由小圆形 DNA 分子构建的稳定 DNA 分子、一维和二维纳米结构

摘要

本文详细介绍了小圆形 DNA 分子 T4 结扎和变性 PAGE 纯化、圆形瓷砖退火和原生 page 分析、一维和二维 DNA 纳米结构的组装和 AFM 成像以及琼脂糖凝胶的研究。有限 DNA 纳米结构的电泳和离心纯化。

摘要

本文详细介绍了小圆形 DNA 分子的合成、圆形 DNA 图案的退火以及一维和二维 DNA 纳米结构的构建。几十年来, DNA 纳米技术的快速发展归功于线性 Dna 的使用作为源材料。例如, DAO (双交叉、反平行、奇数半转) 磁贴作为构建 2D DNA 格子的构建块而闻名;DAO 的核心结构是由两个线性单链 (ss) 寡核苷酸组成的, 就像两条绳子做右手老奶奶结一样。在这里, 一种名为 cDAO (耦合 DAO) 的新型 DNA 切片是使用 cDAO 或 cDAO (圆形64或84核苷酸) 的小圆形 ss-DNA 作为支架链和几个线性 Ss-dna 作为主要链。完美的一维和二维纳米结构由 cDAO 瓷砖组装而成: 无限纳米线、纳米轴、纳米管、纳米带;和有限的纳米矩形。详细的方案描述: 1) T4 连接酶制备和纯化变性 page (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 的小圆形寡核苷酸, 2) 退火稳定的圆形瓷砖, 其次是本地 PAGE 分析, 3) 组装无限一维纳米线、纳米轴、纳米轴、纳米管和纳米带的无限二维晶格和有限二维纳米矩形, 然后是原子力显微镜成像。该方法简单、可靠, 对大多数实验室来说都是经济实惠的。

引言

DNA 分子已被用于建立多种纳米结构几十年来。典型的图案包括 dae (双交叉, 反平行, 甚至半转) 和 dao^{瓷砖 1,}2, 3, 星牌 4^,5,6, 7, 单链 (ss)^{瓷砖 8,9,10}和 dna 折纸^11,12,13。这些 DNA 图案和格子是由线性 ss-DNAs 组装而成的。最近, 我们还报告了使用圆形 ss-寡核苷酸作为支架来构建图案、一维纳米管和二维格子^14、15、^16、17。通过在 c64nt 中心插入 holliday 连接点 18^{、19、20、21,可以}形成^一对两个耦合 dao 磁贴17。这个新的 cDAO 母题及其衍生物足够稳定和刚性, 可以组装高达 3x5μm 2 的二维 DNA晶格。在本文中, 我们使用了一个术语 "圆形瓷砖", 它被定义为一个稳定的 DNA 复杂分子, 用一个圆形支架和其他线性的 ss-寡核苷酸的钉建造, 另一个术语 "线性瓦", 它是由一个完整的线性生成寡核苷酸。

