ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

要約

本稿では T4 結紮およびアニール小さな環状 dna の変性のページ浄化のための詳しいプロトコルとゲルの円形タイル、組立およびアガロースと同様、1 D および 2 D の DNA ナノ構造の原子間力顕微鏡イメージングのネイティブのページの分析有限の DNA ナノ構造の電気泳動および遠心分離浄化。

要約

本稿では小さな円形の DNA の分子の合成のための詳しいプロトコル円形の DNA モチーフと 1 D および 2 D の DNA ナノ構造の構築の熱処理します。わたり、DNA のナノテクノロジーの急速な発展はソース材料として線形 DNAs の使用に起因します。たとえば、DAO (クロス オーバー、平行、奇妙な回転半二重) タイルは 2次元 DNA 格子; の建設のためのビルディング ブロックとしてよく知られています。DAO のコア構造は、右手の縦結びを作る 2 つのロープのような 2 つの線形単一座礁させた (ss) オリゴヌクレオチドから作られます。ここ、cDAO (結合 DAO) と呼ばれる DNA タイルの新しい型は、c64nt または c84nt の小さな円形 ss DNA を使用して構築されます (円形 64 または 84 ヌクレオチド) 足場鎖および短鎖としていくつか線形 ss DNAs として。完璧な 1 D および 2 D ナノ構造は cDAO タイルから組み立てられて: 無限ナノワイヤー, nanospirals, カーボンナノ チューブ, ナノリボン;有限のナノ-四角形。詳細なプロトコル説明: 1) 準備 T4 リガーゼと小さな円形のオリゴヌクレオチドのページ (ポリアクリルアミドゲル電気泳動) の変化によって浄化、ネイティブ ページ分析、3) 組立が続く 2) 安定した円形タイルの焼鈍無限 1 次元ナノワイヤ、ナノリングの nanospirals、カーボンナノ チューブ ・ ナノリボン、有限 2次元ナノ-長方形の無限の 2次元格子は AFM (原子間力顕微鏡) 画像が続きます。メソッドは、シンプルで堅牢、かつほとんどのラボの手頃な価格です。

概要

DNA 分子は、十年にわたって多くの種類のナノ構造を構築する使用されています。典型的なモチーフは、DAE を含める (平行、ダブルのクロス オーバーも半分-ターン) と 1 つの DAO タイル^1,2,3、星のタイル^4,5,6、7、(ss) タイル^8,9,10、および DNA 折り紙^11,12,13を足止め。これらの DNA モチーフと格子は、線形 ss Dna からアセンブルされます。最近では、他の人と我々 は、モチーフと 1 D 2 D 格子^14,15,16,17を構築する足場として円形 ss オリゴヌクレオチドの使用を報告しています。C64nt の中心にホリデー ジャンクション (HJ)^18,19,20,21を挿入する、2 つの結合 DAO タイルのペアの形成された¹⁷できます。この新しい cDAO モチーフとその誘導体は、安定している、2 D を組み立てる十分な剛性 DNA 格子まで 3 × 5 μ m²。本稿で我々 は任期は 1 つの円形の足場や他の線形 ss オリゴヌクレオチドの構築安定した DNA 複合体分子として定義している「円形タイル」と「線形タイル」は、線形の完全なセットから構築の別の用語を使用してss オリゴヌクレオチド。

