משקל stolon מעט מוגברת ממרץ ועד יולי 2014; עם זאת, עלייה מהירה יותר נצפתה מיולי ועד אוקטובר 2014, עם ירידה עוקבות מרץ 2015. קנה שורש במשקל צפיפות היתה מגמה דומה לדחיסות אורך קנה שורש, עם הערך הגבוה ביותר שלו ב יולי 2014.

התוכנה כוללת הניתוח של כל האובייקטים בתמונה הסרוקה. דוגמה של פריסת ניתוח תמונה דיגיטלית בתוכנת WinRHIZO מוצג (איור 7), שם שורות של צבע שונה כיסוי אובייקטים (stolons) קוטר משתנה כדי לחשב את האורך הכולל כל שיעור קוטר. ניתן להבחין כי הניתוח לוקח לחלקים חשבון של שורשים או עלים. כפי שמתואר בשלב 3.9, זה אפשרי להגביל את רוחב ומספר מחלקות קוטר מנותחים. ההיסטוגרמה מציגה את ההתפלגות של אורכי למחלקות קוטר שנבחר (איור 7). היסטוגרמה זה יכול לשמש כדי להעריך את המחלקות בקוטר מינימלי ייכללו. אבחנה חזותית של הגרף הזה בחלק העליון של מדגיש תמונת מסך כי האורך יש התפלגות נורמלית סביב ממוצע אומר קוטר כיתה, מלבד השיעורים הראשונים להציג ערכים גבוהים יותר מאשר אלו מתאים רגיל הפצה. גם אם הדגימות בקפידה נמחקו, כולל אלה כיתות קטנות, ניתוח נתונים עלול להשפיע על התוצאות, מפריז אורך צפיפות, ממעיט בקוטר ממוצע. התוצאות שלנו מראים כי האורך של כיתות קטנות (בקוטר < 0.2 מ מ) היוו 13-32% מהערכים אורך קנה שורש הכולל המתבררת מניתוח תוכנה (טבלה 1). יתר על כן, קוטר ממוצע היה לא העריכו 2-17% (טבלה 1).

איור 1: ניתוח רגרסיה של ערכי אורך נמדד עם הסרגל נגד הערכים מוערך עם מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית של bermudagrass stolons²⁴ (א) ו) המלבלבים (ב). הקו המקווקו מייצג יחס של 1:1. פאנל A שונה מ- Pornaro. et al. ²⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: ניתוח רגרסיה של קוטר ערכים נמדד עם קליבר לעומת ערכים מוערך עם מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית של bermudagrass stolons²⁴ (א) ו המלבלבים (ב). הקו המקווקו מייצג יחס של 1:1. פאנל A שונה מ- Pornaro. et al. ²⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: ניתוח רגרסיה של מספר הצמתים של bermudagrass stolons²⁴ (א) ו המלבלבים (ב) נגד הערכים המוחלטים של ההבדל בין קוטר מוערך עם מערכת ניתוח תמונה דיגיטלי ולא נמדד עם קליבר. הקו המקווקו מייצג יחס של 1:1. פאנל A שונה מ- Pornaro. et al. ²⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: ניתוח רגרסיה של קוטר ערכים נמדד עם קליבר לעומת ערכים מוערך עם מערכת ניתוח תמונה דיגיטלית של bermudagrass stolons²⁴ (א) ו המלבלבים (ב) על פרקי הגבעולים רק. הקו המקווקו מייצג יחס של 1:1. פאנל A שונה מ- Pornaro. et al. ²⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5: התוצאות דוגמה של צפיפות אורך ומשקל של stolons ושל המלבלבים ממשפט שדה השוואה בין ארבעת הזנים bermudagrass התוצר (פטריוט, Tifway, בלה פאלומה, יוקון). Stolon אורך צפיפות (א) קנה שורש אורך צפיפות (ב), stolon משקל צפיפות (ג), קנה שורש במשקל צפיפות (ד). פסים אנכיים מייצגים בשגיאות תקן של משכפל שש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6: התוצאות דוגמה של צפיפות אורך ומשקל של stolons ושל המלבלבים ממשפט שדה מציג stolon והתפתחות קנה שורש של הפטריוט לדבורי bermudagrass. Stolon אורך צפיפות (א) קנה שורש אורך צפיפות (ב), stolon משקל צפיפות (ג), קנה שורש במשקל צפיפות (ד). פסים אנכיים מייצגים בשגיאות תקן של משכפל שש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7: דוגמה הפריסה של ניתוח תמונה דיגיטלית בתוכנת WinRHIZO. התמונה הסרוקה בקידמה. והמפה בר בחלק העליון של תמונת המסך להראות את התפלגות אורך בכיתות קוטר שנבחרו. הקווים הצבעוניים מציינים את ניתוח תמונה, כל צבע מתאים לצבעים של מחלקות קוטר דיווחו על תרשימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לדבורי	בלוק	אורך קנה שורש (2ס מ/מיט)			קוטר ממוצע (מ מ)
		< 0.2 מ מ	סה	יחס	< 0.2 מ מ	סה	יחסb
פטריוט	1	231	278	16.9	1.637846	1.5994	97.7
פטריוט	2	304	349	12.8	1.620667	1.588371	98.0
פטריוט	3	304	366	16.8	1.649918	1.621367	98.3
Tifway	1	184	231	20.6	2.149745	1.9951	92.8
Tifway	2	155	193	19.9	1.866253	1.76605	94.6
Tifway	3	119	150	20.9	1.877386	1.75865	93.7
La Paloma	1	17	23	24.4	2.139019	1.8904	88.4
La Paloma	2	26	38	31.6	2.101385	1.7455	83.1
La Paloma	3	34	47	27.5	2.033729	1.7354	85.3
יוקון	1	32	44	28.0	1.700155	1.4945	87.9
יוקון	2	17	25	33.2	1.68339	1.4284	84.9
יוקון	3	67	87	23.6	1.844721	1.6774	90.9
באורך של מחלקות ≤0.2 מ מ/סה כ אורך
סה כ b קוטר/קוטר של מחלקות ≤0.2 מ מ