该协议演示了如何构建五种 DNA 纳米结构, 这些纳米结构以小圆形 dna 分子为支架: 1) 无限一维 c64nt 和 c64nt 纳米线, 2) 无限二维 Cdao-c64nt-o 和 Cdao-c64t-e (-o 代表5个半圈和---表示偶数的4个半转) 格子, 3) 无限二维 cdao-c8nt-o 和 Cdaa-c84nt e 晶格, 4) 有限的 2D 5x6 Cdao-c64n-o 和 5x6 cdao-c74&84nt o 矩形, 5) 无限 1D acdaa-c4nt e 纳米颗粒和纳米轴 (请参阅 图 3-5用于上述五种 dna 纳米结构的示意图和图像)。一维 c64nt 和 c64nt 纳米线分别从与两个线性订书机相关的每个 c64nt 和 c64nt 支架中组装而成。Cdao-c64nt、Acda-c64nt、cdaa-c74nt 或 Cdao-c84nt 的每个圆形磁贴分别从其相应的 c64nt、c74nt 或 c84 nt 的脚手架中退火, 并分别使用四个线性订书针进行退火。无限二维格子是从具有不同序列的两个圆形磁贴的同一类型进行组装的。两个有限的二维矩形格子分别从32块圆形子网格的两组组合在一起。为了省钱, 在第一个亚退火步骤中, 分别使用不同的悬架来退火32°o-c64nt、12个 cdaa-c74 和 20个 cdao-c84nt 圆形分瓦, 而不同的悬架则只使用单级 c64nt、c64nt 和 c64nt 作为相应的脚手架将相应的32个圆形子晶瓦混合在一起, 应用第二晶格退火步骤分别组装有限的 5x6 cdao-c64n-o 和 5x6 cdao-c74&84nt-o 晶格。当然, 不同顺序的圆形支架可以用来组装各种有限尺寸的纳米结构, 但它将花费更多的金钱和劳动力。无限 1D Acdaa-c64nt e 纳米颗粒和纳米光谱是由一个序列的非对称 acda-c64t 磁贴退火, 线性连接数均匀, 为4个半圈。有两种方法可以从 Cdao-c64nt 和 Cdao-c84nt 的圆形磁贴中组装无限二维格子, 它们分别由偶数4和5个半圈的奇数的互距来区分。前者要求所有磁贴以相同的方式对齐;后者要求沿螺旋轴交替相邻的两个瓦片的面。如果磁贴是刚性和平面的, 例如 Cdao-c64nt, 这两种方法都会产生平面纳米带;如果磁贴向一个方向弯曲, 例如 Cdao-c84nt, 偶数4半转的互连将产生纳米管, 而奇数5半转的互连将产生平面纳米带, 因为消除了曲线偏置的增长, 通过弯曲的瓷砖的交替对齐。从圆形瓷砖成功组装一维和二维 DNA 纳米结构表明了这种新方法的几个优点: 圆形瓷砖的强制稳定性和刚性, 而不是线性瓷砖, 手性瓷砖用于组装非对称纳米结构, 如纳米颗粒和纳米带, 了解 DNA 力学和分子结构等的新愿景。

