JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada küçük hücreli dışı akciğer kanseri çalışma için zaman ve maliyet azaltma mankenlik minimal invaziv syngeneic orthotopic nakli manken fare akciğer adenokarsinom hücre açıklayın.

Özet

Fare modelleri kullanımını çeşitli hastalıkların Patofizyoloji eğitimi için vazgeçilmezdir. Akciğer kanseri ile ilgili birkaç misal are elde edilebilir, genetik olarak dahil olmak üzere tasarlanmış modelleri yanı sıra ekimi modelleri. Ancak, bazı orthotopic nakli modelleri yeniden oluşturulması zor olan ise genetik fare modelleri zaman alıcı ve pahalı. Burada, akciğer tümör hücreleri bir non-invaziv boğaza teslim yöntemi bir alternatif orthotopic nakli model olarak tanımlanmaktadır. Tumorigenesis tam etkin bir bağışıklık sistemi altında eğitim fare akciğer adenokarsinom hücre ve syngeneic greft alıcılar kullanımını sağlar. Ayrıca, genetik manipülasyon tümör hücreleri fizyolojik koşullar altında bu model tümör büyüme ve tümör hücre gen ekspresyonu genetik faktörlerin etkisini incelemek için çekici bir zaman tasarrufu yaklaşım profilleri ekimi yapar önce. Bu akciğer adenokarsinom hücre gösterdiğimiz bu modeli kullanan T hücreli bastırıcı, hızlı yüksek düzeyde ölüm-ligand 1 (PD-L1) ekimi ile karşılaştırıldığında onların doğal ortamda tüp bebek yetiştirilen programlanmış.

Giriş

Akciğer kanseri kanser ile ilgili en büyük katil kadın ve erkek1hala gereğidir. Gerçekten de, Amerikan Kanser Derneği göre her yıl daha akciğer kanseri meme, prostat ve kolon kanseri birlikte1insanlar ölür. Yakın zamana kadar akciğer kanserinin en bol alt türü olan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC), muzdarip hastaların çoğu çoğunlukla angiogenez ilavesi ile bir ilk satır ortamda platin tabanlı kemoterapi ile tedavi edildi inhibitörleri2. Yalnızca alt küme küme küme kümesini hastalar oncogenic epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), mutasyonların Anaplastik Lenfoma kinaz (ALK) veya ROS1, limanlar ve kullanılabilir hedefleme uyuşturucu3,4ile tedavi edilebilir. Her ne kadar şimdiye kadar hastaların sadece % 20-40 yanıt bağışıklık terapisi5' e bağışıklık denetim noktası inhibitörleri ve advent ile akciğer kanseri hastalar için yeni bir umut, çıkmıştır. Bu nedenle, daha fazla araştırma bu sonucu bağışıklık denetim noktası terapisi ince ayar ve birleşimsel tedavi seçenekleri soruşturma geliştirmek için gereklidir.

Akciğer kanseri çalışmaya preklinik modelleri geniş bir dizi mevcut, spontan modelleri de dahil olmak üzere kimyasallar ve kanserojen ve genetiği fare tarafından tetiklenen nerede otokton tümörler koşullu aktivasyonu ortaya çıkan modelleri (et) oncogenes ve/veya tümör baskılayıcı genler6,7,8inactivation. Akciğer tümörü geliştirmede temel süreçleri araştırmak için belirli değerli bu modeller için ama ayrıca geniş fareler ıslahı gerektirir ve deneyler zaman alıcı. Bu nedenle, birçok çalışma potansiyel inhibitörleri değerlendirilmesi subkutan xenograft (hasta kaynaklı) modelleri nerede insan akciğer kanseri hücre hatları subkutan immünyetmezligi fareler9içine enjekte edilir yararlanın.

Bu modellerinde, tümör micromilieu buna göre faaliyet gösterdiği; Bu nedenle, araştırmacılar da nerede tümör hücreleri intravenöz, intrabronchially veya doğrudan akciğer parankimi10,11,12,13enjekte edilir orthotopic nakli modelleri, kullanma, 14,15,16,17,18,19,20. Bu yöntemlerden bazıları Teknik olarak zor, zor çoğaltılamaz ve araştırmacıların yoğun bir eğitim gerektirir. 21 burada bir non-invaziv orthotopic, boğaza nakli yöntemi nerede tümörleri 3-5 hafta içinde geliştirmek ve önemli benzerlikler T-hücre ifade ikna etmek için insan tümörler, sergi immün farelerde adapte bastırıcı ölüm-ligand 1 (PD-L1) tümör hücreleri üzerinde programlanmış. 11 , 12 , Syngeneic alıcı fareler sağlar uygun bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere tümör microenvironment eğitim ve 20 fare tümör hücreleri kullanımı et modellerden elde. Ayrıca, düzenleme araçları gibi CRISPR/Cas9 teknoloji22 gen tüp bebek etkisi akciğer tumorigenesis genetik faktörlerin incelenmesi kolaylaştıran nakli önce kullanılabilir.

