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摘要

在这里, 我们报告动力蛋白的免疫荧光定位, 以说明在石蜡嵌入小鼠附睾切片和永生化附睾细胞系 (mECap18) 的蛋白质检测协议。我们还描述了从附睾液和条件细胞培养基中分离分泌蛋白的协议。

摘要

哺乳动物附睾生成任何内分泌腺体中最复杂的腔内液体之一, 以支持睾丸后成熟和精子的贮存。这种复杂性的产生是由于衬里上皮细胞的分泌和吸收活性的综合作用。在这里, 我们描述的技术, 分析附睾蛋白合成和分泌的重点是模型蛋白家族的动力蛋白 (DNM) mechanoenzymes;具有调节双向膜贩运活动潜力的大型 GTPases。为了研究附睾组织中蛋白质的表达, 我们描述了石蜡嵌入切片中靶蛋白免疫荧光标记的鲁棒方法, 并通过对这些蛋白质的空间分布进行了检测。免疫荧光显微镜。我们还描述了最优化的方法, 以分离和鉴定的外切像囊泡, 称为 epididymosomes, 这是分泌到附睾腔参与细胞间沟通与成熟的精子细胞。作为补充方法, 我们还描述了免疫荧光检测的目标蛋白在 SV40-immortalized 小鼠附睾上皮 (mECap18) 细胞系。此外, 我们还讨论了 mECap18 细胞系作为一种合适的体外模型, 用于研究附睾分泌活动的调节。为此, 我们描述了维持 mECap18 细胞系的培养要求和使用有选择性的药理抑制方案, 它们能够影响其分泌蛋白的分布。后者很容易通过收获的条件培养基, 分泌蛋白的浓度通过乙酸酸/丙酮沉淀和他们随后的分析通过 SDS 页和免疫印迹法。我们认为, 这些联合方法适合于分析替代附睾蛋白靶点, 作为确定它们在精子成熟和/或贮存中功能作用的前奏。

引言

所有哺乳动物的精子都有可能显示正向渐进运动, 并通过附睾 (雄性额外睾丸导管系统的高度专门化区域) 受精卵子, 这可能用 7-14 天的时间来导航 (取决于物种)1。由于父亲染色质的极度凝结和大部分细胞质的脱落, 伴随着睾丸内精子的 cytodifferentiation, 它们随后的功能成熟完全由它们的相互作用驱动。附睾微环境。这一环境反过来, 由内衬附睾的分泌和吸收活动创造, 并显示一个特殊水平的段段变化1。因此, 在蛋白质合成和分泌方面, 最活跃的部分是位于附睾近端的部分 (即, 额和语料库)2。这项活动反映精子的功能轮廓, 细胞首先开始显示功能能力的特征 (i. e., 渐进动力和绑定到酸可溶性透明糖蛋白的能力) 后, 其通过3。这些功能属性继续发展之前达到最佳水平, 因为精子到达远端附睾段 (马尾), 其中他们储存在一个静止状态, 准备射精。这种精子储存库的形成和维持也与衬里上皮紧密相连, 在马尾中由强吸收活性4、5控制。虽然解剖差异已报告6,7,8, 这种分区分工似乎是一个特点的附睾, 是共享的大多数哺乳动物物种研究至今, 包括我们自己的9,10。事实上, 从临床的角度来看, 附睾功能障碍对男性因素不孕11的病因有重要的贡献, 因此突出了了解这种特殊组织的调节的重要性。

因此, 令人遗憾的是, 我们对附睾生理的理解, 以及调控精子成熟和贮存的顺序阶段的机制, 仍有待完全解决。在促成因素中, 附睾研究的进展受到限制, 这种组织的总体复杂性和对其管腔微环境的调控机制的认识。解剖上, 我们知道, 除了额位, 语料库和马尾段的区别, 附睾可以进一步细分为几个区域 (图 1A), 每隔12间隔, 并以基因/蛋白的离散剖面为特征表达式13,14,15,16,17,18。事实上, 根据对附睾节段基因表达的详细转录分析, 老鼠和大鼠模型中有多达6和9个不同的附睾区, 分别为19、20。这种复杂性大概反映了附睾躯体的组成, 假上皮包括许多不同的细胞类型;每种不同的, 他们的丰度, 分布和分泌/吸收活动的长度。因此, 主细胞是迄今为止最丰富的附睾细胞类型, 构成了所有上皮细胞的80% 以上。因此, 主要细胞负责附睾蛋白生物合成和分泌物的大部分5。与此相反, 作为附睾躯体内第二大细胞类型的透明细胞种群, 主要参与腔内成分的选择性吸收和这种微环境的酸化5。添加另一层复杂性, 雄激素和其他 lumicrine 因素的睾丸起源施加差异控制每一个这些附睾细胞类型取决于他们的定位沿道。

