小鼠肾上腺的分离、固定和免疫荧光成像

摘要

本文提出了一种从小鼠中分离肾上腺的方法, 修复组织, 切片, 并进行免疫荧光染色。

摘要

免疫荧光是一种公认的检测组织中抗原的技术, 使用 fluorochrome 共轭抗体, 具有广泛的应用范围。抗原的检测允许对多种细胞类型进行鉴定和鉴定。肾上腺位于肾脏上方, 由一层间充质细胞包裹, 是由两个不同组织组成的内分泌器官, 不同的胚胎起源, 肾中间胚层衍生的外皮质和神经冠的内部髓质。肾上腺皮质分泌类固醇 (即mineralocorticoids、糖皮质激素、性激素), 而肾上腺髓质则产生儿茶酚胺 (即肾上腺素、去甲肾上腺素)。在进行肾上腺研究时, 重要的是要能够区分独特的细胞与不同的功能。在这里, 我们提供了一个在我们的实验室开发的协议, 描述了一系列的顺序步骤, 以获得免疫荧光染色特征的细胞类型的肾上腺。我们首先关注的是小鼠肾上腺的解剖, periadrenal 脂肪的显微切除, 其次是组织的固定、处理和石蜡嵌入。然后我们用旋转切片描述组织块的切片。最后, 我们详细介绍了肾上腺免疫荧光染色的一个协议, 我们已经开发, 以尽量减少非特异性抗体结合和自发荧光, 以达到最佳的信号。

引言

免疫组化是一种检测组织成分的技术, 使用特定细胞分子的抗体和随后的染色技术检测共轭抗体¹。这种免疫组化程序需要特定的固定和处理的组织, 通常是经验主义地确定的特定抗原, 组织和抗体使用²。固定是保持组织的 "原始" 状态的关键, 从而保持完整的细胞和亚胞结构和表达模式。需要进一步的处理和嵌入程序, 以准备组织切片成薄片, 用于组织学研究涉及免疫组化。

染色可以进行显色或荧光检测。显色检测要求利用酶将可溶性基质转化为不溶性的有色产品。虽然这种酶可以与识别抗原的抗体 (主要抗体) 结合, 但它更经常被共轭到识别主要抗体的抗体 (即二级抗体)。这种技术是高度敏感的;由酶反应产生的有色产物是 photostable 的, 只需要 brightfield 显微镜进行成像。然而, 显色染色可能不适合时, 试图想象两个共同本地化的蛋白质, 因为一个颜色的沉积可以掩盖另一个的沉积。在共同染色的情况下, 免疫荧光被证明是更有利的。免疫荧光的出现归因于阿尔伯特库恩斯和同事, 他们开发了一个系统来识别组织抗原与荧光素标记的抗体和可视化他们在切片组织紫外线光³。荧光检测是基于与荧光的抗体共轭的, 在激发后发出光。由于有几个显影在不同波长 (没有或小重叠) 排放, 这种检测方法是研究多种蛋白质的理想选择。

肾上腺是位于肾脏上方的一对配对器官, 其特点是两个 embryologically 不同的成分, 周围有一个间充质胶囊。外肾上腺皮质, 从肾中间胚层, 分泌类固醇激素, 而内部髓质, 来源于神经嵴, 产生儿茶酚胺, 包括肾上腺素, 去甲肾上腺素和多巴酚。肾上腺皮质组织学上和功能上划分三个同心区, 每个区域分泌不同类别的类固醇激素: 外透明球状 (zG) 产生 mineralocorticoids, 调节电解质稳态和血管内容积;中间透明束状带 (zF), 直接在 zG 下方, 分泌糖皮质激素, 通过动员能量储存来调节压力反应, 以增加血糖;和内透明网状 (锆), 合成性类固醇前体 (即,脱氢表雄酮 (DHEAS))⁴。