このプロトコルは、5 種類の足場として小さな環状 dna と DNA ナノ構造を構築する方法を示します: 1) 無限 1 次元 c64nt と c84nt ナノワイヤー、2) 無限の 2D cDAO-c64nt-O および cDAO c64nt E (-O 5 回転半と -E の数が奇数を表します4 回転半の偶数を表します) 格子、3) 無限 4 を cDAO-c84nt-O と cDAO c84nt E 格子を 2次元) 有限 2次元 5 × 6 cDAO-c64nt-O、5 × 6 84nt &o cDAO c74 四角、5) 無限 1 次元 acDAO-c64nt-E ナノリングと nanospirals (を参照してください図 3-5図と DNA ナノ構造体の上記 5 種類の画像)。1 D c64nt と c84nt ナノワイヤーは、それぞれ 2 つの線形のステープルに関連付けられている各 c64nt と c84nt の足場からアセンブルされます。CDAO c64nt、acDAO c64nt、cDAO-c74nt、または cDAO c84nt の各円形のタイルがそれぞれ c64nt、c74nt、または 4 つの線形ステープル c84nt の対応する足場からアニールされます。無限の 2次元格子は同じ種類の異なるシーケンスを持つ 2 つの円形タイルから組み立てられて。それぞれ、32 の円形部分のタイルの 2 つのセットから 2 つの有限の 2 D 矩形格子をまとめます。お金を節約するには、だけ 1 つシーケンス処理した c64nt、c74nt、および c84nt としてそれぞれの足場 32 cDAO c64nt、12 cDAO-c74nt、および最初のサブ タイル アニーリング ステップでそれぞれ 20 cDAO c84nt 円形サブ タイルをアニールし別のオーバー ハングが使用されて対応する 32 の円形のサブのタイルを一緒に混合し、それぞれ cDAO-c64nt-O の有限 5 × 6、5 × 6 84nt &o cDAO c74 格子をアセンブルする手順を焼鈍第 2 格子を適用します。間違いなく、しかしより多くのお金と労力がかかりますさまざまな有限サイズのナノ構造を組み立てるために円形の足場の異なるシーケンスが適用できます。無限 1 次元 acDAO-c64nt-E ナノリングと nanospirals は、4 回転半の偶数の線形結合の 1 つシーケンス処理した非対称 acDAO c64nt タイルからアニールされます。CDAO c64nt と cDAO-c84nt、それぞれの 4 と 5 回転半数が奇数偶数の intertile の距離によって区別される円形タイルから無限の 2次元格子をアセンブルする方法の 2 種類があります。同じように配置するすべてのタイルが要求されます。後者のヘリカル軸に沿って 2 つの隣接タイル面の交替が必要です。タイルである剛性と平面 cDAO c64nt など、両方のアプローチは平面のナノリボン; を生成します。タイルは cDAO-c84nt、4 の偶数の intertile 接続など、1 つの方向に向かって曲がるかどうかに対し、半分の回転はナノチューブを生成する 5 の数が奇数の intertile 接続半分の回転の除去による平面ナノリボンが生成されます湾曲したタイルの代替配置による曲率偏った成長。円形のタイルから 1 D および 2 D DNA ナノ構造体のアセンブリが成功したこの新たなアプローチのいくつかの利点を示す: 安定性と線形タイル上円形タイル、非対称ナノ構造のアセンブリのキラル タイルの剛性をよう強制ナノリングおよびナノリボン、 DNA の力学、分子構造などを理解することで新たなビジョン。

