Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui, nós relatamos a localização de imunofluorescência de Dinamina para ilustrar os protocolos para a detecção de proteínas em seções epidídimo de rato de parafina e aqueles de uma linhagem de células epidídimo imortalizado (mECap18). Também descrevemos os protocolos para o isolamento de proteínas secretoras do epidídimo fluido e mídia celular condicionados.

Resumo

O epidídimo mamíferos gera um dos mais complexos fluidos intraluminal de qualquer glândula endócrina para oferecer suporte a maturação pós-testicular e armazenamento de espermatozoides. Tal complexidade surge devido a atividade secretora e absorvente combinada das pilhas epithelial forro. Aqui, descrevemos as técnicas para a análise da secreção e síntese de proteínas epidídimo, centrando-se sobre a família de proteínas de modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPases grandes que têm o potencial para regular eventos de tráfico membrana bi-direcional. Para o estudo da expressão da proteína no tecido epidídimo, descrevemos a metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas secções de parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através microscopia de imunofluorescência. Também descrevemos a metodologia otimizada para o isolamento e caracterização de exossomo como vesículas, conhecido como epididymosomes, que são secretadas no lúmen epidídimo para participar na comunicação intercelular com maturação de células de esperma. Como uma abordagem complementar, também descrevemos a detecção de imunofluorescência de proteínas alvo em uma linhagem de células do rato SV40-imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18). Além disso, podemos discutir o utilitário da linha de celular mECap18 como um modelo adequado em vitro com para explorar a regulação da atividade secretora epidídimo. Para este fim, descrevemos as exigências de cultivo para a manutenção da linhagem celular mECap18 e o uso de esquemas de inibição farmacológica seletiva que são capazes de influenciar seu perfil de proteínas secretoras. Os últimos são prontamente avaliaram através da colheita de condicionados de meio de cultura, concentração de proteínas secretadas através de precipitação do ácido tricloroacético/acetona e sua posterior análise através de SDS-PAGE e immunoblotting. Podemos afirmar que esses métodos combinados são apropriados para a análise de alternativas de proteína epidídimo alvos como um prelúdio para determinar seu papel funcional na maturação do esperma e/ou armazenamento.

Introdução

Os espermatozoides de todas as espécies de mamíferos adquirem o potencial para exibir motilidade progressiva e para fertilizar um óvulo durante a sua descida prolongada através do epidídimo, uma região altamente especializada do sistema masculino adesiva extra testicular, que pode 7-14 dias para navegar (dependendo da espécie)1. Devido a extrema condensação da cromatina a paterna e o derramamento da maioria do citoplasma que acompanha a cytodifferentiation de espermatozoides nos testículos, sua maturação funcional subsequente é conduzida exclusivamente por sua interação com o microambiente epidídimo. Neste meio é, por sua vez, criado pela atividade secretora e absorvente da soma de epidídimo forro e exibe um nível excepcional de variação de segmento-segmento1. Assim, os segmentos mais ativos em termos de síntese proteica e secreção são aqueles localizados na porção proximal do epidídimo (ou seja, o caput e corpus)2. Esta actividade espelha o perfil funcional de espermatozoides, com o início de primeira células para exibir marcas de competência funcional (i. e., motilidade progressiva e a capacidade de ligar a zona do ácido-solubilizado glicoproteínas) seguir seus passagem do caput epidídimo3. Esses atributos funcionais continuam a desenvolver-se antes de atingir os níveis ideais como o esperma alcançar o segmento distal epidídimo (cauda), onde eles são armazenados em estado quiescente em prontidão para a ejaculação. A formação e a manutenção deste reservatório de armazenamento de esperma está também intimamente ligada do epitélio de revestimento, que na cauda é dominado pela forte atividade de absorção4,5. Apesar de diferenças anatômicas foram relatados6,7,8, tal divisão regionalizada do trabalho parece ser uma característica do epidídimo que é compartilhado entre a maioria das espécies de mamíferos estudou até à data, incluindo a nossa própria9,10. Com efeito, do ponto de vista clínica, é conhecido que disfunção do epidídimo faz uma importante contribuição para a etiologia do fator masculino infertilidade11, destacando assim a importância de compreender o Regulamento deste tecido especializado.