研究方案

1. 编制圆形 Dna

1. 使用商业公司直接提供的所有线性 Dna, 无需进一步纯化。
2. 以 5, 000xg 离心 DNA 样本 5分钟, 以收集管内底部的所有 DNA 颗粒。加入适当体积的 TE 缓冲液 (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) 来溶解 DNA。
3. 使用260纳米的微紫外光谱仪测量每个 ss-DNA 溶液的 "a" ngμl 浓度。将 "a" ngμμl 转换为 "b" Μμm, 跟随 b = ax10 3/(dna 链的分子量)。调整 TE 溶液的用量, 使 Dna 溶液达到10μm。
4. 使用商业公司直接提供的 C64nt、c64nt 和 c84 nt 的 5 '-磷酸化线性 DNA 模板 (图 1) 的 t4 dna 连接酶端 3 ' 和 5 ' 端。
5. 将 5 '-磷酸化线性 DNA 链 (3.5μm) 及其相应的夹板 dna 链 (4.5μm) 混合在 80μl TE 缓冲液中, 在 200Μlpcr 试管15中。将管子在一个充满95°c 水的开放热瓶中培养。在实验室气氛下, 将热水冷却至室温 (25°C) 约2-3小时。
6. 加入10μl 的 10倍 T4 缓冲液 (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl₂, 100 MM dtt, 1 MM atp) 和 10Μl t4 连接酶 (300 ueμl) 到混合物的最终体积 100μl. 在16°c 下将混合物在热环器中培养16小时。
   注: 上述 DNA 浓度和反应体积 ~ 100μl 优化, 实现了较高的结扎效率和正确的低聚单体环化的高产。根据实验设计, 同时运行两个或两个以上的结扎反应管。替代步骤1.6 的结扎的替代培养过程是在25°c 时4小时。
7. 孵育后, 在95°c 水中灭活 T4 连接酶5分钟。然后将试管转移到冰水浴中, 孵育5分钟降温。
8. 在淬火混合物中加入10Μl 的10Μl 前切酶 i 缓冲液和10Μl 的前切酶 i (5 ueμl), 并在37°c 的水浴中孵育管 30分钟, 以便选择性地消化剩余的线性 Dna, 并使循环 Dna 保持完整。
9. 准备10% 变性页凝胶。
   1. 在通风罩中准备 PAGE 凝胶时, 请戴上橡胶手套和护目镜。加入 6.67 mL 的 30% (w/v) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 (19:1), 2 毫升的 10倍 tae ·镁缓冲液 (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 值 8.0, 12.5 mm mg (Ac) 2), 8.4 克尿素 (7 m) 和去离子水, 最终体积为 20 ml, 在一个40毫升离心管。
      注意: 30% (w/v) 丙烯酰胺溶液 (19:1 1) 是有毒的。
   2. 在将凝胶溶液转移到电泳系统之前, 在40毫升管中加入20μl 四甲基乙二胺 (TEMED) 和100μl 过硫酸铵 (APS, 10% w/v)。插入1.5 毫米厚的10孔梳子。等待至少 20分钟, 直到凝胶溶液凝固。
   3. 对于 85x80x1.5 mm 3 (宽度 x 高度 x 厚度)^的凝胶, 设置恒定电压为 80 v。添加 1x TAE·镁缓冲液到电泳系统, 并在 10 v/厘米的凝胶前放20分钟。
10. 将步骤1.8 中的 PCR 试管置于95°c 水中 5分钟, 使外核酶 i 失活。然后将试管转移到冰水浴中, 再孵育5分钟。
11. 在试管中加入20μl 的甲酰甲酰, 最终体积为 140μl, 然后混合溶液。将溶液分布在7-9 变性 page 凝胶井, 每个凝胶井以16-20μl 均匀。将负载染料 (0.05% 溴酚蓝色、0.05% 二甲苯氰醇 FF、60% 甘油、10 mM Tris-HCl、60 mm EDTA、ph 7.6) 与相应前体线性 DNA (10μm) 的8Μl 混合, 并将混合物注入单独的井中, 供参考。
    注: 添加甲酰胺是为了增加将装入到 PAGE 凝胶底部的加载溶液的密度, 也是为了消除一些双链 DNA 残留物的联系。
12. 在 10 V/cm 处运行凝胶约 2小时, 并在二甲苯氰醇 FF 用肉眼处于玻璃板的 2/位置时停止运行。
13. 戴橡胶手套和护目镜, 以保护皮肤和眼睛。把凝胶从玻璃板里拿出来。将凝胶放在荧光薄层色谱 (薄层色谱) 板上。用剃须刀片将目标凝胶带剪掉, 就像紫外线照射的阴影一样 (图 2)。
    注意: 紫外线对眼睛和皮肤有害。
    注: 在254纳米的紫外线照射下, DNA 会吸收光线, 并将阴影投射到薄层色谱板上。圆形 DNA 的运行速度比相应的前体线性 DNA 稍慢。一些未消化的线性 Dna 和少量不需要的圆形 Dna, 这些都是在阴影目标带周围, 如果收集到, 会污染圆形 DNA。
14. 将凝胶带转移到 2.0 mL 微离心管中。空气干燥或吹干凝胶带, 然后将凝胶捣碎成糊状, 用铲子或扁平的玻璃棒。确保凝胶已被完全粉碎成糊状, 这对圆形 DNA 的高产至关重要。将凝胶体积的两倍去离子水加入试管, 并在室温下摇一摇。
15. 过滤混合物, 在 2.0 mL 微离心管中收集上清液。通过用少量去离子水冲洗和再次过滤来恢复任何残留的 DNA, 以结合上清液。
16. 用等量的正丁醇提取洗脱液。重复此过程, 直到水体积减少到约200μl。
17. 在混合物中加入500Μl 的绝对乙醇 (-20°c) 和20μl 的 3M NaOAc (pH 5.1), 以进行 DNA 沉淀。将管材存放在-20°c, 时间为30分钟。
18. 在4°c 条件下, 以 12, 000 x g 离心管 10分钟, 丢弃上清液。剩余的 DNA 沉淀在管内约为100Μl。
19. 将600μl 的75% 乙醇 (-20°c) 添加到试管中, 并将其存放在-20°c 下30分钟。然后在4°c 下, 以 12, 000 x g 离心 10分钟, 丢弃上清液。剩余的 DNA 沉淀是大约100μl 溶液在管再次。重复此过程两次。
20. 最后离心后, 尽可能地丢弃上清液。用真空集中器擦干遗骸。
21. 将纯化后的圆形 DNA 存放在-20°c 的试管中。
22. 在 TE 缓冲液中重新利用圆形 DNA, 在需要时根据步骤1.3 生成10μm 圆形 DNA 片段。

