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  • 参考文献
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摘要

卵巢癌在腹腔内形成转移。在这里, 我们提出了一个协议, 以制作和使用叶酸受体靶向表面增强共振拉曼散射纳米探针, 揭示这些病变具有高度的特异性,通过比例成像。纳米探针在腹腔内对活着的小鼠进行处理, 所得图像与组织学有很好的相关性。

摘要

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤。大多数患者处于晚期 (FIO iii 或 IV 期), 当局部转移扩散已经发生。然而, 卵巢癌有一个独特的转移扩散模式, 因为肿瘤植入物最初包含在腹腔内。这一特点原则上可以使肿瘤植入物的完全切除具有治疗意图。这些转移性病变中的许多都是微观的, 很难识别和治疗。中和这种微转移被认为是消除肿瘤复发和实现长期生存的主要目标。具有表面增强共振的拉曼成像拉曼散射纳米探针由于其明亮和生物正交特征, 可用于高灵敏度的显微肿瘤的描述。在这里, 我们描述了这种纳米探针的两种 "味道" 的合成: 一种是针对叶酸受体的抗体功能化的合成--在许多卵巢癌中过度表达--另一种是非靶向对照纳米探针, 具有明显的光谱。纳米探针在腹腔内联合给转移性人卵巢腺癌的小鼠模型。所有动物研究都得到了纪念斯隆·凯特林癌症中心动物护理和使用委员会的批准。用拉曼显微光谱仪对动物的腹腔进行手术暴露、清洗和扫描。随后, 使用经典最小二乘拟合算法对这两个纳米探针的拉曼特征进行解耦, 并对它们各自的分数进行划分, 以提供叶酸比非目标探针更有针对性的比率信号。通过这种方式, 显微镜转移是可视化的高特异性。这种方法的主要优点是, 局部应用到腹腔-这可以在手术过程中方便地做-标签肿瘤, 而不会使患者受到系统的纳米颗粒暴露。通过采用比率法, 将具有不同拉曼特征的靶向和非靶向纳米探针作为混合物应用, 可以消除纳米探针与内脏表面的非特定结合所产生的假阳性信号。由于缺乏商业广域拉曼成像摄像系统, 这一程序目前仍然受到限制, 一旦可用, 就可以在手术室应用这一技术。

引言

具有 "表面增强拉曼散射" (sers) 纳米粒子的拉曼成像在描述各种环境中的病变以及许多不同类型的肿瘤 1、2、3、4方面显示出巨大的希望.SERS 纳米粒子的主要优点是它们的指纹样光谱特征, 使它们能够毫无疑问地检测到生物背景信号5。此外, 发射信号的强度进一步放大, 使用记者分子 (染料) 与激发激光器一致的吸收极大值, 产生 "表面增强共振拉曼散射" (serrs)具有更高灵敏度的纳米粒子6、7、8、9、10、11、12.

采用 se (r) rs 纳米颗粒13和许多其他纳米颗粒结构 14, 15 临床使用需要解决的一个障碍是它们的给药方式, 因为静脉注射导致系统性剂的暴露, 并需要广泛的测试, 以排除潜在的不利影响。在本文中, 我们提出了一个不同的范式, 基于在体内局部应用纳米粒子, 直接进入腹腔在手术过程中, 然后是一个洗涤步骤, 以消除任何未绑定的纳米粒子1。这种方法符合目前正在研究的新的治疗方法, 这些方法也利用局部注射剂进入腹腔, 称为高温腹腔内化疗 (HIPEC)。因此, 该原则本身应该相对容易融入临床工作流程。我们研究了腹腔内应用后纳米颗粒的生物分布, 但没有观察到任何可检测到的吸收到全身循环1。此外, 局部应用方法规避网状内皮系统对纳米颗粒的固存, 从而显著减少了所需的纳米颗粒的数量。然而, 当局部应用时, 抗体功能化纳米粒子倾向于粘附在内脏表面上, 即使在没有目标的情况下也是如此。为了最大限度地减少由于非特异性纳米粒子粘附而产生的假阳性信号, 我们采用了一种比率测量方法, 即分子靶向纳米探针提供特定信号, 以及具有不同拉曼光谱的非靶向对照纳米探针,帐户的非特定背景16,17。我们最近在弥漫性卵巢癌1的小鼠模型中展示了局部应用表面增强共振拉曼比率光谱法。