Assim, é lamentável que o nosso entendimento da fisiologia do epidídimo e os mecanismos que regulam as fases sequenciais de maturação de espermatozoides e armazenamento dentro deste tecido, continuam a ser totalmente resolvido. Entre os fatores que contribuem, limitantes avanços na pesquisa do epidídimo são a complexidade geral deste tecido e conhecimento dos mecanismos que exercem o controlo regulamentar sobre seu microambiente luminal. Anatomicamente, sabemos que, para além da distinção de segmentos caput, corpo e cauda, epidídimo pode ser subdividido em várias zonas (figura 1A), cada um separados por septos12 e caracterizada por perfis distintos de gene/proteína expressão13,14,15,16,17,18. Com efeito, com base em detalhada transcriptional perfilamento segmental da expressão do gene no epidídimo, até 6 e 9 zonas epidídimo distintas têm sido relatadas em modelos do rato e do rato, respectivamente de19,20. Tal complexidade presumivelmente reflete a composição da soma do epidídimo, um epitélio pseudoestratificado composto por numerosos tipos de células diferentes; cada diferindo em relação a suas atividades de abundância, distribuição e secretora/absorção ao longo do comprimento do trato. Assim, as células principais são de longe a mais abundante epidídimo célula tipo que constituem mais de 80% de todas as células epiteliais. Assim, as células principais são responsáveis pela maior parte da proteína epidídimo biossíntese e secreção de5. Em contraste, a população de células claras, que classificar como o tipo de célula a segunda mais abundante dentro do epidídimo soma, está principalmente envolvida na absorção seletiva de componentes luminal e a acidificação deste microambiente5. Adicionar outra camada de complexidade, andrógenos e outros fatores de lumicrine de origem testicular exercem controle diferencial sobre cada um desses tipos de células do epidídimo, dependendo de seu posicionamento ao longo do trato.

Apesar das limitações impostas pelo tal complexidade, incursões significativas continuam a ser feito para resolver a base mecanicista da função do epidídimo. Uma chave para estes estudos tem sido a aplicação de estratégias avançadas espectrometria de massa para estabelecer inventários de larga escala de proteome o epidídimo, em conjunto com análises detalhadas das proteínas individuais, seleccionadas de entre essas pesquisas iniciais. Uma ilustração desta abordagem é nossa recente caracterização da família de mechanoenzymes no rato modelo21de DNM. Nosso interesse inicial em DNM foi alimentado por sua ação dupla no acoplamento de exo - e processos endocytotic. Baseando-se estas observações, fomos capazes de demonstrar que as três isoformas canônicas de DNM (DNM1 - DNM3) são altamente expressa no epidídimo de rato e adequadamente posicionadas para atender funções reguladoras na secreção de proteínas e absorção21 . Além disso, fomos capazes de diferenciar claramente cada isoform DNM com base em sua localização celular e sub celular, sugerindo que eles possuem complementares, em oposição à atividade redundante, dentro do epitélio do epidídimo21.

Aqui, descrevemos a metodologia experimental empregada para o estudo da expressão de DNM no epidídimo de rato com a esperança que esta informação será encontrar ampla aplicação na caracterização de proteínas epidídimo alternativas e, assim, contribuir para nossa compreensão da função desse elemento importante do aparelho reprodutor masculino. Especificamente, descrevemos o desenvolvimento da metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas seções epidídimo parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através de imunofluorescência microscopia. Documentamos ainda mais nossos protocolos recentemente otimizado22 para o isolamento e caracterização de epididymosomes; exossomo-como pequenas vesículas que constituem elementos-chave do epidídimo perfil secretora e parecem manter um papel de destaque na promoção de maturação do esperma23. Como uma abordagem complementar, descrevemos também a detecção de imunofluorescência de proteínas do alvo em uma linhagem de células do rato imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18) e o uso deste recurso como um modelo com o qual deseja explorar o Regulamento do epidídimo a atividade secretora em vitro.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo a coleção de tecidos animais foram aprovados pelo cuidado Animal e Comitê de ética da Universidade de Newcastle.