2. 装配解决方案的退火

1. 准备 c64bp、c64bp、HJ-C64NT、Ahj-c64nt 的每个瓷砖或纳米结构组装解决方案, HJ-C84NT、Tj-c84nt、Cdao-c64nt、Acdao-c64nt、cdao-c84nt、c64nt、c84nt、cdao-c64t 和 Acdao-c64t-e, 设计了一套用于单锅退火的线性和圆形 Dna。
   1. 对于每个装配解决方案, 混合2μl 的 10倍 tae ·镁缓冲液, 在相同的摩尔比中, 对一组线性和圆形链的每个 DNA 库存溶液的1微克升, 以及在 200μl PCR 试管中的额外 te 缓冲液, 使每条链的最终浓度达到 0.5μm, 最终体积为20Μl 退火。热瓶从95°c 到25°c 超过48小时。
2. 用一组设计的两步退火线性和圆形 dna, 制备 cdao-c64nt-o、Codaa-c64it-o、cdaa-c84nt-o 的2d 无限格子的每个装配解决方案。
   1. 通过混合2μl 的 10倍 tae·镁缓冲液, 在相同的摩尔比的一组线性和圆形链的每个 DNA 库存溶液的 1Μl, 并在 200μl PCR 试管中增加 te 缓冲液, 使每个链的最终浓度为 0.Μm, 最终体积为20Μl。在第一个子瓷砖退火步骤中, 使用95°c 至25°c 超过 2.5 h 的快速线性冷却方法, 对 PCR 热囊中的每个前体子瓦溶液进行退火。
   2. 通过将两个对应的子瓦溶液中的每个解的10Μl 混合在一起, 为每条钢绞线的最终浓度 0.25Μm, 准备上述四个无限晶格的每个装配解决方案。在第二晶格退火步骤中, 使用缓慢冷却的方法在 PCR 热循环器中退火20μl 混合物, 该方法在50°c 保持 2小时, 并以每5分钟至 20°c 0.1°c 的速度冷却, 总共约为24小时。
      注: 每个2D 无限格的第二个退火步骤可以同时运行或随后运行两个并行实验。
3. 准备两个有限矩形组件的两个有限的组装解决方案 5x6 cdao-c64it-o 和 5x6 cdao-c74&c84nt o 用于两步退火。
   1. 通过混合1Μl 的 10倍 tae·镁缓冲液, 在等摩比的一组线性和圆形链的每个 DNA 库存溶液中0.5 微米, 以及在 200μl PCR 试管中的额外 te 缓冲液, 每个链的最终浓度为 0.Μm, 最终体积为10Μl。在第一个退火步骤中, 使用95°c 至25°c 以上2.5 小时的快速线性冷却方法, 在 PCR 热囊中退火每个前体子瓦溶液。
   2. 将每个有限矩形晶格组合解决方案混合在一个 200Μl PCR 试管中, 使每个子瓦的最终浓度为 ~ 15 nM, 最终体积为 64Μl, 从而制备每个有限矩形晶格组件解决方案。在第二个退火步骤中, 使用缓慢冷却的方法在 PCR 热循环器中退火64μl 混合物, 该方法在50°c 保持 2小时, 并以 0.1°c/5分钟至20°c 的速度冷却, 总共约24小时。
      注: 每个有限矩形组件的第二个退火步骤可以同时运行或随后运行五个并行实验。

