Ortotópico transplante de células de Adenocarcinoma de pulmão Syngeneic para estudar a expressão de PD-L1

Resumo

Aqui descrevemos um modelo de transplante ortotópico syngeneic minimamente invasiva de células de adenocarcinoma do pulmão como um modelo de redução de custos e tempo para estudar o câncer de pulmão não-pequenas células.

Resumo

O uso de modelos de rato é indispensável para o estudo da fisiopatologia de diversas doenças. Em relação ao câncer de pulmão, vários modelos estão disponíveis, incluindo geneticamente projetado modelos, bem como modelos de transplante. No entanto, modelos de rato geneticamente modificados são demorado e caro, Considerando que alguns modelos de transplante ortotópico são difíceis de reproduzir. Aqui, um método de entrega intratraqueal invasivo de células tumorais de pulmão como um modelo de transplante ortotópico alternativo é descrito. O uso de células de adenocarcinoma do pulmão e enxerto syngeneic destinatários permite estudar tumorigênese sob a presença de um sistema imunológico totalmente ativo. Além disso, as manipulações genéticas de tumor células antes de transplante faz este modelo uma abordagem atraente de economia de tempo para estudar o impacto de fatores genéticos sobre o crescimento do tumor e expressão de gene de células de tumor perfis sob condições fisiológicas. Usando este modelo, mostramos esse pulmão células de adenocarcinoma expressos níveis aumentados do supressor células T programado morte-ligante 1 (PD-L1), quando cultivado em seu ambiente natural em comparação com o cultivo in vitro.

Introdução

Câncer de pulmão é, ainda de longe, o maior assassino relacionadas com cancro em homens e mulheres¹. Com efeito, de acordo com a American Cancer Society, todos os anos mais as pessoas morrem de câncer de pulmão do que de mama, próstata e cólon câncer juntos¹. Até recentemente, a maioria dos pacientes que sofrem de câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC), que é o mais abundante do subtipo de câncer de pulmão, foram tratada com quimioterapia baseados em platina, em um cenário de primeira linha, principalmente com a adição da angiogênese inibidores de². Apenas um subconjunto de pacientes abriga oncogênicas mutações no receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), no linfoma anaplásico da quinase (ALK), ou em ROS1 e pode ser tratado com drogas alvo disponível^3,4. Com o advento dos inibidores de ponto de verificação imune, nova esperança para pacientes de câncer de pulmão, surgiu, embora até agora, apenas 20 – 40% dos pacientes respondem à terapia imune⁵. Daí, mais pesquisa é necessária para melhorar este resultado, ajustando a terapia imune de ponto de verificação e investigar as opções de tratamento combinatória.

Para estudar o câncer de pulmão, uma vasta gama de modelos pré-clínicos estão disponível, incluindo modelos espontâneos provocada por produtos químicos e substâncias cancerígenas e rato geneticamente modelos (GEMM) onde autóctones tumores surgem após a ativação condicional de oncogenes e/ou a inactivação do tumor supressor genes^6,7,8. Estes modelos são de particular valor para investigar processos fundamentais no desenvolvimento do tumor de pulmão, mas eles também exigem extensivos ratos reprodução e experimentos são demorados. Portanto, muitos estudos avaliando inibidores potenciais aproveitam modelos xenoenxertos (paciente-derivado) subcutâneo onde linhas de células de câncer de pulmão humano por via subcutânea são injetadas em camundongos imunodeficientes⁹.