尽管这种复杂性所造成的限制, 仍有重大进展, 以解决附睾功能的机制基础。这些研究的一个关键是应用先进的质谱策略建立广泛的附睾蛋白质组的清单, 并与从这些初步调查中选择的单个蛋白质进行详细分析。这一方法的一个例证是我们最近在老鼠模型21中对 mechanoenzymes DNM 家族的描述。我们最初对 DNM 的兴趣是由它在 endocytotic 过程耦合中的双重作用所推动的。在这些观察的基础上, 我们能够证明 DNM (DNM1-DNM3) 的三规范亚型在小鼠附睾中有高度表达, 并适当定位以在蛋白质分泌和吸收中发挥调节作用21.此外, 我们能够清楚地区分每个 DNM 异构体的基础上, 他们的细胞和亚细胞定位, 从而表明, 他们拥有互补, 而不是多余的活动, 在附睾上皮21。

在这里, 我们描述了用于研究小鼠附睾中 DNM 表达的实验方法, 希望这些信息能在其他附睾蛋白的鉴定中得到更广泛的应用, 从而有助于我们了解男性生殖道这一重要元素的功能。具体来说, 我们描述了在石蜡嵌入附睾切片中靶蛋白免疫荧光标记的稳健方法的发展, 以及随后通过免疫荧光检测这些蛋白质的空间分布。显微镜。我们进一步记录我们最近优化的协议22 , 以隔离和表征 epididymosomes;小的外切状囊泡, 构成附睾分泌剖面的关键元素, 在促进精子成熟23中似乎起着突出的作用。作为补充的方法, 我们还描述了免疫荧光检测的目标蛋白在永生化鼠额附睾上皮 (mECap18) 细胞系和利用这个资源作为一个模型, 以探讨对附睾的调节体外分泌活性。

研究方案

所有涉及动物组织收集的实验程序都是由纽卡斯尔大学动物保育和伦理委员会批准的。

1. 石蜡嵌入附睾切片的免疫荧光染色 (图1和 2)

  1. 在成年小鼠安乐死后, 通过 CO2吸入 (瑞士老鼠, 超过8周), 仔细解剖附睾 (使用手术剪刀和镊子) 没有覆盖结缔组织和脂肪, 浸泡在 Bouin 的固定器解决方案 (> 十倍体积/组织重量) 过夜固定。
  2. 每天用70% 乙醇与2×改变2天, 然后通过分级乙醇 (70%、95% 和 100%) 脱水, 准备入渗和嵌入石蜡块。
  3. 切片的石蜡块在厚度为4-6 µm 和安装在幻灯片上, 准备免疫荧光染色。
  4. 在油烟机中, 脱蜡的附睾石蜡切片添加足够的二甲苯到滑瓶完全浸入组织部分 (3×5分钟每次)。
  5. 水化的组织切片浸泡在分级乙醇溶液稀释纯化 H2O (100% 乙醇5分钟, 100% 乙醇5分钟, 90% 乙醇1分钟, 80% 乙醇1分钟, 70% 乙醇1分钟, 50% 乙醇1分钟)。
  6. 用足够的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 将一个滑动罐中的切片洗涤5分钟, 以完全浸入整个组织部分 (按照这些指示进行后续洗涤)。
  7. 醒酒适当的抗原检索解决方案 (i., 10 毫摩尔柠檬酸钠, 50 毫摩尔/升三 pH 10.5 或替代抗原检索解决方案, 取决于要检测的抗原) 成一个滑动架和微波直到沸腾。将幻灯片浸入此解决方案中, 并将组织切片与热诱导抗原检索条件优化为单个抗体 (见表 1)。
    注意: 在抗原检索过程中, 确保幻灯片完全沉浸在抗原检索溶液中。
  8. 从微波炉中取出滑动容器, 冷却至室温。
  9. 用 PBS 冲洗幻灯片, 用一支液态的滑动标记笔在组织切片周围进行跟踪。
  10. 将幻灯片放在一个加湿的容器中 (由容器底部的湿润组织创建), 并应用阻塞解决方案 (以前通过0.45 µm 过滤器过滤的 3% BSA/PBS), 1 小时37摄氏度。
  11. 用 PBS 冲洗一次幻灯片。
  12. 用适当的原抗体稀释到实验性的 1% BSA/PBS 在4°c 过夜 (1:60 用于 anti-DNM1、DNM2 和 DNM3 抗体; 1:100 anti-ATP6V1B1 抗体, 见材料表抗体详细信息)。
    注意: 要区分特定于非特异抗体的结合, 必须包括严格的阴性 (i.、二次抗体、原发性抗体 preabsorbed 免疫肽) 和阳性对照24。
  13. 复温在室温下放置30分钟的幻灯片。
  14. 在震动平台 (60 rpm) 上用 PBS 清洗幻灯片3×每10分钟。
  15. 用适当的二级抗体稀释在 1% BSA/PBS (过滤通过0.45 µm 过滤器) 在37°c 为 1 h (1:400 稀释为所有次要抗体, 看见抗体细节的材料表)。
    注意: 从这个步骤开始, 将幻灯片容器保持在黑暗中。对于双标记, 选择一个兼容的二次抗体组合 (i. e., 二级抗体必须在不同的物种中提出)。
  16. 在震动平台 (60 rpm) 上用 PBS 清洗幻灯片3×每10分钟。
  17. Counterstain 碘碘化物 (PI, 7.48 μmol/升) 或 4΄, 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI, 4.37 μmol/升) 在室温下的2分钟, 以标记细胞核。
  18. 每两次在震动平台 (60 rpm) 上用 PBS 清洗幻灯片5分钟。
  19. 装上 10% Mowiol 4-88 的部分, 在30% 甘油的溶液中制备0.2 摩尔/升三 (pH 8.5) 和 2.5% 1, 4-杂双环-(2.2. 2)-辛烷值。
  20. 用指甲油封住盖玻片, 将幻灯片存放在4摄氏度以供将来观察。
    注意: 建议在准备后尽快执行幻灯片的成像, 以避免过多的荧光损失。