3. 原生页分析

1. 按照步骤1.9 准备10% 的原生 PAGE, 尿素成分除外。
2. 对于 c64bp 和 c64bp 的控制样品, 分别在 te 缓冲液中添加每个装配溶液的2μl 和1μl 加载染料作为控制。对于图 3中列出的每个其他组件, 在 te 缓冲液中加入每个组件溶液的1μl 和1Μl 加载染料。
3. 将上述每个溶液注入凝胶井。添加5Μl 的 DNA 标记 (25-500 bp) 到一个单独的井, 作为参考。
4. 在冰水浴中, 在 10 v/厘米处运行凝胶约4小时。二甲苯氰醇 FF 将耗尽玻璃板。
5. 戴橡胶手套和护目镜, 以保护皮肤和眼睛。将凝胶从玻璃板中取出, 用10μl 的核酸凝胶染色将其浸入100毫升的去离子水中30分钟。
   注意: 核酸凝胶染色溶液是有毒的。
6. 观察紫外线成像系统下的凝胶, 并拍摄染色凝胶的照片 (图 3)。

4. 有限晶格的净化

1. 制备天然2% 琼脂糖凝胶, 用于有限晶格的电泳纯化。
   1. 混合1克琼脂糖粉, 5 毫升 10倍 TBE ·镁缓冲液 (89 mM Tris, 89 mm Boric 酸, 2 mM EDTA, pH 值 8.0, 12.5 mM mg (Ac) 2), 2μl 的核酸凝胶染色和47.5 毫升的去离子水在一个250毫升三角瓶.将混合物煮沸, 直到气泡变小和致密。在瓶子里加入热水, 总体积为50毫升, 浓度为2% 琼脂糖。
   2. 戴上厚厚的手套。将凝胶溶液倒进 7 x 10 x 1 厘米 3 (宽 x 长 x 厚度) 的塑料凝胶盒^中。插入1.5 毫米厚的12孔凝胶梳子。等待凝胶冷却到室温。如有必要, 请将凝胶放入4°C 的冰箱中。
      注意: 请注意烫伤, 因为溶液非常热。
   3. 添加 0.5 x TBE ·电泳系统中的镁缓冲液。在 50 v 的恒压下, 在冰水浴中, 将凝胶在 5 V/厘米处提前20分钟。
   4. 在每个琼脂糖凝胶中注入步骤2.3 中制备的有限晶格溶液 20Μl, 并在单独的井中添加5Μl 的 dna 标记物 (100-3000 bp)。在冰水浴中, 在 5 v/厘米处运行凝胶2小时。
   5. 戴橡胶手套和护目镜, 以保护皮肤和眼睛。在紫外光下, 将目标凝胶带切割成类似于 1, 000 bp 标记的位置, 并将其切成细片, 并将被压碎的凝胶放入过滤柱⁸中。
   6. 在4°C 条件下, 以 2, 000 x g离心柱5分钟。通过列提取示例解决方案。收集 AFM 成像的解决方案。
2. 利用 PEG 沉淀法纯化有限晶格。
   1. 将步骤2.3 中制备的有限晶格溶液的50Μl 混合, 相同体积为 15% PEG8000 (W/v)_{缓冲液 (}20 mm Mg (ac) 2, 5 mm tris, 1 MM edta 和 505 mM nacl)²²。在4°c 条件下, 以 18 , 000xg 离心溶液30分钟。
   2. 取出上清液, 加入100Μl 的 PEG 缓冲液。重复离心。
   3. 去除上清液后, 将颗粒溶解在 1x TAE 中·用于 AFM 成像的镁缓冲器。
      注: 对于 AFM 成像和其他应用中 5x6 Cdao-c64in-o 和 5x6 cdao-c74&c84nt o 的有限晶格, 需要进行纯化。如果产率太低, 提高离心速度。如果产品不够纯净, 请重复步骤4.2.2。