该方法的总体目标是开发两个 SERRS 纳米探针, 一个有针对性的, 一个是非特异的, 在小鼠模型中局部应用, 以便利用两个探针的比率测量来成像与癌症相关的生物标志物的显性过度表达通过拉曼成像。在这项工作中, 叶酸受体 (fr) 被选择为目标, 因为这是一个标记在许多卵巢癌18,19。拉曼微光成像与 sers 为基础的纳米粒子也被证明用于癌细胞的鉴定20。合成了拉曼纳米粒子的两种不同的 "味道", 每种化合物都是从不同的有机染料中提取指纹的。纳米粒子由一个星形金芯组成, 周围是一个硅壳, 并在大约710纳米处显示表面等离子体共振。拉曼机 (有机染料) 与硅壳的形成同时沉积。最后, 对于 frs 靶向纳米探针 (Α-Fr-nps), 二氧化硅壳与抗体结合, 而非靶向纳米探针 (nt-NPs) 则与聚乙二醇单层钝化。

该技术成功地用于绘制弥漫性转移性卵巢癌 (SKOV-3) 小鼠异种移植模型中的显微肿瘤图, 证明了其在体内使用的适用性。它还可以扩展用于切除组织, 肿瘤表型, 或脱粒后边缘的确定, 如同源研究21所示。

SERS 纳米探针为创建多个生物标志物的目标标签提供了一个强大的平台, 如图 1所示, 通过简单的化学反应合成。在这里, 我们提出了合成两种类型的 SERRS 纳米探针 (第1-3 节) 的协议, 开发一个合适的卵巢癌小鼠模型 (第4节), 纳米探针的管理和成像 (第5节), 最后的数据分析和可视化 (第6节)。

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研究方案

所有动物研究都得到了纪念斯隆·凯特林癌症中心 (#06-07-011) 机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 金纳米星芯合成

请注意:在本实验中, 金纳米星被用作两种类型的 SERS 纳米探针的核心。

  1. 在去离子水中制备 800 mM 抗坏血酸 (c6h8o6) 溶液, 在 di 水中制备 20 mm 四氯油酸 (hauccl4) 溶液 8 ml.冷却至4°C。
  2. 在4°C 下执行此反应步骤。将含有800毫升抗坏血酸溶液的锥形烧瓶放置在磁搅拌板上, 产生稳定的涡旋。快速加入8毫升的四氯己酸溶液到涡旋。几秒钟内, 纳米恒星就会形成, 溶液将呈深蓝色。如果颜色在任何时候变成粉红色或紫色, 表示纳米球的形成, 悬浮液应丢弃, 合成应重新尝试。
  3. 将纳米恒星悬浮液浸入50毫升锥形管中, 离心 20分钟 (4°c, 3, 220 x g)。吸气上清液在每个管中留下约200μl 的溶液。小心不要打扰管底部的纳米颗粒。
    请注意:由于剩余的悬浮纳米星, 上清液应该有蓝色的色彩。
  4. 使用微移液器, 搅拌溶液, 暂停和收集每个管的纳米颗粒。部分颗粒可在管底压实, 即使有有力的管道, 也不会重新悬浮, 丢弃这一部分。
  5. 将纳米颗粒悬浮液转移到透析盒式磁带 (MWCO 3.5 kDa) 和透析至少3天对2升 di 水, 每天改变水。在4°c 下进行透析, 最多一个月, 每3-4天就会有水分变化。
    请注意:如第2节所述, 纳米恒星应保持透析, 直到进行沉默反应所需。

2. 硅二酯壳的形成

请注意:合成了两种口味的拉曼纳米探针。两者的合成过程都是一样的, 唯一的区别是使用了拉曼记者分子 (染料)。在本实验中, 使用了高氯酸盐和 IR140。反应应始终在塑料容器中进行。合成具有很高的可扩展性, 可根据所需的注射量进行调整。在这里, 描述了一种中等批次合成, 它可以根据需要线性地缩放到较低或更高的体积, 具有相同的浓度和反应时间。两种 SERRS 纳米探针类型的反应可以并行进行。注意避免交叉污染。在洗涤步骤离心后或纳米颗粒储存时间超过一小时后, 应进行超声操作, 以使纳米颗粒重新分散。应进行超声操作, 直到纳米颗粒明显悬浮到溶液中, 通常为1秒。