在不同种类之间存在肾上腺皮质分带的变化: 例如,毛里求斯缺乏锆。耐热细胞质⁵, 其独特的产后 X 区为小脂质较差细胞的胎儿皮层残余。X 区在雄性小鼠青春期消失, 在雌性小鼠第一次怀孕后, 或在未繁殖的雌性中逐渐退化^6,7。此外, zG 的扭曲和厚度与 zG 附近的外周茎和祖细胞的组织有显著的差异。与其他啮齿动物不同的是, 这只老鼠在 zG 和 zF 之间有一个可见的未分化区 (祖), 它的作用是干细胞区和/或瞬变放大祖细胞区。无论是对大鼠, 还是仅仅是一个更突出的组织细胞群是未知的^8,9。

肾上腺皮质的细胞含有脂质滴, 储存胆固醇酯, 作为所有类固醇激素^10,11的前兆。 "类固醇激素分泌" 一词定义了从胆固醇生产类固醇激素的过程,通过一系列的酶反应, 涉及类固醇合成因子 1 (SF1) 的活动, 其表达是类固醇合成潜力的标志。在肾上腺, Sf1 表达仅存在于皮质细胞¹²。一项有趣的研究发现, 类固醇合成电位¹³的肾上腺皮质细胞内源生物素的表达。虽然这可能是基于生物素/链亲和素染色方法较高背景的原因, 由于检测到内源生物素的抗体共轭与链亲和素, 这一特点也可以用来区分类固醇合成肾上腺内其他人群的细胞,即内皮、囊膜和髓质细胞。

支配由交感神经节前神经元, 肾上腺髓质的特点是嗜碱性颗粒细胞与颗粒细胞质含有肾上腺素和去甲肾上腺素。髓质细胞被命名为 "嗜", 是因为在氧化¹⁴后形成褐色色素的儿茶酚胺含量高。酪氨酸羟化酶 (TH) 是催化合成儿茶酚胺的速率限制步骤的酵素, 在肾上腺, 仅表达在髓质¹⁵。

在这里, 我们提出了一个小鼠肾上腺的隔离协议, 他们的植入石蜡切片和切片的处理, 并在肾上腺切片上进行免疫荧光染色的方法, 以确定构成的细胞类型肾上腺皮质和髓质。本协议是实验室中用于染色的标准, 用于我们的研究中经常使用的多种抗体。

研究方案

所有方法都是按照在密歇根大学动物使用和护理委员会辖下的体制上批准的议定书进行的。

1. 手术准备

1. 在手术前的前一天, 准备4% 多聚甲醛 (粉煤灰)/磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在冷冻整除数的情况下, 进行解冻, 并贮存在4摄氏度。
   注: 4% 粉煤灰不稳定超过48小时。
   注意: 粉煤灰是有毒的, 避免接触皮肤和眼睛, 并处理适当的容器。
2. 手术当天, 用70% 乙醇 (乙醇) 消毒剪刀和镊子, 让他们在纸巾上晾干, 准备手术器械。
3. 放置一个24井板填充 1x PBS (1 毫升/井是足够的) 在一个冰桶。
   注: 手术后肾上腺将保存在这种多井培养皿中。

2. 肾上腺解剖

1. 弄死动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的标准协议后, 鼠标。二次安乐死的方法, 以确保死亡 (例如斩首) 是必需的。
   1. 对于异氟醚过量的安乐死, 将鼠标放置在充满异氟醚蒸气的腔内, 直到呼吸停止, 然后从腔室中取出鼠标, 放置在表面上, 并进行颈椎脱位。
      注: 大多数安乐死方法对动物造成痛苦, 不适用于压力研究, 因为它们可能增加垂体-肾上腺轴和髓内儿茶酚胺释放的混杂变量。在这种情况下, 斩首是建议采用的技术。
2. 放置鼠标仰卧, 用70% 乙醇消毒腹部和侧面的切口区域。
   注意: 剃须毛会增加不孕, 对于这个特殊的应用来说是没有必要的。
3. 用剪刀切开腹部中部的皮肤, 将皮肤与腹膜分开, 通过捏紧伤口周围的皮肤并将其拉到两个相反的方向 (尾鳍和延髓), deskin 老鼠。然后切开腹膜直到到达左后方和右侧面。
4. 去除周围脂肪组织附近的小鼠肾上腺, 把它放在24多井的平板上, 装满 1x PBS, 放在冰上。

