合成肺腺癌细胞原位移植研究 pd-l1 表达

摘要

本文介绍了一种小鼠肺腺癌细胞微创全基因移植模型, 作为研究非小细胞肺癌的时间和成本降低模型。

摘要

小鼠模型的应用是研究各种疾病的病理生理学不可缺少的。关于肺癌, 有几种模型, 包括基因工程模型以及移植模型。然而, 基因工程小鼠模型是耗时和昂贵的, 而一些原位移植模型是很难重现。本文介绍了一种非侵入性肺肿瘤细胞气管内给药方法, 作为一种替代的原位移植模型。使用小鼠肺腺癌细胞和合成形移植接受者可以在完全活跃的免疫系统存在下研究肿瘤的发生。此外, 移植前肿瘤细胞的基因操作使这一模型成为研究遗传因素在生理条件下对肿瘤生长和肿瘤细胞基因表达谱的影响的一个有吸引力的节省时间的方法。利用该模型, 我们表明, 肺腺癌细胞在自然环境中生长时, t 细胞抑制器编程死亡配体 1 (death-ligand) 的水平与体外培养相比有了提高。

引言

肺癌仍然是迄今为止男性和女性中最大的癌症相关杀手.事实上, 根据美国癌症协会的数据, 每年死于肺癌的人数超过死于乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的人1 人。直到最近, 大多数患有非小细胞肺癌 (nsclc) 的患者, 是肺癌最丰富的亚型, 在一线环境下接受了铂基化疗, 主要是血管生成的补充抑制剂²。只有一组患者在表皮生长因子受体 (egfr)、再生淋巴瘤激酶 (alk) 或 ros1 中存在致癌突变, 可以用可用的靶向药物^3,4进行治疗。随着免疫检查抑制剂的出现, 肺癌患者出现了新的希望, 尽管直到现在, 只有 20%-40% 的患者对免疫疗法做出反应⁵。因此, 需要进一步研究, 通过微调免疫检查点疗法和调查组合治疗方案来改善这一结果。

为了研究肺癌, 有大量的临床前模型, 包括由化学物质和致癌物质引发的自发模型和基因工程小鼠模型 (gemm), 在这些模型中, 有条件的激活后, 本土肿瘤就会出现。癌基因和肿瘤抑制基因^6,7,8的失活。这些模型对研究肺肿瘤发展的基本过程特别有价值, 但也需要广泛的小鼠繁殖, 实验很耗时。因此, 许多评价潜在抑制剂的研究利用皮下 (患者衍生) 异种移植模型, 其中人肺癌细胞系皮下注射到免疫缺陷小鼠⁹。

在这些模型中, 肿瘤的微元没有相应的表现;因此, 研究人员还使用原位移植模型, 其中肿瘤细胞被静脉注射, 胸内注射, 或直接注入肺实质10^{,11, 12, 13, 14,15,16,17},^18,19,20。其中一些方法在技术上具有挑战性, 难以重现, 需要对研究人员进行强化培训。²¹在这里, 我们在免疫能力强的小鼠身上采用了一种非侵入性原位原位气管内移植方法, 在这种方法中, 肿瘤在3-5周内发展, 与人类肿瘤有显著的相似性, 以诱导 t 细胞的表达抑制细胞上的程序化死亡配体 1 (death-ligand)。^11,12,20使用从 gemm 模型和同源受者小鼠中提取的小鼠肿瘤细胞, 可以对包括免疫细胞在内的肿瘤微环境进行适当的研究。此外, 基因编辑工具^,如 crispr/cas9 技术22可以在移植前的体外使用, 这有助于调查遗传因素对肺肿瘤发生的影响。

研究方案

下文概述的所有实验规程均遵循道德准则, 并得到奥地利联邦科学、研究和经济部的批准。

请注意:这里的方案描述了小鼠肺腺癌细胞成合合受者的原位移植模型。如果内部有细胞, 可从 kras^lsl-g12d:p 53^fl/fl (kp) 小鼠⁷、¹⁸的肿瘤肺中分离出细胞, 并移植到背景和性别相同的小鼠体内。如果细胞是由其他研究小组提供的, 而确切的背景仍然不明, 我们建议使用 c57bl6 和129s 小鼠之间的 f1 一代交叉作为移植受者, 以保证最大的耐受性。

1. 细胞制备

1. 种子 kp 细胞在移植前24小时在 rpmi 中的融合程度约为 50%, 并补充了10% 的胎儿小牛血清 (fcs)、谷氨酰胺、100 u/ml 青霉素和100μml 链霉素 (以下简称标准培养基)。在37°c、5% co₂和约95% 相对湿度下培养细胞培养物。
2. 第二天, 用1毫升的胰蛋白酶 edta (磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 为 0.05%) 的收获细胞每10厘米板 5分钟, 然后用标准培养基的9毫升重新悬浮细胞。
3. 计数血细胞仪中的细胞, 并转移实验所需的细胞数量在一个50毫升的锥形离心管。
   注: 我们建议每只小鼠在 2.5 x¹⁰ 5 和 1 x 10^{6 kp}细胞之间移植, 但这可能会根据研究人员的需要进行调整。
4. 随后, 在 300 x克的情况下对细胞进行5分钟的离心, 吸吸上清液, 并使用移液器, 以 2 x 10 7/ml 的密度将细胞重新悬浮在血清和无抗生素 rpmi 中 (用于吸入 1 x^{10 6} kp 细胞), 补充 0.01 m 乙二胺四乙酸 (edta)。
5. 将细胞放在冰上, 直到移植。

2. 经气管内分娩的原位移植

1. 用皮下注射氯胺酮 (100 mg/kg 体重) 和 xylazine (体重 10 mg kg) 的混合物, 给老鼠 (8-12周) 镇静剂。
2. 当麻醉开始时, 准备插管的导管。因此, 只需用剪刀切割末端, 就能使导管的针头变钝。然后, 将导管完全推过针头的末端。
3. 通过坚定的脚趾捏,通过踏板反射确认适当的麻醉水平, 并将眼药膏涂在眼睛上。
4. 将鼠标固定在插管平台上 (图 1a), 将其上门牙套连接在缝合线上, 并确认缝合线下方的胸部是垂直的。
5. 将光纤电缆放置在前腿之间, 以照亮胸部 (图 1 b)。
6. 小心地打开鼠标的嘴, 用经过消毒的平钳拔掉舌头。寻找白光的发射定位喉部, 并显示会厌和环状软骨 (图 1c)。
7. 一旦气管的开口清晰可见, 轻轻地将导管滑入气管 (图 1d)。插入导管的长度取决于动物的年龄和大小, 因为它不应该低于分叉, 以保证肺内肺腺癌细胞的均匀分布。快速从导管上取下针头。
8. 导管在气管中的正确位置是由通过导管闪烁的白光指示的 (图 1e)。为了确认导管在气管中的位置, 请在导管上安装含有水的1-ml 注射器。注射器中的水将根据呼吸迅速上下移动 (图 1f)。
   请注意:有经验的研究人员可以省略这一步。
9. 通过将导管放在手, 然后将含有 1 x 10^6个细胞 (细胞数量可能是可变的) 的液器50μl 放入导管枢纽中心, 从而加热细胞悬浮液。暂停将立即吸气。随后, 安装1毫升注射器, 并分配300μl 的空气, 以确保肺部内的一致分布。
10. 轻轻取出导管, 从插管平台上取下鼠标, 并将其放在热垫上, 直到它从麻醉中恢复。

3. 流式细胞术的肺准备

1. 在所需的实验终点, 通过皮下注射氯胺酮 (100 mg/kg 体重) 和 xylazine (体重 10 mg/kg) 的混合物给小鼠镇静剂, 并通过宫颈脱位对其进行安乐死。
2. 将尸体浸泡在70% 乙醇中, 并用胶带将鼠标固定在解剖板上。
3. 做一个腹侧中线切口, 轻轻倒置皮肤, 露出胸壁肌肉和腹部器官。刺穿横隔膜, 用剪刀割断肋骨, 露出胸腔。
4. 在切断左心室的一个小开口后, 用 27 g 针通过右心室, 用6-8 毫升的冷 pbs 完美地使用肺 3x, 让血液离开。肺部应该清除血液, 变成完全白色。
5. 取出肺部, 用剪刀把裂片切成小块。将肺片转移到2毫升的微离心管中, 并在 1.5 ml 的肺消化缓冲液 (rpmi、5% fcs、150 u/ml 胶原酶 i 和 50 u/ml dnase i) 中孵育。
6. 在37°c 和不断晃动的情况下, 将肺块孵化30-60分钟。
7. 通过70μm 的细胞过滤器将肺细胞悬浮液转移到50毫升管中。用无菌的10-ml 注射器清洗过滤器, 并用2% 的 fcs 用15毫升的 pbs 冲洗过滤器。
8. 在4°c 下以 300 x g离心细胞 5分钟, 并吸入上清液。将细胞在1毫升的氯化铵钾裂解缓冲液中重新吸收, 并在室温下孵育 5分钟, 以裂解残留的红细胞。
9. 在4°c 下, 以 300 x g离心细胞 5分钟, 用 2% fcs 重新悬浮 pbs 1 ml 中的细胞, 并进行流式细胞术²³所需的染色协议。
   请注意:或者, 这些细胞可能会在含有 30% fcs 和 10% dmso 的 rpmi 中重新悬浮, 并使用冷冻容器进行冷冻, 以便以后进行分析。

结果

我们通过气管内肿瘤细胞传递的原位移植模型来测试肿瘤微环境是否刺激 pd-l1 表达。因此, 我们从自主 kp 模型 (kp 细胞) 中分离出小鼠肺交流细胞, 10周后通过 cre-re这时-重组表达腺病毒 (adre) 分娩²⁴。随后, 我们用绿色荧光蛋白 (gfp) 标记肺交流细胞, 表达慢病毒²⁵ , 并通过气管内传递将其移植到免疫能力强的同种小鼠体内。为了验证...

讨论

研究肺生理和病理事件, 广泛使用侵入性和非侵入性气管插管方法注入各种试剂^{26、27、28、29。 ,30,31,32}。在癌症领域, 研究人员使用气管内 (和鼻内) 注入 cre-re卖给表达的病毒, 在肺上皮细胞中引入体细胞突变。在 kras-lsl-g12d...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82