  1. 在管 A (50 毫升锥形管) 中, 混合10毫升异丙醇、500Μl Teos、200ΜL di 水和60μl 染料 (IR780 高氯酸盐或 IR140, DMF (二甲基甲酰))。
  2. 在管 B (15 毫升锥形管) 中, 混合3毫升乙醇和200μl 氢氧化铵。将步骤1.4 中的纳米星共用, 以分散溶液中的任何星团, 并在管中添加 1.2 mL 的纳米星。
    注:氢氧化铵溶液具有很高的挥发性和难以准确的移液器。将其存放在 4°c, 直到需要, 以方便移液。
  3. 将管 A 放置在涡旋混合器上, 并产生稳定的涡旋。快速将 b 管的含量加入涡流中, 并持续混合约 5秒, 立即转移到振动台, 在室温下, 在 3 0 0 转的情况下晃动, 反应15分钟。
  4. 15分钟孵育后, 加入乙醇填充50毫升管, 淬火反应。在 3, 220 x g和4°C 下离心20分钟。
  5. 吸起上清液, 留下约0.5 毫升的溶液, 注意不要打扰颗粒。加入1毫升乙醇, 用移液器搅拌, 重新悬浮纳米颗粒。通过 11, 000 x g 离心, 将上清液吸气, 并通过超声波重新悬浮颗粒约 1秒, 将其转移到 1.5 ml 离心管中, 用乙醇清洗4次。
    请注意:在此阶段, 如第3节所述, 可以对硅化纳米颗粒进行功能化, 也可以在 DI 水中重新悬浮, 并有额外的洗涤步骤, 以便在4°c 下储存长达一周。

3. 表面功能化

请注意:IR780 SERRS 纳米探针将通过 PEG 交联剂与叶酸受体靶向抗体结合, 形成Α-Fr-nps;IR140 SERRS 控制纳米探针将与钝化的 PEG 单层共轭, 用于 nt-NPs。这两种口味都是通过硫醇-马来酰亚胺反应在单独但平行的反应中形成的。

  1. 用 11, 000 x g离心 4分钟, 吸吸上清液, 并通过超声波将颗粒重新悬浮在1毫升乙醇中, 将纳米颗粒洗两次。再次重复洗涤步骤, 但在85% 乙醇的1毫升、10% 的 3-MPTMS (3-硫代丙基三甲氧基硅烷) 和5% 的 di 水中重新分散。在室温下培养 1-2小时, 在颗粒表面引入硫醇。
  2. 用 11, 000 x g离心 4分钟, 吸气并通过超声波重新悬浮颗粒, 两次在乙醇中清洗, 两次在 di 中清洗, 最后在 hepes 中清洗 (4-(2-羟乙基)-1-甲拉嗪-乙酰磺酸) 缓冲液 (10 mM, pH 值 7.1), 并放在一边。
    请注意:应使用 MES (2-(n-吗啡) 乙酸) 缓冲液或 hepes。盐度较高的缓冲剂, 如 PBS (磷酸盐缓冲盐水), 可能会引起纳米颗粒聚集。
  3. 对于抗体功能化的α-Fr-nps, 反应200μg 抗体 (抗叶酸结合蛋白抗体克隆 [LK26]) 与倍摩尔过剩的 peg 交联剂 (聚乙二醇 (乙二醇) (n-羟基琥珀酰亚非甲基) 乙醚 N '-(3-马来酰丙基) 氨基乙烷 (CAS:851040-94-3), 在甲基亚硫氧化物 (DMSO) 中的 500μl mes 缓冲液 (10 mM, pH 7.1) 中, 为30分钟。
  4. 通过在离心过滤器 (MWCO 100 kDa) 中离心抗体-peg 溶液, 去除多余的交联剂和浓缩抗体。对于本研究中使用的离心过滤器, 在 14, 000 x克和23°c 下进行10分钟离心。通过倒置过滤器和离心器, 以 1, 000 x克的速度进行2分钟的离心, 在新鲜的管中回收共轭抗体。
  5. 移液器 IR780 纳米颗粒从步骤3.2 进入管与抗体和搅拌与移液器混合。在室温下将混合物生生至少 30分钟, 或者在4°c 过夜时, 形成Α-Fr-nps。
  6. 要形成 nt-NPs, 请添加 1% w/v 甲氧基终止 (m)PEG5000-马来酰亚胺 (CAS: 99126-64-4) 从步骤3.2 中溶解在 DMSO 中, 到 ir140 SERS 纳米颗粒中, 让在 500Μl MES 缓冲液 (10 mM, pH 7.1) 中反应至少 30分钟, 在室温下, 或者在4°c 下一 夜 之间。
  7. 为给小鼠服用 (第5节), 将两种纳米探针香精在 11, 000 x 克的高度旋转 4分钟, 用游离未反应的抗体/peg 吸入上清液, 并在 em 缓冲液 (10mm, ph 7.1) 中重新分散每种香料, 浓度为 600 mm.当重新悬浮纳米颗粒时, 尽量减少不必要的暴露于超声波, 以防止抗体变性。