2从小鼠附睾中分离 Epididymosomes (图 3)

  1. 在成年老鼠安乐死以后通过 CO2吸入 (瑞士老鼠8星期老), 灌注他们的血管与 PBS (预热到37°c) 减少附睾组织的血液污染。
    注意: 血浆含有不同的外来体种群, 其大小与 epididymosomes25相似。从附睾组织的血液清除效果可以通过检查最初的片段, 一个高度血管化的附睾段位于接近额段 (i. e.,图 1A中的1区)。
  2. 仔细解剖没有上覆脂肪和结缔组织的附睾, 用改良的比格斯、惠顿和 Whittingham 培养基冲洗 (BWW; pH 值 7.4, 渗透压300毫摩尔/千克水26,27), 以减少任何表面电位血液污染。
  3. 涂抹附睾组织去除多余的培养基, 解剖该附睾 (e.,图 1A中的2-5 区), 并转移到含有 BWW 培养基的新鲜培养皿 (35 x 10 毫米)。确保介质数量足以进行最终恢复。
    注: 对于6位附睾, 建议使用1.1 毫升的培养基, 以允许恢复900µL, 然后均匀分裂, 并应用在2预准备的梯度之上 (见步骤 2.9)。
  4. 用剃刀刀片将一些小切口插入到头部的组织中。不要切碎组织, 从而避免污染样品与过多胞浆含量。在37°c 的30分钟内, 将含有组织的轻度搅动的钢板孵化, 释放腔内的内容。
  5. 过滤结果悬浮通过70µm 膜去除细胞碎片。
  6. 收集滤液, 并将其与连续离心步骤在4°c, 以提高速度, 以消除细胞碎片 (i., 500 x g, 2000 x g, 4000 x g, 8000 x g, 5 分钟每个;1.7万 x g为20分钟, 最后 1.7万 x g为另外10分钟或直到没有颗粒在离心以后形成)。
    注意: 在初始 500 x g离心步骤后对颗粒的颜色进行评估是很重要的, 以确保最小的血液污染存在。丢弃此颗粒显示粉红色着色的任何样品。
  7. 通过稀释密度梯度介质 (包括 60% (w/v) 水 iodixanol), 用0.25 摩尔/iodixanol 蔗糖和10毫摩尔/升三 (pH 7.5) 来制备不连续的梯度 (包括40%、20%、10%、5% 层)。
  8. 在 ultracentrifuge 管 (11 x 35 毫米) 上准备渐变, 每个分数为450µL (图 3)。观察每个分数应用后的渐变, 以确保在加载附睾流体样本之前, 每个层之间成功地形成界面。在使用当天准备每一个渐变, 但是, 在加载前, 附睾腔内流体样品可保存在4摄氏度至2小时。
  9. 小心地添加450µL 的附睾腔内液体悬浮 (对应于从3附睾的头部收集的材料) 在单一梯度之上。
  10. Ultracentrifuge 梯度在 16万 x g在4°c 为 18 h。
    注意: 由于这种离心是在非常高的速度进行, 所有 ultracentrifuge 管必须配对和平衡精确。检查管, 以确保他们没有任何明显的损害, 可能危及他们的完整性。
  11. 轻轻地移除12个相等的分数 (每个由185µL 组成) 从最上层开始, 朝着梯度的底部前进。如果适用 (最多两个渐变), 则池中从每个渐变中恢复的等效分数。
    注: 鼠标 epididymosomes 是最丰富的分数 9-1122, 见图 4和讨论。
  12. 在回收和汇集 9-11 分, 稀释成2毫升的 PBS, 并 ultracentrifuge 样品在 10万 x g在4摄氏度 3 h (13 x 56 毫米管) 颗粒的 epididymosomes。
    注意: 由于 epididymosome 颗粒很难看到, 确保管的方向被注意到, 因为它们被放置在转子和标记的管, 以表明预期的位置, epididymosome 颗粒。确保每管有足够的容积 (i., 超过其总容量的 50%), 以防止管道坍塌的风险。
  13. 小心地吸入和丢弃上清, 不干扰 epididymosome 颗粒。
  14. 评估 epididymosome 纯度 (图 4)。
  15. 根据下游应用并用重悬 epididymosome 颗粒进入所需介质。例如, BWW 培养基一般用于与精子共孵化的实验, 或者是一个适当的裂解缓冲剂, 用于为附睾蛋白质组通过 SDS 页的分辨率进行准备。