1. imunofluorescência coloração das seções parafina epidídimo (figuras 1 e 2)

  1. Imediatamente após a eutanásia de ratos adultos através da inalação de CO2 (camundongos suíços, mais de 8 semanas de idade), dissecar cuidadosamente o epidídimo (utilizando tesouras cirúrgicas e uma pinça) livre de sobrejacente do tecido conjuntivo e gordura e mergulhe no fixador de Bouin solução (> 10 vezes o peso do volume/tecido) para fixação durante a noite.
  2. Lave o tecido com etanol a 70% com 2 × alterações diariamente por 2 dias e em seguida, desidrata-se através de classificados etanol (70%, 95% e 100%) em preparação para a infiltração e incorporação em um bloco de parafina.
  3. Seção os blocos de parafina em uma espessura de 4-6 µm e montagem nos slides em preparação para a mancha da imunofluorescência.
  4. Em uma coifa, dewax as secções de parafina epidídimo, adicionando uma quantidade suficiente de xileno na jarra de slide para imergir completamente a secção de tecido (3 × 5 min cada vez).
  5. Hidratar as secções de tecido pela imersão em soluções gradual do etanol diluído em purificado H2O (100% etanol 5 min, 5 min, 90% etanol 1 min, 80% de etanol 1 min, 70% de etanol 100% de etanol 1 min e 50% de etanol 1 min).
  6. Lave as seções em um frasco de slide uma vez por 5 min com suficiente salina tamponada fosfato (PBS) para imergir completamente a seção inteira de tecido (siga estas instruções para todas as lavagens subsequentes).
  7. Decantar a solução de recuperação de antígeno apropriado (i. e., 10 mmol/L citrato de sódio, 50 mmol/L Tris pH 10,5 ou da antígeno alternativos de recuperação ou mais soluções, dependendo do antígeno a ser detectado) em um porta-lâminas e microondas até ferver. Mergulhe os slides para esta solução e sujeita as secções de tecido para condições de recuperação de antígeno induzida por calor otimizadas para anticorpos individuais (ver tabela 1).
    Cuidado: Certifique-se que os slides estão totalmente imersos em solução de recuperação de antígeno durante o processo de recuperação de antígeno.
  8. Retire o recipiente de slide do microondas e esfriar a temperatura ambiente.
  9. Lave os slides com PBS e use uma caneta de marcador de slide líquido repelente para rastreamento em torno da seção de tecido.
  10. Coloque as lâminas em um recipiente umidificado (criado por um tecido umedecido na base do recipiente) e aplicar solução de bloqueio (3% BSA/PBS, previamente filtrada através de um filtro de 0,45 µm) para 1 h a 37 ° C.
  11. Enxágue as lâminas uma vez com PBS.
  12. Incubar as secções com anticorpo primário apropriado diluído a uma concentração experimentalmente otimizada no filtrado 1% BSA/PBS a 4 ° C durante a noite (1: 60 para anti-DNM1, DNM2 e DNM3 anticorpos; 1: 100 para o anticorpo anti-ATP6V1B1, ver tabela de materiais para obter detalhes de anticorpo).
    Nota: Para distinguir específica de ligação do anticorpo específico, é necessário incluir rigoroso negativo (i. e., anticorpo secundário primário, único anticorpo preabsorbed contra Imunizar do peptide) e controlos positivos24.
  13. Reaquecer os slides, colocando-se à temperatura ambiente por 30 min.
  14. Lave os slides 3 × com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 10 min cada.
  15. Incubar as secções com anticorpo secundário apropriado, diluído em 1% BSA/PBS (filtrada através de um filtro de 0,45 µm) a 37 ° C por 1h (diluição de 1: 400 para todos os anticorpos secundários, consulte Tabela de materiais para obter detalhes de anticorpo).
    Atenção: Manter o recipiente do slide no escuro desta etapa em diante. Para a dupla rotulagem, escolher uma combinação compatível de anticorpos secundários (i. e., anticorpos secundários têm sido levantados em espécies diferentes).
  16. Lave os slides 3 × com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 10 min cada.
  17. Counterstain as seções com iodeto de propidium (PI, 7.48 μmol/L) ou 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) por 2 min à temperatura ambiente para rotular o núcleo da célula.
  18. Lave as lâminas duas vezes com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 5 min cada.
  19. Montar as seções com Mowiol 4-88 preparada em uma solução de 30% de glicerol em 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) de 10% e 2,5% 1, 4 - diazabiciclo-(2.2.2)-octano.
  20. Selar a lamela com verniz das unhas e armazenar os slides a 4 ° C para observação futura.
    Atenção: É aconselhável realizar a imagem dos slides, logo que prático após o preparo para evitar a perda excessiva de fluorescência.