Protokol

Tüm deneysel protokoller aşağıdaki anahatları belirlenmiş olarak etik kurallara uyun ve Avusturya Federal Bakanlığı Bilim, araştırma ve ekonomi tarafından kabul edildi.

Not: İletişim kuralı burada bir orthotopic nakli modeli fare akciğer adenokarsinom hücre syngeneic alıcılar açıklar. Hücre Tümörü taşıyan KrasLSI-G12Dakciğerlerden izole olabilir: p53fl/fl (KP) fareler7,18, varsa in-house ve fareler aynı arka plan ve seks içine transplante. Hücreler diğer araştırma gruplarından verilmiştir ve tam arka plan bilinmemektedir, maksimal dayanıklılık garanti altına almak için alıcılar nakli gibi C57BL/6 ve 129S fareler arasında çapraz F1 nesil kullanımını öneririz.

1. hücre hazırlık

  1. Tohum KP nakli yaklaşık %50 confluency % 10 fetal buzağı serum (FCS), glutamin ve 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin (bundan sonra standart kültür ortamı olarak anılacaktır) ile takıma RPMI içinde önce 24 h hücreleri. 37 ° C, % 5 CO2ve yaklaşık % 95 hücre kültürleri kuluçkaya bağıl nem.
  2. Ertesi gün 10 cm tabak başına 5 min için 1 mL tripsin-EDTA (fosfat tamponlu tuz [PBS] içinde % 0.05) kullanarak hücre hasat ve daha sonra standart kültür ortamının 9 mL ile müstakil hücreleri resuspend.
  3. Bir hemasitometre hücreleri saymak ve 50 mL konik santrifüj tüpü olarak deneyler için gerekli hücre sayısı aktarın.
    Not: 2. 5 x 105 ve 1 x 106 KP arasında fare başına hücre nakli öneririz, ancak bu araştırmacı ihtiyaçlarına göre adapte olabilir.
  4. Daha sonra hücreler için 300 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve, bir pipet kullanarak, hücreleri (için fare başına 1 x 106 KP hücre inhalasyon) 2 x 107/mL yoğunluğu, serum ve antibiyotik-Alerjik RPMI resuspend , 0.01 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ile desteklenmiştir.
  5. Buz üzerinde hücre nakli kadar tutun.

2. Orthotopic nakli boğaza teslim yolu ile

  1. Bir fare (8-12 hafta-in yaş) ketamin (100 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (10 mg/kg vücut ağırlığı) karışımı bir subkutan enjeksiyon tarafından sakinleştir.
  2. Anestezi ayarlar iken, kateter entübasyon için hazır olun. Bu nedenle, bir kateter iğne sadece sonunda makasla keserek künt. Daha sonra kateter tamamen iğnenin ucuna itin.
  3. Anestezi uygun düzeyde pedal refleks üzerinden sağlam parmak pinching tarafından onaylamak ve oftalmik merhem gözler için geçerlidir.
  4. Onun üst kesici dişler üzerinde dikiş çengel tarafından entübasyon platformda (Şekil 1A) fare düzeltmek ve göğüs altında dikiş dikey olduğunu doğrulayın.
  5. Bir fiber optik kablo (Şekil 1B) göğüs aydınlatmak için ön ayakları arasında yerleştirin.
  6. Dikkatle farenin ağzı açık ve dezenfekte düz forseps kullanarak dilini çekin. Gırtlak bulup gırtlak kapağını ve arytenoid kıkırdak (Şekil 1 c) görselleştirmek için beyaz ışık emisyon için bak.
  7. Yavaşça nefes borusu açılışı açıkça görünür olduğunda, Kateter borusu (Şekil 1 d) kaydırın. Bifurkasyon akciğer adenokarsinom hücre akciğer eşit dağılımı garanti aşağıda gitmemeli bu yana eklenecek Kateter uzunluğu yaş ve hayvan boyutunu bağlıdır. Hızlı bir şekilde iğne kateter kaldırın.
  8. Kateter borusu içinde uygun yerleştirme (Şekil 1E) kateter parlayan beyaz ışık ile belirtilir. Trakea kateter yerleştirme onaylamak, kateter su içeren 1 mL şırınga ekler. Şırınga suda hızla yukarı ve aşağı nefes (Şekil 1F) uygun olarak hareket edecek.
    Not: Bu adımı deneyimli araştırmacılar tarafından atlanabilir.
  9. Hücre süspansiyon kadar tüp elinde tutarak ve sıcak, daha sonra kateter hub ortasına 1 x 106 hücreler (hücre sayısı değişken olabilir) içeren süspansiyon 50 µL pipet. Süspansiyon hemen emişli. Daha sonra 1 mL şırınga iliştirin ve hava akciğerlere içinde tutarlı bir dağıtım sağlamak için 300 µL dağıtmak.
  10. Yavaşça kateter kaldırmak, fare entübasyon platformdan çıkarın ve anesteziden normale dönene kadar bir ısı yastık koydu.