4. 鼠标模型开发

  1. 建立稳定的人卵巢腺癌 (SKOV-3) 细胞系培养。(可选) 为了通过生物发光荧光/进行监测, 请使用转染的 SKOV-3 luc+/transfected+细胞。RPMI (罗斯威尔公园纪念研究所) 培养基中培养细胞, 有10% 的胎儿小牛血清, 每周两次通过。对于注射, 用0.25% 的胰蛋白酶/0.05% EDTA 孵育 3分钟, 然后在 PBS 中清洗并重新悬浮在 2 x10 6 细胞100μl。
  2. 建立卵巢微转移模型, 将200μl 悬浮 SKV2-3 细胞腹腔注射到百周大鼠的胸腺雌性小鼠体内 (Foxnnn\ foxn1nu 小鼠)。传播的腹膜传播将在大约4周内发生。如果使用 SKOV-3luc +细胞, 可以通过在 50Μl pbs 中通过后眼眶注射在 50ΜL pbs 中给予2毫克的单皮虫 hbs 来监测肿瘤的生长。

5. 纳米探针注入和成像

  1. 按照第1-3 节所述, 制备纳米探针 (αFR-NPs 和 nt-NPs), 并以1:1 的比例混合, 以便在 MES 缓冲液中最终每种类型的 300 pM (10 mM, pH 7.1)。(可选) 在小型 (100μl) 锥形管中, 为每个纳米探针香精准备 30 pM 的参考标准。
  2. 在每只小鼠体内注入纳米颗粒悬浮液的1毫升腹腔, 轻轻按摩腹部, 将纳米颗粒分布在腹腔内。将鼠标返回到其外壳。25分钟或以上后, 通过 CO2 窒息对小鼠进行安乐死。
  3. 将鼠标固定在手术平台上, 在仰角位置 (对于整个腹部成像, 平台需要安装在直立显微镜舞台上)。
    1. 使用锯齿钳和解剖剪刀, 取出皮肤, 露出腹膜, 并执行一个大的矢状切口 (2 至3厘米长), 以暴露整个腹部。将腹膜皮瓣连接到平台上。用塑料喷瓶用至少60毫升的 PBS 清洗腹腔内。
      请注意:为了使整个腹部的成像不受阻碍, 需要动员或切除肠道。切除时, 用肠系膜血管结扎切除, 以减少腹腔出血。
    2. 或者, 对特定器官进行成像, 在 PBS 清洗后对其进行切除, 并将其放置在显微镜幻灯片上。
  4. 将平台或滑块转移到拉曼微分光光度计, 具有垂直的光学配置和机动成像阶段;使用具有 300 mW 785 nm 二极管激光器的商用系统, 光栅为每毫米 1, 200 凹槽, 中心为 1, 115 厘米-1英寸。
    1. 专注于感兴趣的领域使用白光光学, 参数与拉曼激光。选择要成像的区域和所需的分辨率;在本报告中使用了高速采集模式 (在连续激光照射下获得的光谱, 显微镜阶段不断移动, 有效空间分辨率14.2μm 乘 200μm; 在5倍放大倍率下, 在目标时为 100 mW 功率, 并 <每点曝光100毫秒)。
      请注意:如果需要, 可以将带有步骤5.1 中参考纳米探针的管放置在成像区域内, 以便为后续分析提供内部参考标准。确保除激光外, 没有多余的光源达到目标。
  5. (可选) 在4°c 的 PBS 中隔夜固定4% 的聚甲醛, 以进行组织学处理和验证。在4°c 下用 PBS 冲洗 15分钟, 至少两次。将样品保存在70% 的乙醇中, 直到标准的组织学处理和石蜡嵌入。对于肿瘤的组织学验证, 不同深度石蜡块的切片 (5 微米厚) 可用血红素和 eosin 染色 (H & E)。