2 isolamento do Epididymosomes do Mouse Caput epidídimo (Figura 3)

  1. Imediatamente após a eutanásia de ratos adultos através da inalação de CO2 (mais de 8 semanas de idade de camundongos suíços), perfundir sua vasculatura com PBS (pré aquecido a 37 ° C) para minimizar a contaminação de sangue do tecido do epidídimo.
    Atenção: o plasma sanguíneo contém diversas populações de exosomes, que são de tamanho similar a epididymosomes25. A eficácia da liberação de sangue do tecido do epidídimo pode ser acessada através da inspeção do segmento inicial, um segmento altamente vascularizado e epidídimo localizado proximal ao segmento caput (i. e., zona 1 na figura 1A)
  2. Dissecar cuidadosamente o epidídimo livre de gordura sobrejacente e tecido conjuntivo e enxágue com meio Biggers, Whitten e Whittingham modificado (BWW; pH 7,4, osmolalidade de 300 mmol/kg água26,27) para reduzir qualquer potencial de superfície contaminação do sangue.
  3. Borre o epidídimo tecido para retirar o excesso mídia, dissecar o epidídimo caput (i. e., zonas de 2-5 na figura 1A) e transferir para um prato de Petri fresco (35 × 10mm) contendo meio BWW. Certifique-se de que a quantidade do meio é suficiente para a recuperação final.
    Nota: Para 6 caput epidídimos, é recomendável usar 1,1 mL do meio para permitir uma recuperação de ~ 900 µ l, que é então uniformemente dividida e aplicada em cima de 2 gradientes pré-preparadas (ver passo 2.9).
  4. Fazer um número de pequenas incisões no caput tecido com uma lâmina de barbear. Não picar o tecido e, assim, evitar contaminar a amostra com excessivo conteúdo citosólica. Incube a placa contendo o tecido com agitação suave a 37 ° C por 30 min liberar o conteúdo luminal.
  5. Filtre a suspensão resultante 70 µm membranas para remover os restos celulares.
  6. Recolher o filtrado e submeta este a etapas sucessivas de centrifugação a 4 ° C, com o aumento da velocidade para eliminar restos celulares (i. e., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min cada; 17.000 × g por 20 min e finalmente 17.000 × g por um adicional 10 min ou até que nenhum sedimento é formado após centrifugação).
    Atenção: É importante para avaliar a cor da pelota após 500 × g centrifugação passo inicial para garantir a contaminação de sangue mínima está presente. Descarte qualquer amostras em que este sedimento exibe coloração rosa.
  7. Prepare-se descontínuo do iodixanol (composto por 40%, 20%, 10%, 5% camadas) diluindo um meio de gradiente de densidade (composta por 60% (p/v) aquosa iodixanol) com uma solução 0,25 mol/L sacarose e 10 mmol/L Tris (pH 7,5).
  8. Prepare o gradiente em um tubo se (11 × 35 mm), com cada fração de 450 µ l (Figura 3). Inspecione visualmente o gradiente após a aplicação de cada fração, para garantir que as interfaces com êxito são formadas entre cada camada antes de carregar a epidídimo amostra de fluido. Preparar cada gradiente fresco no dia do uso, no entanto, a amostra de fluido luminal epidídimo pode ser preservada a 4 ° C por até 2 h antes do carregamento.
  9. Adicione cuidadosamente 450 µ l de epidídimo luminal fluido suspensão (correspondente ao material coletado desde o caput 3 epidídimos) no topo de um gradiente simples.
  10. Se os gradientes a 160.000 × g a 4 ° C por 18 h.
    Atenção: Desde que esta centrifugação é conduzida em alta velocidade, todos os tubos se devem ser emparelhados e equilibrados precisamente. Verifique se os tubos para garantir que eles estão livres de danos visíveis, o que poderiam comprometer sua integridade.
  11. Remova cuidadosamente a 12 fracções iguais (cada um composto por 185 µ l) a partir da camada superior e progredindo em direção a parte inferior do gradiente. Reunir as fracções equivalentes recuperadas de cada gradiente se aplicável (até dois gradientes).
    Nota: O Mouse epididymosomes são mais altamente enriquecido em frações 9-11,22, ver Figura 4 e discussão.
  12. Após a recuperação e o pool de frações 9 – 11, diluir em 2 mL de PBS e se as amostras a 100.000 × g a 4 ° C por 3 h (13 × 56 mm tubo) para o epididymosomes de Pelotas.
    Atenção: Desde a pelota de epididymosome pode ser difícil de ver, certifique-se de que a orientação dos tubos é notar como eles são colocados em um rotor e marcam o tubo para indicar a posição expectante da pelota de epididymosome. Certifique-se de que cada tubo contém um volume suficiente (i. e., superior a 50% da capacidade total) para evitar o risco de colapso do tubo.
  13. Cuidadosamente, aspirar e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento de epididymosome.
  14. Avalie a pureza de epididymosome (Figura 4).
  15. Ressuspender o epididymosome no meio desejado de acordo com o aplicativo (s) a jusante. Por exemplo, meio BWW geralmente é usado para os experimentos envolvendo co incubação com espermatozoides ou, alternativamente, um tampão de Lise apropriado em preparação para a resolução do epidídimo proteome através de SDS-PAGE.