Nestes modelos, o micromilieu de tumores não está representada em conformidade; daí, os pesquisadores também utilizam modelos de transplante ortotópico, onde as células do tumor são injetadas por via intravenosa, intrabronchially ou diretamente o pulmão parênquima^{10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20}. Alguns desses métodos são tecnicamente desafiador, difícil de ser reproduzida e exigem treinamento intensivo dos pesquisadores. ²¹ aqui adaptamos um ortotópico não invasiva, método de transplante intratraqueal em camundongos imunocompetentes, onde tumores desenvolvem-se dentro de 3-5 semanas e apresentam semelhanças significativas com tumores humanos, para induzir a expressão da célula-T supressor de programado morte-ligante 1 (PD-L1) em células tumorais. ^{11 , 12 , 20} o uso de células de tumor do mouse derivada de modelos GEMM e syngeneic ratos destinatários permite estudar adequada do microambiente do tumor incluindo células do sistema imunológico. Além disso, gene edição ferramentas como CRISPR/Cas9 tecnologia²² pode ser utilizado in vitro antes do transplante, o que facilita a investigação do impacto dos fatores genéticos na tumorigênese do pulmão.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais como descrito abaixo, sigam as diretrizes éticas e foram aprovados pelo Ministério Federal austríaco da ciência, da investigação e da economia.

Nota: O protocolo aqui descreve um modelo de transplante ortotópico de células de adenocarcinoma do pulmão para destinatários syngeneic. As células podem ser isoladas do tumor-rolamento pulmões de Kras^LSL-G12D: p53^fl/fl (KP) ratos^7,18, se disponível in-house e transplantadas em ratos do mesmo fundo e sexo. Se células foram fornecidas de outros grupos de pesquisa e o plano de fundo exato permanece desconhecido, recomendamos o uso da geração F1 de um cruzamento entre camundongos C57BL/6 e 129S como transplantados para garantir a máxima tolerância.

1. preparação da pilha

1. KP semente células 24 h antes do transplante em aproximadamente 50% confluência em RPMI suplementado com soro fetal bezerro de 10% (FCS), glutamina e 100 penicilina U/mL e estreptomicina de μg/mL 100 (doravante referida como meio de cultura padrão). Incubar as culturas de células em 37° C, 5% CO₂e cerca de 95% de umidade relativa.
2. No dia seguinte, colher células usando 1 mL de tripsina-EDTA (0.05% em tampão fosfato salino [PBS]) por 5 min por placa de 10 cm e, posteriormente, resuspenda células isoladas com 9 mL do meio de cultura padrão.
3. Contar as células em um hemocytometer e transferir o número de células necessárias para os experimentos em um tubo de centrifuga conico de 50 mL.
   Nota: Recomendamos que transplantar entre 2,5 x 10⁵ e KP 1 x 10⁶ células por rato, mas isso pode ser adaptado com base nas necessidades do pesquisador.
4. Posteriormente, Centrifugar as células durante 5 min à 300 x g, aspirar o sobrenadante e, usando uma pipeta, Ressuspender as células em uma densidade de 2 x 10⁷/mL (para a inalação de 1 x 10⁶ células de KP por rato) no soro e RPMI sem antibióticos , suplementado com 0,01 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
5. Manter as células no gelo até o transplante.

2. transplante ortotópico via intratraqueal entrega

1. Sede um rato (8-12 semanas de idade) por injeção subcutânea de uma mistura de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) e xilazina (10mg/kg de peso corporal).
2. Enquanto a anestesia define, prepare o cateter para intubação. Portanto, blunt a agulha de um cateter por simplesmente cortando a extremidade com uma tesoura. Depois, empurre o cateter completamente sobre a extremidade da agulha.
3. Confirmar o nível adequado de anestesia beliscando pedal reflexo através do dedo do pé firme e aplique pomada oftálmica nos olhos.
4. Corrigir o mouse na plataforma de intubação (figura 1A), conectando seus incisivos superiores sobre uma sutura e confirmar que o peito é vertical por baixo da sutura.
5. Coloque um cabo de fibra óptica entre as pernas dianteiras para iluminar o peito (figura 1B).
6. Cuidadosamente Abra a boca do rato e puxar a língua usando pinça plana desinfectada. Olhe para a emissão de luz branca para localizar a laringe e visualizar as cartilagens epiglote e aritenoide (Figura 1).
7. Uma vez que a abertura da traqueia é claramente visível, deslize suavemente o cateter na traqueia (Figura 1). O comprimento do cateter a ser inserido depende da idade e tamanho do animal, desde que ele não deve ir abaixo da bifurcação para garantir uma distribuição uniforme do pulmão de células de adenocarcinoma dentro do pulmão. Rapidamente, retire a agulha do cateter.
8. A colocação apropriada do cateter na traqueia é indicada pela luz branca brilhando através do cateter (Figura 1E). Para confirmar a colocação do cateter na traqueia, anexe uma seringa de 1 mL contendo água para o cateter. A água na seringa moverá rapidamente acima e para baixo em conformidade com a respiração (Figura 1F).
   Nota: Esta etapa pode ser omitida por pesquisadores experientes.
9. Aquecer a suspensão de eritrócitos, segurando o tubo na mão e, posteriormente, Pipetar 50 µ l da suspensão contendo 1 x 10⁶ células (o número de células pode ser variável) para o centro do cateter. A suspensão vai ser aspirada imediatamente. Posteriormente, prenda uma seringa de 1 mL e dispensar 300 µ l de ar para assegurar uma distribuição consistente dentro dos pulmões.
10. Suavemente retire o cateter, remover o mouse da plataforma de intubação e colocá-lo sobre uma almofada de calor até que se recupere da anestesia.