3. mECap18 细胞的免疫荧光染色

  1. 无菌盖玻片的制备 (在细胞培养罩中进行)
    1. 将盖玻片 (12 x 12 毫米) 浸泡在70% 乙醇中10分钟, 在乙醇灯以上高温下干燥消毒。
    2. 冷却的盖玻片在十年代转到12井板块。
    3. 应用无菌聚 l-赖氨酸溶液覆盖盖玻片, 室温下沉淀10分钟。
    4. 放弃聚 l-赖氨酸溶液, 用不育的 H2O 或适当的培养基冲洗盖玻片。
  2. 制备 mECap18 细胞
    1. 通过 2 x 105 mECap18 细胞的整除数在12井板的每个井包含盖玻片。
    2. 培养细胞与 mECap18 细胞培养基 (DMEM 补充 1% l-谷氨酰胺, 1% 丙酮酸钠, 1% 青霉素/链霉素, 50 μmol/升 5α-androstan-17β-3-oneC-IIIN), 在10% 摄氏度的恒温箱中含有37胎小牛血清 (血清) 5%共2夜。
    3. 一旦细胞坚持盖玻片, 丢弃培养基, 并用 PBS 冲洗两次细胞。
    4. 添加足够数量的4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 稀释在 PBS, 以浸泡整个盖玻片和固定在室温下的细胞15分钟。
    5. 丢弃粉煤灰溶液, 在 PBS 中冲洗两次盖玻片。
  3. 免疫荧光染色
    1. Permeabilize mECap18 细胞浸泡在0.1% 海卫 X-100 在 PBS 10 分钟。
    2. 用 PBS 冲洗盖玻片。
    3. 阻断 mECap18 细胞与 3% BSA, 并进行 immunolabeling 的细胞使用等效的协议, 为附睾组织切片描述。