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プロトコル

1. 円形 Dna の準備

1. すべての線形 DNAs をさらに精製することがなく直接商業企業によって提供されるを使用します。
2. チューブの下部にすべての DNA のペレットを収集するために 5 分間 5,000 × g で DNA サンプルを遠心します。TE バッファー (10 mM トリス、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) DNA を溶解するための適切な量を追加します。
3. 260 マイクロ紫外分光計を使用して各 ss DNA の解決のため「、」ng/μ L の濃度測定 nm。"B"μ M"a"ng/μ L に変換 b =³ × 10/(分子量 DNA の鎖)。10 μ M DNA 原液に TE 溶液の量を調整します。
4. T4 DNA リガーゼを使って、5'-リン酸化線形 DNA のテンプレート (図 1) の c64nt、c74nt および民間企業から直接提供される c84nt の 3' と 5' 端を接続します。
5. 線形 DNA 鎖 (3.5 μ M) が 5'-リン酸化とその対応するスプリント DNA 鎖 (4.5 μ M) 200 μ L の PCR テスト チューブ¹⁵80 μ L TE バッファーにミックスします。95 ° C の水で満たされた開放熱ボトルにチューブを孵化させなさい。ラボの雰囲気下で約 2-3 時間室温 (25 ° C) にお湯を冷やします。
6. 10 x T4 バッファー (660 mM トリス-HCl、66 mM MgCl₂, 100 mM DTT、1 mM ATP) の 10 μ L を追加し、100 μ L の最終巻に混合物に T4 リガーゼ (300 U/μ L) を 10 μ l 添加はインキュベート 16 ° C で 16 時間、たちの混合物
   注: 上記 DNA 濃度と ~ 100 μ L の反応量は高位結紮効率と正しいオリゴ モノマー環化反応の高収率のために最適化されています。実験デザインによると同時にライゲーション反応の 2 つ以上のチューブを実行します。結紮交換ステップ 1.6 の代替孵化プロシージャは 25 ° C で 4 時間です。
7. 、孵化後 5 minminutes の 95 ° C の水で T4 リガーゼを不活性化します。チューブを氷水浴に転送し、クールダウン 5 分間インキュベートします。
8. バッファー私 Exonuclease x 10 の 10 μ L とエキソヌクレアーゼの 10 μ L を追加私 (5 U/μ L) 焼入れの混合物にし、37 ° c を残りの線形 Dna を消化し、円形の Dna をそのまま 30 分間水のお風呂でチューブを孵化させなさい。
9. ページのゲルの変化 10% を準備します。
   1. ヒューム フードのページのゲルを準備するときゴム手袋、ゴーグルを着用します。追加 30% (w/v) アクリルアミド/bisacrylamide 溶液 (19:1)、6.67 mL 10 の 2 mL x TAE·Mg バッファー (40 mM トリス、40 mM 拍、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、12.5 mM Mg(Ac)₂) 尿素 (7 M) の脱イオン水 20 mL 40 mL 遠心管中の最終巻に 8.4 g。
      注意: 30% (w/v) アクリルアミド/bisacrylamide ソリューション (19:1) 溶液は毒性です。
   2. テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L を追加および 40 ml の過硫酸アンモニウム (AP, 10 %w/v) を 100 μ l 添加チューブ転送する前にゲル溶液の電気泳動システムにすぐに。厚さ 1.5 mm、10 も櫛を挿入します。ゲル溶液が固化するまでは、少なくとも 20 分を待ちます。
   3. 85 × 80 × 1.5 mm のゲルの 80 V の定電圧を設定³ (幅 × 高さ × 厚さ)。1 x TAE· を追加します。Prerun 10 V/cm で 20 分のゲル電気泳動システムに Mg バッファー。
10. ステップ 1.8 で 95 から PCR テスト チューブを入れて ° C 水資源の Exonuclease を不活化する 5 分間。チューブを氷水浴に転送し、別の 5 分間インキュベートします。
11. 140 μ L の最終巻にチューブでホルムアミドの 20 μ L を追加し、ソリューションをミックスします。まあ各ゲルの 16-20 μ L で均等に 7-9 変化のページ ゲルの井戸にソリューションを配布します。ローディングの染料 (0.05% ブロモフェノール ブルー、0.05% キシレンシアノール FF、60% グリセロール、10 mM トリス-HCl、60 ミリメートルの EDTA、pH 7.6) 対応する前駆体の線形 DNA の 8 μ L でのミックス 2 μ L (10 μ M) と別よく参照のために混合物を注入します。
    注: ホルムアミドの加算もページのゲルの底に沈むため読み込みソリューションの密度を高めるために、でもいくつかのダブルの関連付けを解除する DNA 残基を足止め。
12. 10 V/cm で約 2 時間のためのゲルを実行し、キシレンシアノール FF が肉眼でガラス板の 2/3 の位置にあるときに実行を停止します。
13. ゴム手袋、皮および目を保護するゴーグルを着用します。ガラス プレートからゲルを取る。TLC (薄層クロマトグラフィー) 蛍光板上ジェルします。かみそりの刃によって断ち切られるターゲット ゲル バンド丁度 UV 照射 (図 2) では影付きにします。
    注意: 紫外線は目や皮に有害です。
    注: UV 照射下で 254 nm、DNA は光を吸収し、TLC プレート上にシャドウをキャストします。環状の DNA をその対応する前駆体の線形 DNA よりも若干遅く走った。いくつか未消化の線形 DNAs とシャドウのターゲットのバンドを囲む少量で不要な円形 Dna は環状 DNA を汚染が収集される場合。
14. 2.0 mL 遠心チューブにゲルのバンドを転送します。空気乾燥またはブロー乾燥ゲルのバンド、ヘラやフラットなガラス棒でペースト状にゲルをマッシュ アップします。ゲルにペースト、環状 DNA の高収率に重要な完全に押しつぶされていることを確認します。チューブにゲル量の脱イオン水の 2 回を加え、一晩常温で管を振る。
15. 2.0 mL 遠心チューブに上清を収集するために混合物をフィルター処理します。脱イオン水と培養上清を結合するもう一度フィルターの量が少ないと洗浄によって残りの DNA を回復します。
16. N-ブタノールの等量の溶離液を抽出します。水の量が約 200 μ L になるまでこの手順を繰り返します。
17. 無水エタノール (− 20 ° C) を 500 μ l 添加し、20 μ L の 3 M NaOAc (pH 5.1) DNA の沈殿物の混合物に。− 20 ° C で 30 分間でチューブを格納します。
18. 4 ° C で 10 分間、12,000 × g でチューブを遠心、上清を捨てます。残りの DNA の沈殿物はチューブで約 100 μ L です。
19. チューブに 75% エタノール (− 20 ° C) の 600 μ L を追加し、30 分 − 20 ° C で保存します。その後、4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離は、上澄みを廃棄します。残りの DNA の沈殿物は再びチューブで約 100 μ L ソリューションです。手順を 2 回繰り返します。
20. 最後の遠心分離後可能な限りの上澄みを廃棄します。真空濃縮のままを乾燥させます。
21. − 20 ° c. でチューブの精製の環状 DNA を格納します。
22. 解決をするため、10 μ M 円形 DNA ストック手順 1.3 必要なときによると TE バッファーの環状 DNA を再懸濁します。