3. imunofluorescência coloração de células mECap18

  1. Preparação de lamelas estéril (para ser realizado em uma capa de cultura de células)
    1. Mergulhe as lamelas (12 × 12 mm) em etanol a 70% por 10 min e desinfectar por secagem sob a alta temperatura acima de uma lâmpada de etanol.
    2. Legal a lamela para 10 s antes de transferir para um prato bem 12.
    3. Aplica a solução estéril de poli-L-lisina para cobrir a lamela e se contentar com 10 min à temperatura ambiente.
    4. Descartar a solução de poli-L-lisina e enxaguar a lamela com estéril H2O ou médio.
  2. Células mECap18 de preparação
    1. Passagem as alíquotas de 2 × 105 mECap18 células em cada poço da placa bem 12 contendo as lamelas.
    2. Cultura de células com mECap18 celular médio (DMEM suplementado com 1% L-glutamina, piruvato de sódio 1%, 1% penicilina/estreptomicina e 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) com vitela fetal 10% soro (FBS) em uma incubadora de 37 ° C sob uma atmosfera de 5% CO2 durante a noite.
    3. Uma vez que as células aderirem a lamela, descartar o meio e enxágue as células duas vezes com PBS.
    4. Adicione uma quantidade suficiente de paraformaldeído 4% (PFA) diluída em PBS, mergulhe a lamela toda e corrigir as células à temperatura ambiente por 15 min.
    5. Descartar a solução PFA e enxágue as lamelas duas vezes em PBS.
  3. Mancha da imunofluorescência
    1. Permeabilize mECap18 células por imersão em 0,1% Triton X-100 em PBS por 10 min.
    2. Enxague as lamelas com PBS.
    3. Bloquear células mECap18 com 3% de BSA e proceder com immunolabeling de células utilizando protocolos equivalentes àquelas descritas para o epidídimo cortes histologicos.

4. isolamento de proteínas do meio de cultura celular condicionado

  1. Coleção de meio de cultura celular condicionado
    1. Alíquotas de passagem de 4 × 105 mECap18 células em cada poço de 6 bem a placa com meio de célula mECap18 suplementado com 10% FBS por 24 h.
    2. Lavar as células mECap18 três vezes com meio de celular mECap18 (preparado sem FBS) para remover FBS residual e qualquer associado contaminantes de proteína.
    3. Adicione 1,5 mL de meio de celular mECap18 (preparado sem FBS) a cada poço e incubar com células mECap18 para 12h em uma incubadora de 37° C abaixo de 5% de CO2.
      Nota: mECap18 células neste passo podem ser avaliadas por antígenos alvo diferentes de acordo com o projeto experimental.
    4. Após a incubação de 12 h, colete o meio celular e centrifugar a 2.000 × g por 10 min remover todos os restos celulares.
      Nota: A duração da incubação é capaz de ser alterada de acordo com a avaliação do projeto experimental/ponto de extremidade e tendo em consideração a tolerância da célula de treatment(s) aplicada. Recomenda-se ajustar o tempo de incubação, com base em regimes experimentais específicos para assegurar que sejam alcançados resultados óptimos.
    5. Avalie a viabilidade de celular mECap18 através da aplicação de um padrão trypan azul exclusão do ensaio28. Descarte todo o material em que a viabilidade celular tem diminuído abaixo de 90% para eliminar o viés introduzido por proteínas libertadas de células mortas ou moribundas.
    6. Isolar proteínas do meio celular como segue ou preservar médio a-80 ° C.
  2. Isolamento da proteína (a ser realizado em uma coifa)
    1. Adicione 20% do volume de refrigerados ácido tricloroacético de 100% para 80% volume de meio de celular condicionados para precipitar as proteínas libertadas das células cultivadas mECap18. Incube a 4 ° C durante a noite com uma mistura constante.
    2. Após a incubação, pelota proteína precipitada por centrifugação (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).
      Nota: Devido a quantidade limitada de proteína que esperava para ser secretado para o meio, é possível que o sedimento não ser facilmente visualizado após a centrifugação. Portanto, é imperativo para orientar o tubo antes da centrifugação e tome cuidado para não perturbar o local da pelota expectante durante a remoção do líquido sobrenadante corretamente.
    3. Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com acetona gelada antes da re-centrifugação a (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).
    4. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante antes de secando qualquer acetona residual dentro de uma coifa.
    5. Resuspenda o pellet de proteína em um buffer de extração adequada em preparação para a análise de ponto de extremidade detectar a proteína secretora completa de perfis e/ou proteínas individuais do alvo (ex., SDS-PAGE, immunoblotting).