5. AFM 成像

1. 对于 c64nt 纳米线、c64nt 纳米线、Acdao-c64nt-e、Cdao-c64nt-e (O) 的无限二维格子和 Cdao-c84nt-e (O), 将2μl 退火样品保存在新鲜的云母表面。离开 2分钟, 以便将 DNA 晶格吸附到云母表面。用100μl 的去离子水清洗表面两次, 然后用压缩空气干燥。
2. 利用三角 AFM 探针在攻丝模式下扫描云母表面, 获得空气中无限 DNA 晶格的 AFM 图像。设置扫描参数: 扫描尺寸 0.5 ~ 5μm, 扫描分辨率512线, 扫描速率 3.5 Hz (图 4)。
3. 对于 5x6 Cda-c64t-o 和 5x6 cdao-c74&c84nt o 的有限 DNA 晶格, 沉积80Μl 的 1x tae ·在新鲜的乳清面上的镁缓冲液。然后在缓冲液中加入5μl 的有限样本。离开 2分钟, 以便将 DNA 晶格吸附到云母表面。再加入50Μl 的 1x TAE ·AFM 探头上的镁缓冲器。
4. 利用三角 AFM 探针在攻丝模式下扫描云母表面, 获得流体中有限 DNA 晶格的 AFM 图像。设置扫描参数: 扫描大小为0.5-1 微米, 扫描分辨率为256线, 扫描速率为 1.5 Hz (图 5)。

结果

由于环状 dna 内的毛孔被凝胶纤维 23, 24, 25 穿透和阻碍, 因此在变性页中, 圆形 dna 的移动速度比其前兆线性 dna 稍慢(图 2⁾.低聚单体环化的正确结扎反应效率取决于基板序列和浓度、反应温度、时间等。由于前体线性 DNA 的浓度在3.5Μm 左右足够高, 因此, 在 uv 光下, c64nt (或 c64...

讨论

本文提出的方案主要集中在小圆形 DNA 分子的合成和 DNA 纳米结构的组装上。大多数随机测序的 DNA 设计可以在该协议中使用。圆形 Dna 的纯度对于 DNA 组件的成功至关重要。降低 5 '-磷酸化线性 DNA 的浓度可以提高环化的生产产率;但是, 这将增加产生相同数量的循环 Dna 的工作量。夹板 DNA 链的长度也会影响正确的结扎反应, 优化后 c64nt 和 c64nt 的核苷酸长度在20个左右。

在组装?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
T4 ligase	TaKaRa	2011A
T4 buffer	TaKaRa	2011A
TE buffer	Sangon	B548106
Thermo bottle	Thermos	SK-3000
Thermo cycler	Bio Gener	GE4852T
Exonuclease I	TaKaRa	2650A
Exonuclease I buffer	TaKaRa	2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1)	Sangon	B546016
TAE premix podwer	Sangon	B540023
Mg(Ac)2·4H2O	Nanjing Chemical Reagent	C0190550223
Urea	Sangon	A510907
TEMED	BBI	A100761
Ammonium Persulfate	Nanjing Chemical Reagent	13041920295
Power supply	Beijing Liuyi	DYY-8C
Water bath	Sumsung	DK-S12
Formamide	BBI	A100314
DNA Marker (25~500 bp)	Sangon	B600303
DNA Marker (100~3000 bp)	Sangon	B500347
Loading buffer	Sangon	B548313
PAGE electrophoresis systerm	Beijing Liuyi	24DN
Filter	ASD	5010-2225	0.22 µM
UV imaging System	Tanon	2500R
n-butanol	Sangon	A501800
Absolute Ethanol	SCR	10009257
NaOAc	Nanjing Chemical Reagent	12032610459
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator	CHRIST	RVC 2-18
Ultraviolet spectrum	Allsheng	Nano-100
nucleic acid stain	Biotium	16G1010	GelRed
Agarose	Biowest	G-10
Agarose electrophoresis systerm	Beijing Liuyi	DYCP-31CN
Heating Plate	Jiangsu Jintan	DB-1
TBE premix podwer	Sangon	B540024
filter column	Bio-Rad	7326165	Freeze 'N Squeeze column
AFM	Bruker	Dimension FastScan
PEG8000	BBI	A100159
Mica	Ted Pella	BP50
triangular AFM probe in air	Bruker	FastScan-C
triangular AFM probe in fulid	Bruker	ScanAsyst-fluid+
DNA strands	Sangon