2. アセンブリ ソリューションの焼鈍

1. 1 ポット焼鈍タイルまたはナノ構造アセンブリで各ソリューション c64bp、c84bp、HJ c64nt、aHJ c64nt、HJ c84nt、tHJ c84nt、cDAO c64nt、acDAO c64nt、cDAO c84nt、c64nt、c84nt、および acDAO-c64nt-E の線形と円形の Dna の設計されたセットを準備します。
   1. 各アセンブリ ソリューション ミックス 10 の 2 μ L x TAE·Mg バッファー、等しいモル比で 0.5 μ M、20 μ L の最終巻でそれぞれの鎖の最終的な集中に 200 μ L の PCR テスト チューブに TE バッファーが追加線形と円形の鎖のセットの各 DNA 原液 1 μ L でアセンブリ ソリューションをアニール、熱のボトルは、95 ° C から 25 ° C 48 h 以上。
2. 2 段階の熱処理の線形と円形の Dna の設計されたセットで cDAO c84nt O cDAO-c84nt-E、cDAO c64nt O cDAO-c64nt-E の 2 D 無限格子の各アセンブリ ソリューションを準備します。
   1. 10 の 2 μ L を混合することによって各前駆体サブ タイル アセンブリ ソリューションを準備 x TAE·Mg バッファー、1 μ L の各 DNA 保存溶液モル比率は等しく、線形と円形のストランドと 20 μ L の最終巻・各ストランドの 0.5 μ M の最終濃度 200 μ L PCR テスト チューブに TE バッファーが追加のセット。最初のサブ タイル アニーリング ステップでアニールの 95 ° C から 25 ° c 以上 2.5 h の高速線形冷却法を用いた PCR たちである前駆体の各サブ タイル ソリューションを実行します。
   2. 各ストランドの 0.25 μ M の最終的な集中に一緒に 2 つの対応するサブ タイル ソリューションのそれぞれの 10 μ L を混合することによって、上記の 4 つの無限格子の各アセンブリ ソリューションを準備します。アニーリング ステップ第 2 格子、2 h は 50 ° C に滞在し、20 ° C、合計で約 24 時間に 5 分あたり 0.1 の ° C の率で冷却の遅い冷却法を用いた PCR たちで 20 μ L の混合物をアニールします。
      注: 2 つの並列実験で実行できます同時にまたはその後各二次元無限格子の 2 番目のアニーリング ステップ。
3. 2 段階の熱処理を 5 × 6 cDAO-c64nt-O、5 × 6 cDAO c74 & c84nt O の 2 つの有限矩形アセンブリのアセンブリ ソリューションを準備します。
   1. 10 の 1 μ L を混合することによって各前駆体サブ タイル アセンブリ ソリューションを準備 x TAE·Mg バッファー、等しいモル比で線形と円形のストランドと各ストランドの 0.5 μ M の最終濃度、10 μ L の最終巻に 200 μ L の PCR テスト チューブで追加の TE バッファーのセットのそれぞれの DNA の原液を 0.5 μ l 添加します。最初のアニーリング ・ ステップ 95 ° C から 25 ° c 以上 2.5 h の高速線形冷却法を用いた PCR たちである前駆体の各サブ タイル ソリューションをアニールします。
   2. ~ 15 の最終的な集中に 200 μ L の PCR テスト チューブで一緒に (各サブ タイル ソリューションの 2 μ L) x 32 を混合することによって各有限矩形格子アセンブリ ソリューションを準備各サブ タイルと 64 μ L の最終巻の nM。2 番目のアニーリング ・ ステップ 2 h は 50 ° C にご滞在の合計で約 24 時間 20 ° c、5 分あたり 0.1 の ° C の割合で冷却の遅い冷却法を用いた PCR たちで 64 μ L 混合物をアニールします。
      注: 5 つの並列実験で実行できます同時にまたはその後 2 番目のアニーリング ・ ステップ有限矩形アセンブリごとに。