3. akciğer hazırlık için akış sitometresi

  1. İstenen deneysel uç noktada fareyi ketamin (100 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (10 mg/kg vücut ağırlığı) karışımı bir subkutan enjeksiyon tarafından sakinleştirici ve servikal çıkığı tarafından ötenazi.
  2. Karkas % 70 etanol içinde ıslatın ve fareyi bant kullanarak diseksiyon boyutunda bir tahta üzerinde güvenli.
  3. Ventral ensizyon yapmak ve göğüs duvarı kasları ve karın organları duyurmak cilt yavaşça tersine çevirin. Ponksiyon diyafram ve kaburga göğüs boşluğuna maruz makasla kesti.
  4. 3 akciğer sıvı x ile buz gibi PBS kullanarak kan izin vermek için 27 G iğne sol ventrikül içinde küçük bir açılış kesim sonrası sağ ventrikül aracılığıyla gitmek 6-8 mL. Akciğerlere kan ve dönüş tamamen beyaz temizlenmiş olmalıdır.
  5. Ciğerlerini al ve küçük parçalara makas kullanarak loblar kıyma. Akciğer adet 2 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve akciğer sindirim arabellek 1,5 mL kuluçkaya (RPMI, % 5 FCS, 150 U/mL collagenase ben ve 50 U/mL DNaz ben).
  6. Kuluçkaya akciğer 30-60 dk 37 ° C'de ve sürekli sallayarak ile adet.
  7. Akciğer hücre süspansiyon 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL tüp içine aktarın. Süzgeç steril bir 10 mL şırınga arkasý temizleyin ve süzgeç PBS % 2 FCS ile 15 mL ile durulayın.
  8. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Amonyum klorür potasyum (ACK) lysing arabellek 1 mL hücrelerde resuspend ve bunları için artık eritrositler 5 dk lizis için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  9. 300 x g 4 ° C'de 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve PBS % 2 FCS ile 1 mL hücrelerde resuspend ve akış sitometresi23istenen boyama protokol ile devam edin.
    Not: Alternatif olarak, hücrelerin % 30 FCS ve % 10 DMSO içeren RPMI resuspended ve daha sonraki analizler için bir dondurma kabı kullanarak donmuş.

Sonuçlar

Orthotopic nakli modeli boğaza tümör hücre teslim yolu ile tümör microenvironment PD-L1 ifade uyarır olup olmadığını sınamak için kullanılır. Bu nedenle, fare akciğer AC hücreleri otokton KP modeli (KP hücreleri), 10 hafta tümör indüksiyon Cre recombinase ifade adenovirus (Ad.Cre) teslim24takip izole. Daha sonra bir yeşil flüoresan protein (GFP) kullanarak AC hücre akciğer etiketli-lentivirus25 ve orthotopically ifad...

Tartışmalar

Akciğer akciğer fizyolojik ve patolojik olayları çalışmaya, invaziv ve non-invaziv boğaza entübasyon çeşitli reaktifler korumak için yaygın olarak kullanılan26,27,28,29 metodlar ,30,31,32. Kanser alanında araştırmacılar boğaza kullanmak (ve etkilerinin) virüslerin akciğe...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Safia Zahma doku bölümleri hazırlanması konusunda ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
mouse lung adenocarcinoma cell lineisolated in house
C57Bl/6 miceF1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 MediumLife Technologies11544446
Fetal Calf SerumLife Technologies11573397
Penicillin/Streptomycin SolutionLife Technologies11548876
L-GlutamineLife Technologies11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTALife Technologies11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)Ogris Pharma8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)Ogris Pharma8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)BD381223
Blunt forcepsRobozRS8260
Leica CLS150 LEDLeica30250004Fibre Light Illuminator
Student Iris ScissorsFine Science Tools91460-11
DNase I (RNase-Free)New England BiolabsM0303S
Collagenase Type ILife Technologies17100017
ACK Lysing BufferLonza10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7eBioscience25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-82

Referanslar

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
  3. Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
  4. Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
  5. Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
  6. Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
  7. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  8. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
  9. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  10. Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
  11. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
  12. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
  13. Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
  14. Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
  15. Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma--characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
  16. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  17. Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
  18. Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
  19. Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
  20. Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
  21. Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
  22. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  23. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
  24. Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
  25. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
  26. Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
  27. Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
  28. Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
  29. Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
  30. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  31. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  32. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 143Sigara k k h creli akci er kanseriorthotopic ekimiminimal invazivsyngeneicPD L1bo aza teslim

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır