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요약

여기, 우리 보고 dynamin 파라핀 끼워 넣어진 마우스 epididymal 섹션에 있는 단백질의 검출 및 불멸 하 게 epididymal 셀 라인 (mECap18)의 프로토콜을 설명 하기 위해의 면역 형광 지역화 합니다. 우리는 또한 epididymal 액체 및 조건된 셀 미디어에서 분 비 단백질의 격리에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

초록

포유류 epididymis 후 고환 성숙과 정 충의 저장소를 지원 하기 위해 모든 내 분 비 동맥의 가장 복잡 한 intraluminal 체액 중 하나를 생성 합니다. 이러한 복잡성 라이닝 상피 세포의 결합된 분 비 및 흡수 성 활동으로 인해 발생합니다. 여기, 우리 dynamin (DNM) mechanoenzymes;의 모델 단백질 가족에 초점을 맞춤 으로써 epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석을 위한 기법을 설명 양방향 멤브레인 밀매 이벤트 규제 가능성이 있는 큰 GTPases Epididymal 조직에서 단백질 식의 연구를 위해 우리는 면역 형광 라벨 파라핀 포함 섹션에서 대상 단백질과 통해이 단백질의 공간 배급의 후속 검색에 대 한 강력한 방법론을 설명 면역 형광 검사 현미경 검사 법입니다. 우리는 또한 격리 및 소포, 정자 세포를 성숙 세포 통신에 참여할 수 epididymal 루멘으로 은닉 되는 epididymosomes로 알려진 같은 exosome의 특성화에 대 한 최적화 된 방법론을 설명 합니다. 상호 보완적인 접근, 우리 또한 SV40 불후 마우스 caput epididymal 상피 (mECap18) 셀 라인에서 대상 단백질의 면역 형광 탐지 설명. 또한, 우리는 모델을 적합 한 생체 외에서 epididymal 분 비 활동의 규칙을 탐구 하는 mECap18 셀 라인의 유틸리티 설명. 이 목적을 위해 우리는 mECap18 세포 선 및 그들의 분 비 단백질 프로 파일에 영향을 미치는 수 있는 선택적 약리 억제 요법의 사용의 유지 보수에 대 한 자란 요구 사항을 설명 합니다. 후자는 쉽게 수확 바른된 문화 매체, trichloroacetic 산/아세톤 강 수를 통해 분 비 단백질의 농도 및 SDS 페이지 및 immunoblotting 통해 그들의 후속 분석을 통해 평가 합니다. 우리는이 결합 된 메서드는 정자 성숙 및 저장에서 그들의 기능적인 역할을 결정 하는 전주곡으로 대체 epididymal 단백질 목표의 분석에 적합 다 투 다.

서문

모든 포유류 종의 정 충 취득 표시 앞으로 진보적인 운동 잠재력 epididymis 수 남성 외 고환 덕트 시스템의 전문된 영역을 통해 그들의 장기 하강 동안 한 ovum를 기름 지 게 (종)에 따라 이동 7-14 일1. 아버지 chromatin의 극단적인 응축 및 testes에서 정 충의 cytodifferentiation와 함께 제공 되는 세포질의 대부분의 흘리기, 그들의 후속 기능 성숙의 상호 작용에 의해 독점적으로 구동 됩니다. 와 함께 epididymal microenvironment. 이 환경, 차례 차례로, 라이닝 epididymal 소마의 분 비 및 흡수 활동에 의해 만들어지고 세그먼트 세그먼트 변형1의 뛰어난 수준을 표시. 따라서, 단백질 합성 및 분 비 활동적인 세그먼트 epididymis (즉, 증 류 및 코 퍼스)2의 근 위 부분에 있는 있습니다. 이 활동 거울 기능 능력의 표시 셀 첫 처음으로 정 충의 기능 프로 파일 (즉,., 진보적인 운동 및 산 solubilized zona glycoproteins 바인딩할 수) 다음 그들의 caput epididymis3통로입니다. 이러한 기능적인 특성 정자 도달 원심 epididymal 세그먼트 (cauda), 어떤 점에서 그들은 사정에 대 한 준비에는 무부하 상태에 저장 됩니다로 서 최적의 수준에 도달 하기 전에 개발을 계속 합니다. 형성 및이 정자 저장 저수지의 유지 보수는 라이닝 상피는 cauda에서 강한 흡수 활동4,5에 의해 지배 되는에 또한 밀접 하 게 연관 됩니다. 비록 해부학 적 차이 보고6,7,8, 이러한 지역적인된 분업이 나타납니다 포유류 종의 대부분 공유 되 epididymis의 특성 날짜, 우리 자신의9,10를 포함 하 여 공부 했다. 실제로, 임상의 관점에서 그것은 알려져 그 epididymal 부전 남성 요인 불 임11, 따라서이 전문된 조직의 규칙을 이해의 중요성을 강조 표시의 병 인에 중요 한 기여를 하 게.

그것은 그러므로 유감 epididymal 생리학의 우리의 이해 및 정자 성숙 및이 조직 내에서 스토리지의 순차적 단계를 조절 하는 메커니즘 완전 해결 될 남아 있다. 기여 요인 들 중 epididymal 연구에서 제한 발전이 조직의 전반적인 복잡성과 규제 제어할 자사의 luminal microenvironment 메커니즘의 지식이 있습니다. 해부학, 우리는 caput, 코 퍼스 및 cauda 세그먼트의 구별을 넘어는 epididymis 여러 영역 (그림 1A)로 더 세분화 될 수 있습니다, 알고 각 septa12 으로 구분 하 고 개별 프로필 유전자/단백질의 특징 식13,14,15,,1617,18. 실제로, 상세한 transcriptional 프로 파일링에 epididymis 단편 유전자 발현의 기준으로 6 하 고 9 가지 epididymal 영역 각각19,20마우스와 쥐 모델에서 보고 되었습니다. 이러한 복잡성은 아마도 epididymal 소마, 수많은 다른 세포 유형; 구성 pseudostratified 상피의 구성 반영 각 관의 길이 따라 그들의 풍부, 유통 및 분 비 흡수 성 활동에 대해 서로 다른. 따라서, 주 세포는 지금까지 가장 풍부한 epididymal 셀 유형 구성 모든 상피 세포의 80% 이상. 따라서, 주 셀 epididymal 단백질 생 합성 및 분 비5의 대량에 대 한 책임이 있습니다. 대조적으로, epididymal 소마 내에서 두 번째로 가장 풍부한 셀 형식으로 순위, 명확한 세포 인구는 주로 luminal 구성 요소의 선택적 흡수와이 microenvironment5의 산성화에 참여. 복잡성의 또 다른 계층을 추가, androgens 및 다른 lumicrine 요인 고환 근원의 이러한 epididymal 종류의 세포는 따라 그들의 위치에 따라 각 차동 제어를 발휘 한다.

이러한 복잡성에 의해 부과 된 한계에도 불구 하 고 뜻깊은 침해 epididymal 함수의 기계적으로 해결로 만들 수 계속. 이러한 연구를 키 고급 질량 분석 전략의 응용 프로그램 이러한 초기 설문 조사 중에서 선택 하는 개별 단백질의 상세한 분석에 epididymal 프로테옴의 대규모 재고 설정 되었습니다. 이 방법의 그림은 마우스 모델21에 mechanoenzymes의 DNM 가족의 우리의 최근 특성화. DNM에 우리의 초기 관심 및 endocytotic 프로세스의 결합에서의 듀얼 액션에 의해 연료 했다. 이러한 관측에 건물, 우리 DNM (DNM1-DNM3)의 세 정식 isoforms 높은 마우스 epididymis 표현 되며 단백질 분 비 및 흡수21에서 규제 역할을 수행 하기 위해 적절 하 게 위치를 보여줄 수 있었다 . 또한, 우리 수 있었다 명확 하 게 그들의 세포질 부 세포 현지화 기준 각 DNM isoform를 차별화 하는 따라서 그들은 보완, epididymal 상피21내 중복 활동 반대로 소유 제안.

우리가 희망이 정보 대체 epididymal 단백질의 특성에서 광범위 한 응용 프로그램을 찾을 것입니다 및 따라서 기여할 마우스 epididymis DNM 식의 연구에 대 한 고용 실험 방법론을 설명 하는 여기, 우리의 남성 생식 관의이 중요 한 요소의 기능의 이해. 특히, 우리는 면역 형광 라벨 파라핀 끼워 넣어진 epididymal 섹션에서 대상 단백질과 면역 형광 검사를 통해 이러한 단백질의 공간 배급의 후속 검색에 대 한 강력한 방법론의 개발을 설명 현미경 검사 법입니다. 우리는 더 격리 및 epididymosomes;의 특성화에 대 한 우리의 최근 최적화 된 프로토콜22 문서 epididymal 분 비 프로필의 핵심 요소를 구성 하 고 정자 성숙23홍보에 저명한 역할을 표시 하는 작은 exosome 같은 소포 상호 보완적인 접근, 우리 또한 설명 하는 불멸 하 게 마우스 caput epididymal 상피 (mECap18) 셀 라인에서 대상 단백질의 면역 형광 탐지 및 epididymal의 규정을 탐험 하는 모델로이 리소스를 사용 하 여 분 비 활동 체 외

프로토콜

동물 조직 컬렉션을 포함 하는 모든 실험 절차는 뉴캐슬 대학 동물 관리 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 면역 형광 염색 파라핀 끼워 넣어진 Epididymal 섹션 (그림 1 및 2)의

  1. CO2 흡입 (스위스 쥐, 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사, 직후에 신중 하 게 (를 사용 하 여 수술가 위, 핀셋) epididymis 해 부의 결합 조직 및 지방 overlying 자유롭고 Bouin의 정착 액에 젖어 솔루션 (> 10 배 볼륨/조직 무게) 야간 고정을 위한.
  2. 2 일 동안 매일 2 × 변화 70% 에탄올과 조직을 세척 하 고 탈수 등급된 에탄올 (70%, 95% 및 100%)를 통해 침투 하 고 파라핀 블록으로 삽입에 대 한 준비.
  3. 섹션 4-6 µ m 및 면역 형광 염색을 위한 준비에서 슬라이드에 한 두께에 파라핀 블록.
  4. 증기 두건에서 epididymal 파라핀 섹션을 완전히 조직 섹션 (3 × 5 분 각 시간) 담가 슬라이드 항아리에 크 실 렌의 충분 한 금액을 추가 하 여 dewax.
  5. 순화 된 H2O 희석 등급된 에탄올 솔루션에 침수에 의해 조직 단면도 rehydrate (100% 에탄올 5 분, 100% 에탄올 5 분, 1 분, 80% 에탄올 1 분, 70% 에탄올 90% 에탄올 1 분, 그리고 50% 에탄올 1 분).
  6. 슬라이드 단지 충분 한 버퍼링 인산 염 분 완전히 몰입할 전체 조직 섹션 (PBS)와 5 분 동안 한 번에 섹션을 세척 (모든 후속 세척에 대 한 이러한 지침을 따르십시오).
  7. 적절 한 항 원 검색 솔루션을 가만히 따르다 (즉., 10 mmol/L 나트륨 시트르산, 50 mmol/L 트리 스 pH 10.5 또는 다른 항 원 검색 솔루션, 검색 항 원에 따라) 슬라이드 랙 및 끓는까지 마이크로파에. 이 솔루션으로 슬라이드를 담가 그리고 열 유발 항 원 검색 조건 ( 표 1참조) 개별 항 체에 대 한 최적화 된 조직 단면도 주제.
    주의: 슬라이드 antigen 검색 과정에서 항 원 검색 솔루션에 완전히 몰입 하 확인 하십시오.
  8. 실내 온도에 전자 레인지와 멋진 슬라이드 컨테이너를 제거 합니다.
  9. PBS와 슬라이드를 헹 구 고 추적에 액체 방수 제 슬라이드 마커 펜을 사용 하 여 조직 섹션 주위.
  10. (컨테이너의 기지에서 moistened 조직에 의해 생성), 습도 컨테이너에 슬라이드를 놓고 차단 솔루션 적용 (3 %BSA / PBS, 이전 필터링 0.45 μ m 필터를 통해) 37 ° c.에 1 시간에 대 한
  11. PBS 한번 슬라이드 린스.
  12. 필터링 된 1%에서 실험적으로 최적화 된 농도를 희석 하는 적절 한 기본 항 체와 섹션을 품 어 하룻밤에 4 ° C에서 BSA/PBS (1:60 안티-DNM1, DNM2 및 DNM3에 대 한 항 체, 안티-ATP6V1B1 항 체에 대 한 1: 100 테이블의 자료를 참조 항 체 세부 사항을 위해).
    참고: 구별을 일반적인 항 체 바인딩에서 특정 그것은 엄격한 네거티브를 포함 하는 데 필요한 (즉., 이차 항 체만, 1 차 항 체 펩 티 드 면역에 대 한 preabsorbed)와 긍정적인 컨트롤24.
  13. 30 분 동안 실내 온도에 배치 하 여 슬라이드를 rewarm.
  14. 씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.
  15. 1%에 희석 적절 한 이차 항 체와 섹션을 품 어 BSA/PBS (0.45 μ m 필터를 통해 필터링) 1 시간 동안 37 ° C에서 (1:400 희석 모든 이차 항 체에 대 한 항 체 세부 정보에 대 한 재료의 표 참조).
    주의:이 단계 이후부터 어둠 속에서 슬라이드 컨테이너를 유지. 듀얼 라벨에 대 한 2 차 항 체의 호환 조합을 선택 (즉., 2 차 항 체 종에서 제기 되었습니다 해야 합니다).
  16. 씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.
  17. Propidium 요오드 화물 (PI, 7.48 μmol/L) 또는 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) 세포 핵을 실 온에서 2 분에 대 한 섹션 counterstain
  18. 5 분 동안 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 두 번 슬라이드를 씻어.
  19. 10 %4-88 Mowiol 0.2 mol/L 트리 (pH 8.5)에 30% 글리세롤의 솔루션에 준비 섹션을 탑재 및 2.5 %1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-옥 탄.
  20. 손톱 광택 coverslip 봉인 하 고 미래 관측을 위해 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
    주의: 그것은 이미징 슬라이드의 즉시 실용적인 형광의 과도 한 손실을 방지 하기 위해 준비 후 수행 하 고 좋습니다.

2 절연 마우스 Caput Epididymis (그림 3)에서 Epididymosomes의

  1. CO2 흡입 (스위스 쥐 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사 후 즉시 (미리 예 열 37 ° C에) epididymal 조직의 혈액 오염을 최소화 하기 위해 PBS를 가진 그들의 맥 관 구조를 perfuse.
    주의: 혈장 epididymosomes25비슷한 크기의 exosomes의 다양 한 인구를 포함 합니다. Epididymal 조직에서 혈액 클리어런스의 효능을 액세스할 수 있는 초기 세그먼트의 검사를 통해 매우 vascularized epididymal 세그먼트 caput 세그먼트에 인접 위치 (즉,., 그림 1A에서 1 영역)
  2. 조심 스럽게 표면에 대 한 가능성을 줄이기 위해 overlying 및 결합 조직, 지방과 린스 수정 Biggers, Whitten, 및 Whittingham 매체 (BWW; pH 7.4, 300 mmol/kg 물26,27의 osmolality) 무료로 epididymis 해 부 혈액 오염입니다.
  3. 오 점 제거 초과 미디어, 해 부 caput epididymis epididymal 조직 (즉., 2-5에서 그림 1A지역) BWW 매체를 포함 하는 신선한 페 트리 접시 (35 × 10 m m)에 전송. 매체의 양은 최종 복구에 대 한 충분 한 인지 확인 합니다.
    참고: 6 caput epididymides, 그것 것이 좋습니다 ~ 900 µ L 넣고 균일 하 게 분할 (단계 2.9 참조) 2 미리 준비 된 기온 변화도의 위에 적용의 복구에 대 한 허용 하는 매체의 1.1 mL를 사용 하.
  4. 면도날으로 caput 조직으로 작은 incisions의 번호를 확인 합니다. 조직 말하다 하지 고 따라서 과도 한 cytosolic 내용으로 샘플을 오염 하지 마십시오. Luminal 내용을 공개 30 분 동안 37 ° C에서 온화한 동요와 조직을 포함 하는 접시를 품 어.
  5. 세포질 파편을 제거 하려면 70 µ m 세포 막을 통해 결과 정지를 필터링 합니다.
  6. filtrate 수집 및 세포질 파편을 제거 하기 위하여 속도 증가 함께 4 ° C에서 연속 원심 분리 단계에이 대상 (즉,., 500 × g, 2000 × g, 4000 × g, 8000 × g, 5 분 각; 17000 × g 20 분, 그리고 마지막으로 17000 × g 추가로 10 분 또는 아무 펠 릿은 원심 분리 후 형성 될 때까지).
    주의: 그것은 최소한의 혈액 오염 존재가 되도록 초기 500 × g 원심 분리 단계 후 펠 릿의 색상을 평가 하는 것이 중요. 이 펠 릿 핑크 채색을 표시 하는 모든 샘플을 삭제 합니다.
  7. 0.25 mol/L 자당 및 10 mmol/L 트리 (pH 7.5)의 솔루션 (60% (w/v) 수성 iodixanol 함유) 밀도 그라데이션 매체를 diluting 하 여 불연속 iodixanol 그라데이션 (구성 된 40%, 20%, 10%, 5% 레이어)를 준비 합니다.
  8. 450 µ L (그림 3)의 각 일부와 ultracentrifuge 튜브 (11 × 35 m m), 그라디언트를 준비 합니다. 시각 인터페이스는 성공적으로 epididymal 액체 샘플을 로드 하기 전에 각 계층 사이 형성 되도록 각 분수의 신청 후 그라디언트를 검사 합니다. 그러나 각 그라데이션 신선한 사용, 당일 준비, epididymal luminal 액체 샘플 로드 전에 최대 2 h 4 ° C에서 보존 될 수 있습니다.
  9. 신중 하 게 epididymal luminal 유체 (3 epididymides caput에서 수집 된 자료에 해당) 꼭대기의 중단 한 그라데이션의 450 µ L를 추가 합니다.
  10. Ultracentrifuge 18 h 4 ° C에서 160000 × g 에서 그라디언트.
    주의:이 원심 분리는 매우 높은 속도에서 실시 하 고, 이후 모든 ultracentrifuge 튜브 한 쌍이 고 정확 하 게 균형 있습니다. 그들은 그들의 무결성을 손상 시킬 수 있는 어떤 보이는 손상을 무료 수 있도록 튜브를 확인 하십시오.
  11. (각각 185 µ L의 구성 된) 12 동등한 분수 제거 최상위 계층에서 시작 하 고 그라데이션의 하단 쪽으로 진행. 등가 분수는 해당 하는 경우 각 그라데이션에서 복구 (최대 2 개의 그라디언트) 수영장.
    주: epididymosomes는 가장 높은 분수 9-1122, 농축 마우스 그림 4 와 토론을 참조 하십시오.
  12. 복구 및 분수 9-11의 풀링 후 PBS, 그리고 ultracentrifuge의 2 개 mL로 희석 100000 × g h 3 4 ° C에서 (13 × 56 m m 튜브)를 작은 공의 epididymosomes에서 샘플.
    주의: epididymosome 펠 릿 볼 하기가 어려울 수 있습니다, 이후 그들은 회전자에 배치 하 고 튜브를 epididymosome 펠 릿의 기대 위치를 나타내는 표시는 튜브의 방향을 지적 했다 확인 하십시오. 각 튜브에 충분 한 볼륨 포함 되어 있는지 확인 (즉., 전체 용량의 50% 초과) 배제 관 붕괴의 위험에.
  13. 신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 epididymosome 펠 렛을 방해 하지 않고 무시.
  14. Epididymosome 순도 (그림 4)를 평가 합니다.
  15. 다운스트림 응용 프로그램에 따라 원하는 매체로 epididymosome 펠 릿을 resuspend. 예를 들어, BWW 매체 공동 보육 정 충 또는 양자 택일로 SDS-PAGE를 통해 epididymal 프로테옴의 해상도 대 한 준비에 적절 한 세포의 용 해 버퍼와 관련 된 실험에 대 한 일반적으로 사용 됩니다.

3. 면역 형광 mECap18 세포의 얼룩

  1. (셀 문화 후드에서 실시)을 살 균 coverslips의 준비
    1. 에탄올 램프 위의 높은 온도에서 건조 하 여 소독와 10 분 동안 70% 에탄올에 coverslips (12 × 12 mm)을 담근 다.
    2. 10 coverslip 쿨 s 12 잘 접시에 전송 하기 전에.
    3. 하는 coverslip 커버 하 고 실 온에서 10 분 동안 정착 멸 균 폴 리-L-리 신 솔루션을 적용 합니다.
    4. 폴 리-L-리 신 솔루션을 삭제 하 고 살 균 H2O coverslip 린스 또는 적절 한 매체.
  2. 준비 mECap18 셀
    1. 포함 하는 coverslips 12 잘 플레이트의 각 음에 2 × 105 mECap18 셀의 aliquots 통로
    2. MECap18 셀 중간 (DMEM와 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 pyruvate, 1% 페니실린/스, 50l μmol 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 보충) 포함 10% 태아 종 아리 혈 청 (FBS) 분위기 5%에서 37 ° C 배양 기에서 셀 문화 CO2 하룻밤입니다.
    3. 일단 세포는 coverslip 준수, 매체를 삭제 하 고 PBS로 두 번 셀 린스.
    4. 충분 한 양의 4 %paraformaldehyde (PFA) 전체 coverslip 담가 15 분 동안 실 온에서 셀을 수정 하는 PBS에 희석을 추가 합니다.
    5. PFA 솔루션을 삭제 하 고 두 번 PBS에에서는 coverslips를 씻어.
  3. 면역 형광 염색
    1. 0.1%에 침수에 의해 mECap18 세포를 permeabilize 10 분에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100.
    2. PBS 가진 coverslips 린스.
    3. 3 %BSA mECap18 세포를 차단 하 고 immunolabeling epididymal 조직 섹션에 대 한 설명에 해당 프로토콜을 이용 하 여 세포의 진행.

4. 조절된 세포 배양 매체에서 단백질의 격리

  1. 배양 조건된 셀의 컬렉션
    1. 6의 각 음에 4 × 105 mECap18 셀의 통로 aliquots mECap18 셀 중간 10% 보충 잘 접시 FBS 24 h에 대 한.
    2. 잔여 FBS 및 모든 관련 제거 하 mECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비)와 mECap18 셀 세 번 씻어 단백질 오염 물질.
    3. MECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비 하는)의 1.5 mL 각 잘 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5%에서 12 h에 대 한 mECap18 셀으로 품 어 CO2.
      참고:이 단계에서 mECap18 셀 실험적인 디자인에 따라 다른 대상 항 원에 대 한 평가 될 수 있다.
    4. 12 h 배양 후 셀 매체와 모든 세포 파편을 제거 하려면 10 분 2000 × g 에서 원심 분리기를 수집 합니다.
      참고: 외피의 기간 및 적용된 여야 하 셀의 허용 오차를 고려 하 여 실험 디자인/끝점 평가 따라 변경 될 수 있다. 최적의 결과 달성을 보장 하기 위해 특정 실험적인 regimens에 따라 보육의 타이밍을 조정 하는 것이 좋습니다.
    5. 표준 trypan 블루 제외 분석 결과28의 응용 프로그램을 통해 mECap18 세포 생존 능력을 평가 합니다. 세포 생존 능력 90% 죽 었 거 나 죽어가는 셀에서 발표 하는 단백질에 의해 소개 하는 바이어스를 제거 하기 위해 거절 했습니다 모든 자료를 삭제 합니다.
    6. 다음과 같이 셀 중간에서 단백질을 분리 또는-80 ° c.에 매체를 보존
  2. 단백질 절연 (증기 두건에서 실시)
    1. 80% 볼륨 조절된 세포 매체 교양된 mECap18 세포에서 발표 하는 단백질을 침전의 냉장된 100 %trichloroacetic 산 양의 20%를 추가 합니다. 지속적인 혼합으로 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
    2. 부 화 후 원심 분리 하 여 침전 된 단백질을 펠 렛 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C).
      주: 매체에 분 비 될 것으로 예상 하는 단백질의 제한 된 수량에 따라 가능 하다는 펠 릿은 하지 쉽게 시각 수 원심 분리 후. 따라서 올바르게 이전에 원심 분리 관을 찾으시는 기대 펠 릿 위치는 상쾌한의 제거 하는 동안 방해을 않도록 주의 하는 것이 필수적 이다.
    3. 상쾌한 무시 하 고 두 번 다시 원심 분리 전에 냉장된 아세톤으로 펠 릿을 세척 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C).
    4. 조심 스럽게 제거 하 고 어떤 잔여 아세톤 증기 두건 내 공기 전에 상쾌한 삭제.
    5. 끝점 분석 완전 분 비 단백질 프로 파일 및/또는 개별 대상 단백질을 검출 하기 위한 준비에 적절 한 추출 버퍼에 단백질 펠 릿 resuspend (예., immunoblotting SDS 페이지).