3. ネイティブ ページ分析

1. 10% ネイティブ ページを準備尿素コンポーネントを除く 1.9 と次のステップします。
2. C64bp と c84bp のサンプルのコントロール、各アセンブリ ソリューションの 2 μ L とローディング コントロールとして別の TE バッファーの 3 μ L に染料の 1 μ L を追加します。図 3に記載されている他のアセンブリごとに、1 μ L の各アセンブリ ソリューションと TE バッファーの 4 μ L にローディングの染料の 1 μ L を追加します。
3. よくゲルに上記ソリューションのそれぞれを挿入します。参考のため別の井戸に 5 μ L の DNA マーカー (25-500 bp) を追加します。
4. 氷の水のお風呂に 10 V/cm で約 4 時間のゲルを実行します。キシレンシアノール FF にはガラス板がなくなります。
5. ゴム手袋、皮および目を保護するゴーグルを着用します。ガラス プレートからゲルを取るし、30 分の核酸ゲル染色の 10 μ L の脱イオン水 100 mL に浸します。
   注意: 核酸ゲル染色溶液は有毒です。
6. イメージング システム、UV の下でゲルを観察し、染色ゲル (図 3) の写真を撮る。

有限束の清浄化

1. 有限束の電気泳動の浄化のためネイティブ 2% の agarose のゲルを準備します。
   1. アガロース粉末、10 の 5 mL の 1 g をミックス x TBE·Mg バッファー (89 mM トリス、89 mM ホウ酸、2 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、12.5 mM Mg(Ac)₂)、2 μ L の核酸ゲル染色および 47.5 mL の脱イオン水 250 ml を三角形に。小さく、密な泡になるまで混合物を沸騰します。50 mL の容量と 2% の agarose の集中をボトルにお湯を追加します。
   2. 厚手の手袋を着用します。1 cm³ (幅 × 長さ × 厚さ) x 10 x 7 のプラスチック製ジェル ボックスにゲル溶液を注ぐ。1.5 mm 厚と 12 もゲル櫛を挿入します。ゲル室温に冷却するを待ちます。必要に応じて、4 ° C 冷蔵庫の中にゲルを置きます。
      注意: は、解決策は非常に熱いのでやけど注意します。
   3. 0.5 x TBE· を追加します。電気泳動システムで Mg バッファー。5 V/cm の 50 V の定電圧時氷の水のお風呂に 20 分でゲルを prerun します。
   4. 有限の格子ソリューション ステップ 2.3 各 agarose のゲルの準備の 20 μ L を挿入しても別に 5 μ L の DNA マーカー (100 3,000 bp) を追加します。氷の水のお風呂に 5 V/cm で 2 h のためのゲルを実行します。
   5. ゴム手袋、皮および目を保護するゴーグルを着用します。ターゲット ゲル紫外線とスライスそれらに細かい部分とフィルター列⁸に押しつぶされたゲルを置く下 1,000 bp マーカーと同様の位置にバンドをカット。
   6. 遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 2,000 x gで列列をサンプル ソリューションを展開します。AFM イメージングのためのソリューションを収集します。
2. PEG 沈殿物によって有限の格子を浄化します。
   1. 手順で、有限の格子溶液のミックス 50 μ L (w/v) 15 %peg8000 の等しい容積と 2.3 バッファー (20 mM Mg(Ac)₂, 5 mM トリス、1 mM EDTA と 505 mM NaCl)²²。4 ° C、30 分で 18,000 × gで溶液を遠心します。
   2. 上澄みを除去し、PEG バッファーを 100 μ l 添加します。遠心分離を繰り返します。
   3. 上清を除去した後 1 でペレットを溶解 x TAE·AFM イメージングの Mg バッファー。
      注: 浄化 5 × 6 cDAO-c64nt-O、5 × 6 cDAO c74 & c84nt-O AFM イメージングと他のアプリケーションのための有限束必要です。利回りが低すぎる場合は、遠心分離速度を上げます。製品は、純粋なない場合、は、4.2.2 の手順を繰り返します。