3. 围肾上腺脂肪摘除术

1. 在解剖显微镜下, 将肾上腺放在玻璃底座上或在舞台板上的培养皿上, 定位光源, 选择放大倍数, 调整焦点以获得整个肾上腺的清晰视野。
   注: 使用的放大倍数根据个人喜好而定。总放大倍数为30X 与计划透镜 1X, 变焦3X 和目镜10X 允许视觉化整个腺体以一个好视野。
2. 用两个25克针快速去除相邻的脂肪组织, 避免肾上腺脱水。如果这种情况发生之前, 所有的脂肪被移除, 移动肾上腺回到含有 1x PBS 的良好, 然后继续脂肪去除过程。
3. 每 1x PBS 清洗 2x 2 分钟。

4. 组织加工和嵌入

1. 固定在4% 粉煤灰/PBS 的组织在4°c 在一个摇摆平台2小时。
2. 取出4% 的粉煤灰, 用 1x PBS 清洗组织, 3x 15 分钟, 每4摄氏度。
   注意: 粉煤灰是有毒的, 是危险废物;在化学罩下应小心处理, 并将其置于危险废物容器中。
3. 在4°c 在一个摇摆的平台上孵化肾上腺50% 乙醇2小时。
4. 在一个摇摆平台上孵化70% 乙醇的肾上腺, 最低为2小时。
   注: 如果不进行组织处理嵌入, 肾上腺可以存储在70% 乙醇在4摄氏度。避免长期贮存在70% 乙醇, 并进行组织处理, 尽快得到更好的质量样品。
5. 通过将肾上腺包裹在纱布中, 将其装入组织嵌入盒中, 准备进行组织处理。把卡带放在装满70% 乙醇的罐子里, 储存在4摄氏度, 直到准备移动到组织处理器。将卡带插入按表 1所报告的组织处理器, 并运行该程序。
6. 将卡带转移到一个嵌入站, 用熔融石蜡填充65摄氏度。如果没有冷却站, 请在旁边放置一个冷冷却托盘。
7. 标签嵌入模具, 打开组织嵌入盒。使用一对钳, 打开纱布, 并将肾上腺轻轻地放在所需的位置, 在基地的中心在嵌入模具。将融化的石蜡倒入肾上腺。如有必要, 用镊子将肾上腺固定在模具中, 否则它可能在模具内移动。
8. 将嵌入模具轻轻移动到冷却盘中, 等到石蜡硬化。之后, 为了便于切片, 将嵌入模具存放在阴凉处。

5. 用旋转切片切片

1. 在开始前检查切片是否干净, 刷掉所有丢弃的石蜡残留物, 确保刀 (或刀片) 削尖, 油的内部机制, 并完全收回块持有人, 如果必要的话。
2. 贴上一系列的显微镜幻灯片 (正面充电或涂敷以防止组织损耗 (见材料表)), 将其放置在37摄氏度的滑动暖片上, 并在每张幻灯片的顶端放上一些蒸压型1超纯水。
3. 设置剖面厚度为5µm。
4. 将切片刀片插入刀片式服务器, 控制刀片的角度, 确保刀片牢固地固定在支架上, 并检查石蜡块和块座的间隙。
5. 将挡持器置于其最高位置, 如有可能, 锁定操作手柄, 从模具中取出石蜡块, 并将其放到固定夹紧固的块夹中。刀片的中心线的角度与块面的表面应该是有关的。如有必要, 重新调整石蜡块。
   注意: 刀片是锋利的。
6. 如果以前锁定, 松开手轮, 并降低石蜡块, 直到其表面与切片刀片的边缘水平。用稳定的节奏旋转手轮。执行初始修剪, 去除石蜡和暴露肾上腺。
7. 继续转动手轮, 直到肾上腺的末端。使用 brightfield 或解剖显微镜检查切片中是否存在组织。将丝带从刀片中分离出来, 并借助另一对镊子把它放在玻璃滑梯上的水上。将功能区放置在曲面上可能很有用, 请仔细地拉伸它, 然后将其装入幻灯片。
8. 让滑梯在热盘子上晾干。然后将它们平放在一个托盘上, 如果水仍然存在, 可以在一夜之间或更长时间内烘烤37摄氏度。干燥后, 在室温下将幻灯片存储在幻灯片框中。
9. 把所有使用过的设备都扔掉, 清洁切片。

6. 免疫荧光

1. 选择染色的幻灯片并将它们放在幻灯片持有者中。
2. 在热板上, 在 pH 值为2.0 时带一个装有0.01M 柠檬酸盐的烧杯煮沸。缓冲区的体积取决于烧杯的大小, 必须足够的覆盖在沸腾的幻灯片部分 (一些蒸发需要考虑)。用铝箔盖住烧杯。
   注: 其他抗原检索方法可供选择 (见讨论)。
3. Deparaffinize 100% 二甲苯2x 的幻灯片, 每5分钟。水化幻灯片使用以下系列: 100% 乙醇2x 为5分钟, 70% 乙醇 2x 5 分钟, 类型1超纯水为5分钟。
   注: deparaffinization 后, 重要的是不要让切片干燥: 组织切片必须始终覆盖缓冲区或解决方案, 直到程序的结束或组织结构可能被破坏。
4. 对于抗原检索, 将幻灯片放在金属滑动架上, 并将其插入烧杯中, 无需铝箔即可煮沸柠檬酸盐。让它煮沸10分钟。
5. 把烧杯从热板上取下, 让它冷却20分钟. 确保肾上腺部分仍然被缓冲覆盖。
6. 准备阻塞解决方案。如果使用用于代表结果的商用染色试剂盒 (见材料表), 在一管中添加1.25 毫升 1x PBS, 1 滴 (等于约45µL) 的小鼠阻断试剂, 5% 正常山羊血清。在工作时, 将阻塞溶液存放在4摄氏度或冰上。
   注: 使用的血清依赖于二次抗体的寄主物种。这里用山羊饲养的次生抗体。对于其他抗体, 可能需要不同的血清浓度。通过对几种浓度的测试, 通过实验确定正确的血清浓度。
7. 将幻灯片转移到包含 1x PBS 的 Coplin 罐子中, 并在摇臂上每10分钟洗一次。
8. 为染色准备一个加湿室。
9. 轻轻地, 从一张幻灯片上摇下 PBS;用无起毛的擦拭擦拭滑底, 去除多余的 PBS。
10. 使用特殊的标志, 为具有疏水性的幻灯片, 绘制一个围绕每个肾上腺部分, 确保玻璃表面干燥, 以避免传播的墨水溶液的部分。如有必要, 小心擦拭表面干燥。把滑梯放在湿室里。
11. 快速, 吸管50µL (或足够覆盖部分) 的阻塞解决方案的每一个部分。室温下孵育1小时。
    注意: 所需的阻塞解决方案卷可能会有所不同;很重要的是, 各部分都有充分的解决方案。
12. 用7.5 毫升 1x PBS、600µL 蛋白质浓缩液和5% 正常山羊血清 (或在阻断溶液中使用的任何其他血清和浓度), 从商用试剂盒中制备稀释液。在工作时, 将稀释剂溶液存放在4摄氏度或冰上。
13. 准备主要抗体溶液稀释的主要抗体在适当的浓度稀释剂溶液。为共同染色, 添加一个整除的每一个抗体在新的管, 并轻轻混合。在冰上放置抗体和抗体溶液, 直到准备使用。
    注: 在这里, 我们使用了兔 anti-SF1 抗体, 并在小鼠中提出了抗 TH 抗体。准备抗体工作解决方案按照指示进行。
    1. 对于 SF1 工作溶液, 在一管中, 添加1µL 的 anti-SF1 抗体999µL 稀释剂溶液 (最终浓度1.5 µg/毫升)。对于工作溶液, 在管中, 添加1µL 抗 TH 抗体499µL 稀释液 (估计最终浓度为 2-6 µg/毫升)。
    2. 对于 SF1 抗体工作组合, 在一个新鲜的管, 吸管250µL 的 SF1 工作溶液和250µL 的工作解决方案。轻轻地混合吹打。储存在冰上。
14. 在装有 1x PBS 的 Coplin 罐子中传输幻灯片, 并在摇臂上每5分钟清洗3x。
15. 将幻灯片放回加湿室后, 清除过量的 PBS, 吸管的 SF1 + TH 抗体工作组合 (或其他主要抗体解决方案) 在每个部分, 关闭湿润室, 并留在4摄氏度过夜。
16. 第二天, 将幻灯片移动到包含 1x PBS 的 Coplin 罐子中, 并在摇臂上以15分钟的时间清洗3x。
17. 在清洗幻灯片时, 用适当的浓度在稀释剂溶液中准备二次抗体溶液。如果执行共同染色, 增加相同数量的每一次抗体溶液在一个新的管。轻轻地混合吹打。储存在冰上。保护管子不受光, 储存在冰上, 直到准备使用。
    注: 在这里, 二次抗体使用的是 488 nm 荧光染料标记抗小鼠在山羊和549荧光染料标记的抗兔饲养山羊。在799µL 稀释剂溶液中添加0.5 µL 的二次抗体, 通过增加二次抗体溶液 (最终浓度为1.2 µg/毫升) 制备。
18. 将幻灯片放回加湿室中, 去除过量的 PBS 后, 在肾上腺切片上快速吸除二次抗体溶液, 关闭湿润室并保护光线。室温下孵育1小时。
19. 用 1x PBS 清洗 Coplin 罐子里的幻灯片, 在摇杆上洗 3x 15 分钟, 然后用柔和的摇摆, 确保它们不被光线所保护。
20. 准备 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 的核染色溶液: 1 µL DAPI (20 毫克/毫升) 在1毫升 1x PBS。
    注: 蓝荧光核 counterstain 也可以通过赫斯特染料实现。
21. 将 DAPI 溶液放到肾上腺上, 从光中遮盖, 室温孵育7分钟。
22. 用 1x PBS 清洗 Coplin 罐子中的幻灯片, 在摇臂上用柔和的摇摆来清洗 3x 5 分钟, 同时保护幻灯片不受光线的影响。
23. 在屏蔽了直接光的区域, 放置一个盖玻璃, 吸管60µL 或约3滴的安装剂, 适合免疫荧光沿盖玻璃表面。
24. 用无起毛的擦拭轻轻擦拭幻灯片的背面, 将滑动面朝下盖玻璃并与之平行, 使组织部分面对盖玻璃与安装剂在它。轻轻按下盖子玻璃上的幻灯片, 确保没有气泡被困在幻灯片和盖玻璃之间。
    1. 如有必要, 应进一步施加压力, 以消除气泡和过剩的安装剂。
25. 将幻灯片放置在深色容器中, 并在室温下固化至少24小时 (或所用安装代理的信息页中注明的时间), 然后进行成像。