결과

그림 1 그리고 그림 2 마우스 caput epididymis DNM의 면역 형광 지역화의 대표적인 결과 보여줍니다. 각각 3 DNM isoforms의 디스플레이 별개 지역화 프로필 조사. 따라서, DNM1 (그림 2A) 초기 세그먼트 및 caput epididymis 걸쳐 epididymal 셀의 상대적으로 겸손 한 확산 라벨 특징 이다. 대조적으로, DNM2 isoform 처?...

토론

이러한 연구는 Bouin의 고정된 epididymal 조직 파라핀 포함 및 표준 단면 프로토콜을 받게 되었습니다 했다를 사용 하 여 통합. Bouin의 통 솔루션 각 구성 요소는 특정 하 고 상호 보완적인 기능을가지고 picric 산, 포 름 알 데히드, 초 산의 혼합물을 함유 한다. 따라서, 단백질 상호 링크를 기본 아민과 반응 하는 포름알데히드, picric 산 천천히 소금 형성 조직 침투 하 고 따라서 기본 단백질과 반대로, 초...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자가이 작업의 지원에 대 한 국민 건강 및 의료 연구 위원회의 오스트레일리아 프로젝트 그랜트 APP1103176를 인정 하 고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Dynamin 1 antibodyAbcamab108458Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibodySanta Cruzsc-6400Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibodyProteintech14737-1-APHost species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibodySanta Cruzsc-21206Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibodyBD Pharmingen553758Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibodySigmaF1180Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibodyAbcamab80221Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibodySanta Cruzsc-5274Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibodyAbcamab11436Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488ThermoA11008Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488ThermoA11055Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594ThermoA11058Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594ThermoA11007Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRPMilliporeDC01LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9564
propidium iodide (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutamineThermo25030-081
penicillin/streptomycinThermo15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
sodium pyruvateThermo11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyde (PFA)EMS15710
XyleneVWR Chemicals1330-20-7
EthanolVWR Chemicals64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417
Sodium citrateSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycerolSigmaG5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octaneSigmaD2522
Poly-L-gysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Trypan blueSigmaT6146
Trichloroacetic acidSigmaT9159
AcetoneAjax FinechemA6-2.5 L GL
SucroseSigmaS0389
Poly (vinyl alcohol)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Fluorescence microscopyZeissZeiss Axio Imager A1
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MicrocentrifugesEppendorf5424R
IncubatorHeracell150
Large Orbital ShakerRatekOM7
MicrowaveLGMS3840SR /00
Lab pH MeterMeterLabPHM220
Liquid-repellent slide markerDaido SangyoMini
CoverslipThermo586
6 well plateCELLSTAR657160
12 well plateCELLSTAR665180
SlideMikro-GlassSF41296PLMK
0.45 µm filterMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustfree PaperKIMTECH34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Cell strainer 70 µm NylonFALCON352350
Petri dish 35 × 10 mm with camsSARSTED82.1135.500
Slide jarTRAJAN#23 319 00

참고문헌

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