6. 数据处理和可视化

请注意:所有数据处理都是利用内部开发的图形用户界面, 使用商业软件进行的。使用的所有函数都具有其他计算环境中可用的泛型等价物。

  1. 通过询问每种口味的纯悬浮液, 获得这两种口味的参考光谱。参考光谱可以从纳米探针的点扫描、在井板中对纳米探针进行成像, 或者通过在参考管的实验扫描中加入内部参考 (见步骤 5.1) 来获得参考光谱。
  2. 预处理参考光谱, 通过使用基线减法 (惠特克滤波器, = 200), 归一归由曲线下的面积, 和 Savitzky-Golay 导数滤波器 (二度多项式拟合, 一阶导数, 宽度 = 15 步)。这些预处理的光谱将为经典最小二乘法 (CLS) 模型提供参考。
  3. 以与参考光谱相同的方式预处理图像中的样品数据。使用可用的 CLS 算法获取每个采样点的 CLS 分数。直接 CLS (DCLS) 分数只是样本谱投影到参考谱的广义逆矩阵 (Moore-Penrose 逆) 所定义的线性空间上的坐标。可以使用其他拟合算法 (非负最小二乘法、偏最小二乘或其他算法)。
    请注意:一些合适的算法会产生负分数, 在这种情况下, 负分数不是物理的。如果是这种情况, 可以设置一个阈值来排除负分数, 或者使用约束的非负最小二乘法。
  4. 计算目标纳米粒子 (分数αfr) 参考上分数与非目标纳米粒子 (分数 nt) 参考上的分数的点比.如果分数为非负数, 则可以用对数方式表示比率:
    R = 日志10(分数αfr/分数nt)。
    R 比最好以零为中心的分色尺度显示, 以数量级表示探头的相对丰度。由此产生的图像可以覆盖到样品的白光图像上, 以揭示叶酸受体过度表达的区域。

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结果

为了质量控制的目的, 纳米粒子可以在合成过程中使用各种方法进行表征, 包括 TEM、DLS、纳米粒子跟踪分析和 UV/Vis 吸收光谱, 如图 2所示。

通过这种方式, 可以验证金纳米岩核的大小 (第1节所述)、硅壳的形成 (第2节) 和随后的表面功能化 (第3节) (图 2)。通常情况下, 金纳米核的大小 (...

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讨论

本文所述的协议为 SERRS 纳米探针两种 "味道" 的合成及其在小鼠体内的应用提供了指导, 用于应用于卵巢肿瘤过度表达叶酸受体的拉曼成像, 并采用了比率法。与其他光学成像技术 (如荧光) 相比, 拉曼成像的主要优势在于纳米探针信号的高特异性, 而纳米探针信号不能与任何生物来源的信号混淆。在拉曼成像的这一实施例中, 纳米颗粒不是静脉注射的, 而是局部的, 通过腹腔内注射, 然后是一个单一的...

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披露声明

·m. f. k. 在与这项工作有关的若干已签发或正在申请的专利申请中被列为发明人。m. f. k. 是 RIO 成像公司的联合创始人, 该公司的目标是将 SERRS 纳米粒子翻译成诊所。

··提交人声明, 他们没有其他相互竞争的经济利益。

致谢

确认了以下资金来源 (对 m. f. k.): NIH R01 EB017748、R01 CA222836 和 K08 CA16396;达蒙 Runyon-Rachleff 创新奖 DRR-29-14, 潘兴广场索恩奖, 由潘兴广场索恩癌症研究联盟, MSCCC 分子成像 & 纳米技术中心 (CMINT) 和技术开发赠款。还向 MSCC NIH 核心赠款 (P30-ca008748) 提供的赠款资助支助提供了确认服务。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
3-MPTMSSigma-Aldrich175617
Ammonium hydroxide (28%)Sigma-Aldrich338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26] AbCamab3361
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous)Sigma-Aldrich276855
EthanolSigma-Aldrich792780
IR140Sigma-Aldrich260932
IR780 perchlorate*Sigma-Aldrich576409Discontinued*
IsopropanolSigma-Aldrich650447
N.N.DimethylformamideSigma-Aldrich227056
PEG crosslinkerSigma-Aldrich757853
PEG-maleimideSigma-Aldrich900339
Tetrachloroauric AcidSigma-Aldrich244597
Tetraethyl OrthosilicateSigma-Aldrich86578
*IR792Sigma-Aldrich425982*Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO)ThermoFIsher87724
Centrifugal filtersMilliporeUFC510096
inVia confocal Raman microscopeRenishaw
MATLAB (v2014b)Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)Eigenvector research

参考文献

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