3. pulmão preparação para citometria de fluxo

1. No ponto de extremidade desejado experimental, sedar o mouse por uma injeção subcutânea de uma mistura de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) e xilazina (10mg/kg de peso corporal) e sacrificá-lo por deslocamento cervical.
2. Embeba a carcaça em etanol a 70% e prenda o mouse sobre um tabuleiro de dissecação usando fita.
3. Fazer uma incisão ventral e inverta suavemente a pele para expor os músculos da parede torácica e os órgãos abdominais. Perfurar o diafragma e corte as costelas com uma tesoura para expor a cavidade torácica.
4. Perfundir os pulmões 3 x 6-8 ml de PBS gelado através do ventrículo direito, usando uma agulha 27G depois de cortar uma pequena abertura no ventrículo esquerdo, para permitir que o sangue para sair. Os pulmões devem ser ilibados de sangue e volta completamente branca.
5. Retire os pulmões e picar os lóbulos em pequenos pedaços com uma tesoura. Transfira os pedaços de pulmão para um tubo de microcentrifuga de 2ml e incube-lo em 1,5 mL de tampão de digestão do pulmão (RPMI, 5% FCS, 150 colagenase U/mL eu e 50 U/mL DNase eu).
6. Incubar o pulmão peças 30-60 min a 37 ° C e com agitação constante.
7. Transferi a suspensão de células de pulmão através de um filtro de célula 70 µm para um tubo de 50 mL. Limpar o filtro com as costas de uma seringa de 10 mL estéril e lave o filtro com 15 mL de PBS com FCS 2%.
8. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de lise (ACK) de amónio-cloreto-potássio e incube-os por 5 min à temperatura ambiente durante a lise de eritrócitos residuais.
9. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as células em 1 mL de PBS com 2% de FCS e prosseguir com o protocolo de coloração desejado por citometria de fluxo²³.
   Nota: Alternativamente, as células podem ser resuspended em RPMI contendo 30% de FCS e 10% de DMSO e congelado usando um recipiente de congelação para análise posterior.

Resultados

Usamos o modelo de transplante ortotópico via intratraqueal entrega de célula de tumor para testar se o microambiente do tumor estimula a expressão de PD-L1. Portanto, isolamos as células de pulmão AC rato do modelo KP autóctone (células KP), 10 semanas após a indução de tumor através de Cre-recombinase-expressando adenovírus (Ad.Cre) entrega²⁴. Posteriormente, nós rotulado o pulmão células AC usando uma proteína verde fluorescente (GFP)-expressar l...

Discussão

Para estudar eventos fisiológicos e patológicos de pulmão no pulmão, métodos de intubação intratraqueal invasiva e não-invasivo para a instilação de vários reagentes são amplamente utilizado^26,,^{27,28,29 ,30,31,32}. No campo do câncer, os pesquisadores utilizam o intratraqueal (e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82