4. 从条件细胞培养培养基中分离蛋白质

  1. 条件细胞培养培养基的收集
    1. 通过整除数 4 x 105 mECap18 细胞在6井板每井与 mECap18 细胞培养基补充10% 个血清 24 h。
    2. 用 mECap18 细胞培养基 (无血清制备) 清洗 mECap18 细胞三次, 以去除残留的血清和任何相关的蛋白质污染物。
    3. 加入1.5 毫升的 mECap18 细胞培养基 (无血清制备), 并在 5% CO2下的37°c 孵化器中与 mECap18 细胞孵育12小时。
      注: mECap18 细胞在这一步可以评估不同的目标抗原根据实验设计。
    4. 经过12小时的孵化, 收集细胞培养基和离心机在 2000 x g 10 分钟, 以消除所有细胞碎片。
      注: 孵化期可根据实验设计/终点评估, 并考虑细胞对应用治疗的耐受性而改变。建议根据特定的实验方案调整孵化时间, 以确保达到最佳效果。
    5. 通过应用标准的台盼蓝排斥试验评估 mECap18 细胞的生存能力28。丢弃所有细胞存活能力下降到90% 以下的物质, 以消除由死或垂死细胞释放的蛋白质所引入的偏倚。
    6. 将蛋白质从细胞培养基中分离出来, 或保持培养基在-80 摄氏度。
  2. 蛋白质隔离 (在油烟机中进行)
    1. 添加20% 体积的冷冻100% 乙酸酸到80% 容量的条件细胞培养基, 沉淀从培养的 mECap18 细胞释放的蛋白质。以恒定的混合, 夜间孵化4摄氏度。
    2. 孵化后, 颗粒沉淀蛋白离心 (17, 000 x克, 4 °c 10 分钟)。
      注: 由于所需的蛋白质数量有限, 在培养基中可能会使颗粒在离心后不易形象化。因此, 必须在离心前正确定位管, 并注意不要在清除清液时干扰预期颗粒位置。
    3. 在再离心之前, 先用冷冻丙酮将上清液和两次颗粒洗净 (17, 000 x克, 4 °c 10 分钟)。
    4. 在空气干燥之前, 要小心地除去并丢弃上清液, 然后在通风罩内残留丙酮。
    5. 并用重悬蛋白质颗粒在适当的提取缓冲器准备终点分析, 以检测完整的分泌蛋白剖面和/或单个靶蛋白 (e., SDS 页, 免疫印迹法)。

结果

图 1和图 2显示了小鼠附睾 DNM 免疫荧光定位的代表性结果。调查的三 DNM 亚型中的每个都显示不同的定位配置文件。因此, DNM1 的特点是相对温和的弥漫性标记的附睾细胞在整个初始段和额附睾 (图 2A)。相比之下, DNM2 异构体首先检测到在最初的部分细胞的对立的基底和顶端边界附近, 然后被重?...

讨论

这些研究纳入了使用 Bouin 的固定附睾组织, 已受到石蜡嵌入和标准切片协议。Bouin 的固定液包括甲醛、苦味酸酸和乙酸的混合物, 每个组分具有特定的互补作用。因此, 甲醛与原胺反应形成蛋白交联, 苦味酸酸慢慢穿透组织形成的盐, 从而使碱性蛋白凝固, 反之, 醋酸迅速穿透组织, 导致凝血核酸。这些组合的性质产生了 Bouin 作为一个固定的选择保存的形态学细节, 它的使用被广泛报道的附睾文献。?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

提交人要感谢澳大利亚国家卫生和医学研究理事会项目赠款 APP1103176 支持这项工作。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dynamin 1 antibodyAbcamab108458Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibodySanta Cruzsc-6400Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibodyProteintech14737-1-APHost species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibodySanta Cruzsc-21206Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibodyBD Pharmingen553758Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibodySigmaF1180Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibodyAbcamab80221Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibodySanta Cruzsc-5274Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibodyAbcamab11436Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488ThermoA11008Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488ThermoA11055Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594ThermoA11058Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594ThermoA11007Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRPMilliporeDC01LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9564
propidium iodide (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutamineThermo25030-081
penicillin/streptomycinThermo15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
sodium pyruvateThermo11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyde (PFA)EMS15710
XyleneVWR Chemicals1330-20-7
EthanolVWR Chemicals64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417
Sodium citrateSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycerolSigmaG5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octaneSigmaD2522
Poly-L-gysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Trypan blueSigmaT6146
Trichloroacetic acidSigmaT9159
AcetoneAjax FinechemA6-2.5 L GL
SucroseSigmaS0389
Poly (vinyl alcohol)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Fluorescence microscopyZeissZeiss Axio Imager A1
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MicrocentrifugesEppendorf5424R
IncubatorHeracell150
Large Orbital ShakerRatekOM7
MicrowaveLGMS3840SR /00
Lab pH MeterMeterLabPHM220
Liquid-repellent slide markerDaido SangyoMini
CoverslipThermo586
6 well plateCELLSTAR657160
12 well plateCELLSTAR665180
SlideMikro-GlassSF41296PLMK
0.45 µm filterMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustfree PaperKIMTECH34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Cell strainer 70 µm NylonFALCON352350
Petri dish 35 × 10 mm with camsSARSTED82.1135.500
Slide jarTRAJAN#23 319 00

参考文献

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