טבלה 1: צפיפות אורך קנה שורש, קנה שורש בקוטר ממוצע עם ובלי כיתות קטנות בקוטר. צפיפות אורך עם ובלי כולל שיעורי בקוטר קטן מ- 0.2 מ מ, יחס שלהם (באורך של מחלקות ≤ 0.2 מ מ/סה כ אורך); ואת קוטר ממוצע עם ובלי כולל שיעורי בקוטר קטן מ- 0.2 מ מ, יחס שלהם (קוטר כולל שיעורי < 0.2/קוטר ללא כולל קוטר כיתות < 0.2 מ מ).

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן היה מפותח, שחושבה עבור המחקר של turfgrasses. עם זאת, זה יכול לשמש על מגוון המינים stoloniferous או rhizomatous עם ההתאמות הדרושות לפי מאפיינים מורפולוגיים שלהם, תנאים סביבתיים דוגמת ניקוי דיוק.

קוטר ממוצע מוערך על-ידי פרוטוקול זה לא יכול להשוות את הקוטר internode נמדד עם קליבר. ניתוח תמונה דיגיטלי כולל צמתי פרקי הגבעולים בחישוב הממוצע וקוטרו הוא היחס בין סה כ ההקרנה וסיכום אורך. כפי שמתואר על ידי. Pornaro et al. ²⁴, קוטר ממוצע השיג עבור bermudagrass stolons עם WinRHIZO מערכת הפרזתי בקוטר ממוצע ערכי נמדד עם caliper-internode. קוטר stolon משמש בדרך כלל כדי לתאר את הקוטר של פרקי הגבעולים stolon, הוא פרמטר נפוץ המשמש תיאור בוטני^18,25. מסיבה זו, Pornaro. et al. ²⁴ הצביע כי קוטר ממוצע מוערך באמצעות מערכת WinRHIZO, קוטר internode נמדד באופן ידני לתאר שני היבטים מורפולוגיה שונה.

משך הזמן הנדרש לביצוע פרוטוקול זה נשאר גורם מגביל לבדיקה שגרתית. השלב הכי הגוזלות זמן הוא הניקוי של הדגימות (שלב 2.4). בהתבסס על הניסיון שלנו, ניקוי השטח דוגמא אחת עם כמות גדולה של ביומסה (קרי, 20 x 20 ס מ) דורש כ שלושה אנשים עובדים במשך 2-4 שעות. כמפורט בפרוטוקול, תהליך הניקוי הוא הכרחי עבור שני מערכת ניתוח דיגיטלי, כאשר באמצעות קליפרים של הסרגל. כאשר דגימות מורכב מספר מוגבל של stolons/המלבלבים, הזמן הדרוש כדי לאסוף נתונים עם שתי השיטות דומה. עם זאת, כפי גודל המדגם הוא גדל, השיטה מבוססת-תוכנה לא קיימת תקופה שלאחר מכן, להגדיל את הגורם המגביל היחיד הוא שטח הפנים של הסורק. להיפך, הזמן הדרוש כדי למדוד איברים עם סרגל, caliper עולה עם מספר stolons או המלבלבים להלחין את הדגימה.

חקר התכונות stolon, קנה שורש turfgrasses בוגר תמיד מבוסס על מדידת אורך internode, קוטר והמסה יבש משקל^7,11,26,27. עקב גדול הזמן הנדרש כדי לעבד ודוגמאות הירידה ברמת הדיוק עם העלייה של גודל המדגם, מדידות ידניות צריכה להיות מוגבלת למספר קטן של stolons או המלבלבים^11,20,25. בתור שכזה, הם רק עשויים להיות מתאימים עבור מפעל הניסויים. היתרון של מערכת ניתוח תמונה על שיטות מסורתיות הוא כי זה ניתן למדוד את האורך של stolon גדולים או קנה שורש דגימות, לחשב אורך צפיפות וגם המשקל הסגולי (יחס משקל באורך).

פרוטוקול זה מאפשר מדידת אורך stolon, קנה שורש חישוב של אורך צפיפויות בדגימות עם ביומסה גדולים (איזה stolon או קנה שורש במשקל היא כיום הפרמטר היחיד המשמש לתיאור מורפולוגיה). אורך stolon ו/או קנה שורש עשוי להיות פרמטר חשוב במחקרים רבים אשר ניתן לאמוד עם טכניקות הנוכחי. מחקרים שנעשו לאחרונה על מינים שונים השטח⁶ הדגימו כי צפיפות משקל ואורך stolon הם לא תמיד בקורלציה, המציינת כי ייתכן רצוי למדוד פרמטרים מרובים כדי להעריך כראוי את מערכת stolon ו קנה שורש. שיטה זו צריך להיות מתאים לדבורי במיוחד או תרבות ניהול שיטות ההשוואה.

מספר צעדים בתוך הפרוטוקול הם קריטיים של שערוך מוצלחת של אורך, קוטר ממוצע של stolons ושל המלבלבים. בגלל השתנות גבוהה מורפולוגיה של הצמח תחת תנאי סביבה שונים, מספר דוגמאות (גודל המדגם) ואת האזור הקרקע ממדים שאמור להיות שנדגמו (מדגם dimension) צריך להיות המוגמרת ולהיות כמו נציג ככל האפשר של האוכלוסייה על מנת להפחית את השתנות הנתונים. יתר על כן, ניקוי שורשי, עוזב stolons לפני ניתוח קפדני עבודה הדורשים תשומת לב מיוחדת כדי להימנע overestimations. לבסוף, לפני עיבוד תמונות, מומלץ לבחור בקפידה את הרוחב של קוטר מינימום ומחלקות שקוטרו באמצעות אפשרויות התוכנה כדי לא לכלול הכל אינה stolon או קנה שורש מניתוח. ניסוי מחייב את הבחירה של קוטר מינימלי, כמו קוטר משתנה עם מינים ותנאים סביבתיים, כולל מנהגים תרבותיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
laboratory tape	Any	NA	Tags may be used to label samples
plastic bags	Any	NA	Any plastic bag can be used to keep samples until they have been cleened
paper bags	Any	NA	Any paper bag can be used to keep cleaned samples to avoid mold formation
paper towels	Any	NA	After samples have been washed with water and before to clean them with scissors it is helpful to put them on a paper towel to absorb water
scissor	Any	NA	Any scissor with fine tips
aluminium box	Any	NA	Any aluminium box large enough to contain the sample
trays	Any	NA	It is helpful to use plastic tray to hold samples during the cleaning process
sieve with 0.5-1.5 mm openings	Any	NA	Any sieve
soil core sampler	Any	NA	We use core sampler for soil collection with diameter of at least 8 cm
squared frame	Any	NA	To collect large samples we use squared frame (10 x 10 cm, or 15 x 15 cm, or 20 x 20 cm)
spade	Any	NA	We use spade to pull out samples delimited with squared frame
precision electronic balance	Any	NA	Any precision electronic balance
laboratory oven	Any	NA	Any laboratory oven
freezer	Any	NA	Any freezer
WinRHIZO software	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	Excluded the "basic" version
WinRHIZO scanner	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	WinRHIZO system includes a scanner calibrated for the software
WinRHIZO scanner accessories	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	WinRHIZO system includes accessories, as plastic tray and positioner, to be used with the scanner