7. 成像

注: 与照相机连接的荧光显微镜是检测和捕捉在确定波长激发后组织发出的荧光所必需的。虽然显而易见, 但重要的是要记住选择与荧光共轭的二级抗体, 其激发和发射谱与可用的设备兼容。成像设置根据显微镜和用于捕获图像的软件而有所不同。有一些基本的规则, 适用于成像肾上腺切片, 如确保曝光时间, 相机增益设置, 和光源强度保持恒定。

1. 打开光源和摄像头, 按照制造商的指示启动成像软件。
   注意: 这些操作的顺序可能会因所使用的设备而异。
2. 确保在舞台上的幻灯片, 打开快门, 并看着显微镜目镜使用核染色 (DAPI) 通道和低放大率 (4X) 识别幻灯片上的组织: 肾上腺切片是小的, 他们的可视化可能需要一段时间。
3. 更改为更高的放大倍数 (10X), 聚焦, 并关闭快门。
   注意: 在光线下避免不必要的长时间的漂白是很重要的, 这会导致信号丢失。
4. 使用软件命令, 选择目标 (10X) 和使用的通道 (DAPI), 调整曝光时间 (1 秒, 如果信号太强或太弱, 可以调整)。如果可用, 设置 binning 为实时成像 (不采集) 到 ' 2 X 2 ', 转换增益为 ' 中 ', 读出速度为 ' 20 兆赫 '。如果使用的软件在图像结束时未显示缩放条, 请从菜单中选择缩放栏选项, 并在需要的位置放置条形图。
5. 打开快门, 必要时重新调整焦点, 切换通道 (FITC、TRITC、DAPI)。如果显微镜不是自动的, 在每个通道中拍一张肾上腺的图片, 而不移动舞台, 并确保调整所使用通道的选择。关闭快门一次完成。
   注: 记下使用的设置, 以防软件自动保存。
6. 保存图片。
   注意: 合并图片可以经常使用显微镜的软件或其他图形编辑器软件包创建。
7. 对剖面的其他区域和/或更高的放大倍数重复成像。
   注: 20X 放大倍数通常需要较短的曝光时间 (即800 毫秒)。
8. 在成像结束时, 按正确的顺序关闭所有设备。

结果

图 1代表了上面描述的整个协议的示意图。肾上腺是从小鼠身上提取的, 在解剖显微镜下切除相邻的脂肪组织, 然后将肾上腺固定在4% 的粉煤灰中。经过这一步, 肾上腺被加工和嵌入石蜡, 并切片与切片, 以削减器官成薄片, 沉积在显微镜幻灯片。切片干燥后, 进行免疫荧光检查, 切片在显微镜下进行成像。

?...

讨论

本协议描述了一种分离小鼠肾上腺的方法以及切片石蜡嵌入小鼠肾上腺的制备和染色。

与我们测试的其他协议相比, 这种免疫荧光协议已被证明适合于我们实验室使用的大多数抗体。然而, 在某些情况下, 它可能需要一些调整, 以改善染色效果。一个可以很容易修改和测试的变量是固定长度。在我们的实验室中, 4% 只粉煤灰的孵化可以从1小时到4小时不等, 而在其他实验室中, 固?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	Nest Biotechnology Co.	0412B
Disposable needles 25 G x 5/8"	Exel International	26403
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Paraplast plus	McCormik scientific	39502004	Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid	Thermo scientific	1001097	Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades	Accu-Edge	4685	Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds	Polysciences Inc.	18986	Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15	75 mm x 25 mm x 1 mm
Xylene	Fisher Chemical	X5P1GAL
200 Proof Ethanol	Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads	Certified Safety Mfg, Inc	231-210	3" x 3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit	Vector laboratories	BMK-2202	For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes	Kimtech	34155	Wipes 4.4 inch x 8.4 inch
Super PAP PEN	Invitrogen	00-8899	Pen to draw on slides
Microscope cover glass	Fisherbrand	12-544-D	Size: 22 x 50 x 1.5
DAPI	Sigma	D9542	(Prepared in 20 mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent	Molecular Probes	P36930	Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q	Lumen Dynamics		Light source
Coolsnap Myo	Photometrics		Camera
Optiphot-2	Nikon		Microscope
microtome	American Optical
Tissue embedder	Leica	EG1150 H
Tissue processor	Leica	ASP300S
Normal goat serum	Sigma	G9023
Mouse anti-TH	Millipore	MAB318	Primary antibody
Rabbit anti-SF1	Ab proteintech group (PTGlabs)	custom made	Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat	Jackson ImmunoResearch	111-505-003	Secondary antibody
Citrate acid anhydrous	Fisher Chemical	A940-500
NIS-Elements Basic Research	Nikon		Software for imaging