5. 原子間力顕微鏡イメージング

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結果

環状 DNA をゲル繊維^23,24,25その前駆体の線形 DNA 環状 DNA 内細孔は浸透するのでページ (図 2) の変化と障害のより少し遅く移動します。オリゴ モノマー環化反応の正しいライゲーション反応効率は、基板のシーケンスと濃度、反応温度、時間などによって異なります。前...

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ディスカッション

小さな環状 dna の合成と DNA ナノ構造体のアセンブリにこの記事のフォーカス表示プロトコル。DNA デザインのランダム シーケンスのほとんどは、このプロトコルで使用できます。円形の Dna の純度は、DNA アセンブリの成功にとって重要です。環化反応の生産量は、5'-リン酸化線形 DNA の濃度を下げることによって向上させることがただし、円形の DNAs の同じ量を生産するワークロードが増加?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
T4 ligase	TaKaRa	2011A
T4 buffer	TaKaRa	2011A
TE buffer	Sangon	B548106
Thermo bottle	Thermos	SK-3000
Thermo cycler	Bio Gener	GE4852T
Exonuclease I	TaKaRa	2650A
Exonuclease I buffer	TaKaRa	2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1)	Sangon	B546016
TAE premix podwer	Sangon	B540023
Mg(Ac)2·4H2O	Nanjing Chemical Reagent	C0190550223
Urea	Sangon	A510907
TEMED	BBI	A100761
Ammonium Persulfate	Nanjing Chemical Reagent	13041920295
Power supply	Beijing Liuyi	DYY-8C
Water bath	Sumsung	DK-S12
Formamide	BBI	A100314
DNA Marker (25~500 bp)	Sangon	B600303
DNA Marker (100~3000 bp)	Sangon	B500347
Loading buffer	Sangon	B548313
PAGE electrophoresis systerm	Beijing Liuyi	24DN
Filter	ASD	5010-2225	0.22 µM
UV imaging System	Tanon	2500R
n-butanol	Sangon	A501800
Absolute Ethanol	SCR	10009257
NaOAc	Nanjing Chemical Reagent	12032610459
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator	CHRIST	RVC 2-18
Ultraviolet spectrum	Allsheng	Nano-100
nucleic acid stain	Biotium	16G1010	GelRed
Agarose	Biowest	G-10
Agarose electrophoresis systerm	Beijing Liuyi	DYCP-31CN
Heating Plate	Jiangsu Jintan	DB-1
TBE premix podwer	Sangon	B540024
filter column	Bio-Rad	7326165	Freeze 'N Squeeze column
AFM	Bruker	Dimension FastScan
PEG8000	BBI	A100159
Mica	Ted Pella	BP50
triangular AFM probe in air	Bruker	FastScan-C
triangular AFM probe in fulid	Bruker	ScanAsyst-fluid+
DNA strands	Sangon