Resultados

Figura 1 e Figura 2 mostram resultados representativos de localização de imunofluorescência de DNM no epidídimo caput do mouse. Cada um das três isoformas DNM investigado exibir localização distintos perfis. Assim, DNM1 caracteriza-se por rotulagem difusa relativamente modesto das células epidídimo durante todo o epidídimo inicial do segmento e caput (Figura 2A). Por outro ...

Discussão

Estes estudos incorporaram o uso de tecido do Bouin fixo epidídimo que tinha sido submetido a incorporação de parafina e protocolos padrão de corte. Fixador solução de Bouin é composto por uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético, com cada componente tem uma função específica e complementar. Assim, formaldeído reage com aminas primárias para formar ligações cruzadas de proteína, ácido pícrico lentamente penetra o tecido formando sais e, portanto, coagulação das proteínas básicas e por...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores que gostaria de agradecer a nacionais de saúde e médico pesquisa Conselho de Austrália projeto Grant APP1103176 pelo apoio deste trabalho.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Dynamin 1 antibodyAbcamab108458Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibodySanta Cruzsc-6400Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibodyProteintech14737-1-APHost species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibodySanta Cruzsc-21206Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibodyBD Pharmingen553758Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibodySigmaF1180Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibodyAbcamab80221Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibodySanta Cruzsc-5274Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibodyAbcamab11436Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488ThermoA11008Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488ThermoA11055Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594ThermoA11058Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594ThermoA11007Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRPMilliporeDC01LHost species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9564
propidium iodide (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutamineThermo25030-081
penicillin/streptomycinThermo15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
sodium pyruvateThermo11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyde (PFA)EMS15710
XyleneVWR Chemicals1330-20-7
EthanolVWR Chemicals64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417
Sodium citrateSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycerolSigmaG5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octaneSigmaD2522
Poly-L-gysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Trypan blueSigmaT6146
Trichloroacetic acidSigmaT9159
AcetoneAjax FinechemA6-2.5 L GL
SucroseSigmaS0389
Poly (vinyl alcohol)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Fluorescence microscopyZeissZeiss Axio Imager A1
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MicrocentrifugesEppendorf5424R
IncubatorHeracell150
Large Orbital ShakerRatekOM7
MicrowaveLGMS3840SR /00
Lab pH MeterMeterLabPHM220
Liquid-repellent slide markerDaido SangyoMini
CoverslipThermo586
6 well plateCELLSTAR657160
12 well plateCELLSTAR665180
SlideMikro-GlassSF41296PLMK
0.45 µm filterMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustfree PaperKIMTECH34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Cell strainer 70 µm NylonFALCON352350
Petri dish 35 × 10 mm with camsSARSTED82.1135.500
Slide jarTRAJAN#23 319 00

Referências

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. . The epididymis. 3, (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D., Daniels, J. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. , 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , (2001).
  29. Elkjær, M. -. L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Biologia do desenvolvimentoedi o 138Dinaminaepid dimoepididymosomeexossomoimunofluoresc nciasecre o de prote nasespermamatura o do esperma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados