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요약

이 문서 T4 결 찰 및 어 닐 링 작은 원형 DNA 분자의 변성 페이지 정화에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 원형 타일, 조립 및 1d 및 2D DNA nanostructures agarose의 AFM 이미지의 기본 페이지 분석 젤 유한 DNA nanostructures의 전기 및 원심 분리 정화입니다.

초록

이 문서에서는 작은 원형 DNA 분자의 합성에 대 한 자세한 프로토콜 제공 원형 DNA 모티프와 1d 및 2D DNA nanostructures의 건설의 어 닐 링. 년간, DNA 나노기술의 급속 한 발전은 원본 자료로 선형 DNAs의 사용에 기인 합니다. 예를 들어 DAO (더블 크로스 오버, antiparallel, 이상한 반 회전) 타일은 2 차원 DNA 격자;의 건설을 위한 빌딩 블록으로 잘 알려진 DAO의 핵심 구조 오른손 할머니 매듭을 만드는 2 개의 로프 같은 두 선형 단일 가닥 (ss) oligonucleotides에서 이루어집니다. 여기, DNA 타일 cDAO (결합 된 DAO) 라는 새로운 유형의 c64nt 또는 c84nt의 작은 원형 ss DNA를 사용 하 여 작성 됩니다 (원형 64 나 84 뉴클레오티드) 비 계 물가와 여러 가지 선형 ss-DNAs 주식 가닥으로. 완벽 한 1d 및 2D nanostructures cDAO 타일에서 조립 된다: 무한 나노 와이어, nanospirals, 나노튜브, nanoribbons; 그리고 유한 나노-사각형입니다. 자세한 프로토콜 설명: 1) 준비 T4 리가와 작은 원형 oligonucleotides의 페이지 (polyacrylamide 젤 전기 이동 법)을 변성 시키기 의해 정화, 3) 조립 기본 페이지 분석, 다음 2) 안정적인 원형 타일의 어 닐 링 무한 한 1d 나노 와이어, nanorings, nanospirals, 나노튜브와 nanoribbons, 그리고 유한 2D 나노 사각형의 무한 한 2D 격자 AFM (원자 힘 현미경) 이미징 옵니다. 방법은 간단 하 고, 강력 하 고, 대부분의 실험실에 대 한 저렴 한입니다.

서문

DNA 분자 년간 nanostructures의 많은 종류를 만들려고 사용 되었습니다. 전형적인 주제 포함 대 (더블 크로스 오버, antiparallel, 심지어 반 돈다) 및 DAO 타일1,2,3, 스타 타일4,5,,67, 단일 (ss) 타일8,,910및 DNA 종이 접기11,,1213좌초. 이러한 DNA 모티프와 격자는 선형 ss DNAs에서 조립 된다. 최근에, 다른 사람 그리고 우리 모티프, 1 D 나노튜브 및 2D 격자14,15,,1617구축 건설 기계로 원형 ss oligonucleotides의 사용을 보고 있다. C64nt의 센터에서 할러데이 접합 (HJ)18,,1920,21 을 삽입 하 여 두 개의 결합 된 DAO 타일의 쌍 형성된17될 수 있습니다. 이 새로운 cDAO 모티프와 그 파생 상품 안정 되며 2D를 충분히 엄밀한 DNA 격자 3 × 5 µ m2. 이 문서 사용 하 여 안정적인 DNA 복잡 한 분자 하나 원형 비 계 및 다른 선형 스테이플 ss oligonucleotides의 생성으로 정의 된 "원형 타일"의 기간과 "선형 타일", 선형의 완전 한 세트에서 건설 되는의 다른 기간 ss oligonucleotides입니다.

이 프로토콜 건설 기계로 작은 원형 DNA 분자와 DNA nanostructures의 5 종류를 구성 하는 방법을 보여 줍니다: 1) 무한 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어, 2) 무한 한 2D cDAO-c64nt-O 및 cDAO-c64nt-E (-O 5 반 돈다 고-E의 홀수를 나타냅니다 4 반-회전의 짝수 나타냅니다) 격자, 3) 무한 2D cDAO-c84nt-O 및 cDAO-c84nt-E의 격자, 4) 유한 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O 및 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 사각형, 5) 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals ( 를 참조 하십시오 그림 3-5 회로도 도면 및 DNA nanostructures의 위의 5 종류의 이미지에 대 한). 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어는 각각 두 개의 선형 스테이플와 관련 된 각 c64nt 및 c84nt 비 계에서 조립 된다. CDAO-c64nt, acDAO c64nt, cDAO-c74nt, 또는 cDAO c84nt의 각 원형 타일은 각각 c64nt, c74nt, 또는 4 개의 선형 스테이플 c84nt는 해당 비 계에서 소 둔. 무한 한 2D 격자는 동일한 유형의 다른 시퀀스를 두 개의 원형 타일에서 조립 된다. 두 개의 유한 2D 사각형 격자는 각각 32 원형 보조 타일의 두 세트에서 조립 된다. 돈을 저축 하기 위해 단 하나의 시퀀스 c64nt, c74nt, 및 c84nt는 각각 발판으로 다른 돌출부 anneal 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt, 그리고 첫 번째 하위 타일 어 닐 링 단계에서 각각 20 cDAO-c84nt 원형 하위 타일 다음 하는 데 사용 됩니다. 해당 32 원형 하위 타일을 함께 혼합 하 고 두 번째 격자 유한 5 × 6 cDAO-c64nt-O 각각 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 격자, 조립 하는 단계를 어 닐 링을 적용. 그러나 확실히, 그것은 더 많은 돈과 노동력을 요할 것 이다 다르게 시퀀싱 원형 건설 기계 유한 크기 nanostructures의 다양 한 조립 채택 될 수 있습니다. 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals 4 반-회전의 짝수의 선형 연결 한 시퀀싱 비대칭 acDAO c64nt 타일에서 단련 됩니다. CDAO c64nt 및 cDAO-c84nt, 4, 5 반 회전의 홀수는 짝수의 intertile 거리 각각 구분 되는 원형 타일에서 무한 한 2D 격자를 두 가지 방법 있습니다. 전 동일; 정렬 모든 타일을 요구 한다. 후자는 헬리컬 축 따라 두 인접 타일의 얼굴의 교체가 필요합니다. 두 방법 모두 평면 nanoribbons; 생성 됩니다 타일 엄밀 하 고 평면 cDAO c64nt 같은 경우 타일 cDAO-c84nt, 4는 짝수의 intertile 연결 등 한 방향으로 곡선 경우 절반 회전 것 생성 하는 나노튜브, 반면 5는 홀수의 intertile 연결 반 회전의 제거 때문에 평면 nanoribbons를 생산할 예정 이다 곡률 바이어스 곡선된 타일의 대체 정렬에 의해 성장. 원형 타일에서 1d 및 2D DNA nanostructures의 성공적인 어셈블리 나타냅니다이 새로운 접근법의 몇 가지 장점: 안정성 및 선형 타일 위에 원형 타일, 비대칭 nanostructures의 어셈블리에 대 한 카이 랄 타일의 강성과 같은 적용 nanorings 및 nanoribbons, DNA 역학 및 분자 구조, 등등을 이해에 새로운 비전.

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프로토콜

1입니다. 원형 DNAs의 준비

  1. 더 정화 없이 직접 상업 회사에서 제공 하는 모든 선형 DNAs를 사용 합니다.
  2. DNA 샘플 튜브의 하단에 모든 DNA 알갱이 수집을 5 분 동안 5000 × g에서 원심 DNA를 분해 하 테 버퍼 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
  3. 260에 마이크로 UV 분석기를 사용 하 여 각 ss DNA 솔루션에 대 한 "a" ng / µ L의 농도 측정 nm. "B" µ M를 "a" ng / µ L를 변환 b 다음3 × 10 = (분자량의 DNA 가닥) /. 10 µ M DNA 재고 솔루션을 만들기 위해 테 솔루션의 양을 조정 합니다.
  4. T4 DNA 리가 사용 하 여 연결 하는 5'-phosphorylated 선형 DNA 템플릿 ( 그림 1) c64nt, c74nt 및 상업 회사에서 직접 제공 하는 c84nt의 3'와 5' 끝.
  5. 5'-phosphorylated 선형 DNA 가닥 (3.5 µ M)과 그 해당 부 목 DNA 가닥 (4.5 µ M) 200 µ L PCR 테스트 튜브15에서 80 µ L TE 버퍼에 혼합. 95 ° C 물이 가득한 열린 열 병에 튜브를 품 어. 실험실 분위기에서 약 2-3 시간 동안 실내 온도 (25 ° C) 뜨거운 물 식혀.
  6. 10 x T4 버퍼 (660 mM Tris HCl, 66 mM MgCl2, 100mm DTT, 1mm ATP)의 10 µ L을 추가 하 고 T4 리가 (300 U / µ L) 100 µ L의 최종 볼륨을 혼합물에의 10 µ L 16 ° c.에 16 시간 동안 한 thermocycler에 혼합물을 품 어
    참고: 위의 DNA 농도 반응 볼륨 ~ 100 µ L의 결 찰 높은 효율성과 올바른 올리고 단위체 cyclization의 높은 수익률에 대 한 최적화 됩니다. 실험 설계에 따라 동시에 결 찰 반응의 두 개 이상의 튜브를 실행 합니다. 결 찰 교체 단계 1.6에 대 한 대체 인큐베이션 절차는 25 ° c.에서 4 시간
  7. 부 화 후 5 minminutes 95 ° C 물에 T4 리가 비활성화. 얼음 물 목욕 튜브 전송 그리고 냉각 5 분 동안 품 어.
  8. 10 µ L의 Exonuclease 나 버퍼링 x 10과 Exonuclease의 10 µ L 추가 나 (5 U / µ L) 담금질된 혼합물에 및 선택적으로 나머지 선형 DNAs를 소화 하 고 circularized DNAs를 그대로 30 분 물 목욕에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
  9. 페이지 젤을 변성 시키기 10%를 준비 합니다.
    1. 증기 두건에서 페이지 젤을 준비할 때 고무 장갑 및 고글을 착용. 6.67 mL의 30% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (19:1), 10의 2 개 mL를 추가 x TAE· Mg 버퍼 (40 m m Tris, 40mm HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 m m Mg(Ac)2), 8.4 g의 요소 (7 M)와 이온된 물 40 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 최종 볼륨을.
      주의: 30% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (19:1) 솔루션은 독성.
    2. Tetramethylethylenediamine (TEMED)의 20 µ L을 추가 하 고 40 mL를 염화 persulfate (AP, 10 %w / v)의 100 µ L 튜브 전송 되기 전에 젤 솔루션 전기 시스템을 즉시. 1.5 m m 두께 10-잘 빗을 삽입 합니다. 젤 솔루션 경화 될 때까지 20 분 이상 기다립니다.
    3. 85 × 80 × 1.5 m m의 젤 80 V의 정 전압 설정3 (폭 × 높이 × 두께). 1 x TAE· 추가 전기 시스템 및 prerun 10 V/cm에서 20 분 동안 젤 Mg 버퍼입니다.
  10. 95에서 단계 1.8에서 PCR 테스트 튜브를 넣어 ° C 물 Exonuclease 비활성화를 5 분에 대 한 나. 그런 다음 얼음 물 목욕 튜브를 전송 하 고 또 다른 5 분 동안 품 어.
  11. 140 µ L의 최종 볼륨을 튜브에 formamide의 20 µ L을 추가 하 고 솔루션을 혼합. 잘 7-9 16-20 µ L 각 젤와 동등 하 게 변성 페이지 젤 웰 스에 솔루션을 배포 합니다. 염료 (0.05 %bromophenol 블루, 0.05% 자일 렌 cyanol FF, 60% 글리세롤, 10 mM Tris HCl, 60 m EDTA, pH 7.6 m)와 해당 전조 선형 DNA의 8 µ L 로드의 믹스 2 µ L (10 µ M) 참조에 대 한 별도 잘에 혼합물을 주입 하는 고.
    참고: formamide의 추가 페이지 젤 하단에 잘 침 몰을 위한 로드 솔루션의 밀도 증가 하 고 또한 일부 이중 연관을 해제 하려면 DNA 잔류물을 좌초.
  12. 10 V/cm에서 약 2 시간을 위한 젤을 실행 하 고 자일 렌 cyanol FF에서 맨 눈으로 유리 접시의 2/3 위치에 때 실행을 중지.
  13. 고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 유리 접시에서 젤을 가져가 라. 젤 형광 TLC (박막 크로마토그래피) 접시에 놓습니다. 면도날에 의해 대상 젤 밴드 차단으로 정확 하 게 UV 방사선 (그림 2)에 의해 숨겨진.
    주의: UV 빛은 눈과 피부에 유해 이다.
    참고: 254에서 UV 방사선에서 nm, DNA는 빛을 흡수 하 고 TLC 판에 그림자. 원형 DNA의 해당 전조 선형 DNA 보다 약간 느리게 달렸다. 그들은 수집 하는 경우 일부 소화 되지 않은 선형 DNAs 및 숨겨진된 대상 밴드를 둘러싸고 소량에 원치 않는 원형 DNAs 원형 DNA를 오염 됩니다.
  14. 2.0 mL microcentrifuge 튜브로 젤 밴드를 전송 합니다. 공기 건조 또는 타격 젤 밴드 건조 하 고 붙여넣기로 젤 주걱 또는 일반된 유리 막대에 의해 매 시. 젤은 완전히 짓 눌린 원형 DNA의 높은 수율에 중요 붙여넣기로 다는 것을 확인 하십시오. 튜브에 젤 이온된 볼륨 물의 두 번 추가 하 고 하룻밤 실 온에서 튜브를 흔들어.
  15. 2.0 mL microcentrifuge 튜브에서 supernatants 수집 혼합물을 필터링 합니다. 작은 양의 이온된 물과 supernatants는 결합 하 여 다시 필터와 rinsing 하 여 모든 잔여 DNA를 복구 합니다.
  16. Eluent을 n butanol의 동일한 볼륨의 압축을 풉니다. 이 절차를 반복 하 여 수성 볼륨 약 200 µ L로 감소 된다.
  17. 500 µ L 절대 에탄올 (−20 ° C)의 추가 20 µ L의 DNA 강수량에 대 한 혼합물에 3 M NaOAc (pH 5.1). 30 분 동안 −20 ° C에 튜브를 저장 합니다.
  18. 4 ° C에서 10 분 동안 12000 × g에서 튜브 원심, 삭제는 상쾌한. 나머지 DNA 침전 관에 약 100 µ L입니다.
  19. 튜브를 75% 에탄올 (−20 ° C)의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 −20 ° C에 저장. 다음 4 ° C에서 10 분 동안 12000 × g에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다. 나머지 DNA 침전은 다시 튜브에 약 100 µ L 솔루션입니다. 두 번 절차를 반복 합니다.
  20. 마지막 원심 분리 후 상쾌한 최대한 많이 삭제 합니다. 드라이 진공 집중으로 남아 있다.
  21. −20 ° c.에 튜브에 순화 된 원형 DNA를 저장
  22. 솔루션을 확인 하려면 10 µ M 원형 DNA 재고 단계 1.3 필요할 때에 따라 테 버퍼에서 원형 DNA를 resuspend.

2. 어셈블리 솔루션의 어 닐 링

  1. 한 냄비 어 닐 링에 대 한 각 타일 또는 nanostructural 어셈블리 솔루션 c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ c64nt, HJ-c84nt, 자 c84nt, cDAO-c64nt, acDAO c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt, 및 acDAO-c64nt-E의 선형 및 원형 DNAs의 설계 된 세트를 준비 합니다.
    1. 각 어셈블리 솔루션에 대 한 10의 2 µ L 믹스 x TAE· Mg 버퍼, 선형 및 원형 가닥 같은 어 금 니 비율 및 0.5 µ M와 20 µ L. 마지막 볼륨 각 가닥의 최종 농도에 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼에 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 1 µ L에서 어셈블리 솔루션 Anneal 한 95 ° C에서 25 ° c 이상 48 h 열 병.
  2. 2 단계 열 처리에 대 한 선형 및 원형 DNAs의 디자인 세트 cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E, 및 cDAO-c84nt-O의 2D 무한 격자의 각 어셈블리 솔루션을 준비 합니다.
    1. 10의 2 µ L를 혼합 하 여 각 전조 하위 타일 어셈블리 솔루션을 준비 x TAE· Mg 버퍼, 동등한 어 금 니 비율은, 선형 및 원형 가닥 및 각 물가 위한 0.5 µ M의 최종 농도 20 µ L의 최종 볼륨을 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 1 µ L. 첫 번째 하위 타일 어 닐 링 단계에서 95 ° C에서 25 ° c 이상 2.5 h 빠른 선형 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 각 전조 하위 타일 솔루션 anneal.
    2. 각 물가 위한 0.25 µ M의 최종 농도에 함께 두 해당 하위 타일 솔루션의 10 µ L를 혼합 하 여 위의 4 개의 무한 한 격자의 각 어셈블리 솔루션을 준비 합니다. 스텝 어 닐 링 하는 두 번째 격자에서 2 h 50 ° C에서 유지 하 고 20 ° C, 총에서 약 24 시간 5 분 당 0.1 ° C의 속도로 냉각의 느린 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 20 µ L 혼합물 anneal.
      참고: 두 개의 병렬 실험 실행할 수 있습니다 동시에 또는 연속적으로 각 2D 무한 격자에 대 한 두 번째 어 닐 링 단계에서.
  3. 2 단계 열 처리에 대 한 5 × 6 cDAO-c64nt-O 5 × 6 cDAO c74 & c84nt-O의 두 유한 사각형 어셈블리의 어셈블리 솔루션을 준비 합니다.
    1. 10의 1 µ L를 혼합 하 여 각 전조 하위 타일 어셈블리 솔루션을 준비 x TAE· Mg 버퍼, 동등한 어 금 니 비율은, 선형 및 원형 가닥 및 각 물가 위한 0.5 µ M의 최종 농도 10 µ L의 최종 볼륨을 200 µ L PCR 시험관에 추가 테 버퍼 집합의 각 DNA 재고 솔루션의 0.5 µ L. 첫 번째 어 닐 링 단계에서 95 ° C에서 25 ° c 이상 2.5 h 빠른 선형 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에서 각 전조 하위 타일 솔루션 anneal.
    2. 32 (각 하위 타일 솔루션의 2 µ L) x ~ 15의 최종 농도 200 µ L PCR 테스트 튜브에 함께 혼합 하 여 각 유한 사각형 격자 어셈블리 솔루션을 준비 각 하위 타일과 64 µ L의 최종 볼륨에 대 한 nM. 2 어 닐 링 단계에서 2 h 50 ° C에서 유지 하 고 총 24 시간 약 20 ° C, 5 분 당 0.1 ° C의 속도로 냉각의 느린 냉각 메서드를 사용 하 여 PCR thermocycler에 64 µ L 혼합물 anneal.
      참고: 5 병렬 실험 실행할 수 있습니다 동시에 또는 연속적으로 두 번째 어 닐 링 단계에서 각 유한 사각형 어셈블리에 대 한.

3. 기본 페이지 분석

  1. 10% 기본 페이지 준비 다음 단계 1.9 요소 구성 요소를 제외 하 고.
  2. C64bp 및 c84bp 컨트롤 샘플에 대 한 각 어셈블리 솔루션의 2 µ L와 별도로 염료 테 버퍼의 3 µ L 컨트롤로 로드의 1 µ L를 추가 합니다. 그림 3에 나열 된 다른 어셈블리의 각 각 어셈블리 솔루션의 1 µ L 및 염료 테 버퍼의 4 µ L 로드의 1 µ L를 추가 합니다.
  3. 젤을 위의 솔루션을 잘 주사. 참조에 대 한 별도 잘에 DNA 마커 (25-500 bp)의 5 µ L를 추가 합니다.
  4. 얼음 물 목욕에서 10 V/cm에서 약 4 시간 동안 젤을 실행 합니다. 크 실 렌 cyanol ff로 유리 접시 밖으로 실행 됩니다.
  5. 고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 유리 접시에서 젤 하 고 30 분 동안 핵 산 젤 얼룩의 10 µ L로 이온 물 100ml에 담가.
    주의: 핵 산 젤 얼룩 솔루션 독성이 있다.
  6. 자외선 이미징 시스템에서 젤을 관찰 하 고 얼룩진된 젤 (그림 3)의 사진의 찍을.

4입니다. 유한 격자의 정화

  1. 기본 2 %agarose 젤 전기 이동 법 정화 유한 격자의 준비.
    1. Agarose 분말, 10의 5 mL의 1 g 믹스 x TBE· Mg 버퍼 (89 m m Tris, 89 m m 붕, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 m m Mg(Ac)2), 핵 산의 2 µ L 얼룩 및 250 mL 삼각형 병에 이온된 수의 47.5 mL 젤. 작고 조밀한 거품 될 때까지 혼합물 삶아. 50 mL의 총 볼륨을 2 %agarose 농도 병에 온수를 추가 합니다.
    2. 두꺼운 장갑을 착용 한다. 1 c m3 (폭 × 길이 × 두께) x 10 x 7의 플라스틱 젤 상자에 젤 솔루션을 붓는 다. 1.5 m m 두께 12-잘 젤 빗을 삽입 합니다. 실내 온도에 냉각 젤을 기다립니다. 필요한 경우 4 ℃ 냉장고에 젤을 넣어.
      주의: 끓는 솔루션은 매우 뜨거운 때문에 알고 있어야 합니다.
    3. 0.5 x TBE· 추가 전기 시스템에 Mg 버퍼입니다. 5 V/cm 50 V의 정 전압에서 얼음 물 탕에서 20 분에 젤을 prerun.
    4. 각 agarose 젤에 2.3 단계에서 잘 준비 하는 유한 격자 솔루션의 20 µ L를 주사 하 고 잘는 별도의 DNA 마커 (100-3000 bp)의 5 µ L를 추가 합니다. 얼음 물 목욕에서 5 V/cm에서 2 h를 위한 젤을 실행 합니다.
    5. 고무 장갑과 피부 및 눈을 보호 하기 위해 고글을 착용. 컷 대상 젤 UV 빛 및 조각으로 조각 잘 고를 필터 열8로 짓 눌린된 젤 1000 bp 마커 비슷합니다 위치와 밴드입니다.
    6. 2000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 열을 원심 열을 통해 샘플 솔루션을 추출 합니다. AFM 화상 진 찰에 대 한 솔루션을 수집 합니다.
  2. 나무 못 강 수에 의해 유한 격자를 정화.
    1. 준비 단계에서 유한 격자 솔루션의 믹스 50 µ L를 동등한 양의 15 %PEG8000 (w/v)와 2.3 버퍼 (20 m m Mg(Ac)2, 5mm 트리 스, 1 mM EDTA와 505 mM NaCl)22. 30 분 동안 4 ° C에서 18000 × g 에서 솔루션 원심
    2. 제거는 상쾌한 고 못 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 원심 분리를 반복 합니다.
    3. 제거한 후에 상쾌한, 분해 1에서 펠 릿 x TAE· AFM 화상 진 찰에 대 한 Mg 버퍼입니다.
      참고: 정화는 5 × 6 cDAO-c64nt-O 및 5 × 6 cDAO c74 AFM 이미지와 다른 응용 프로그램에 대 한 c84nt-O 유한 격자 필요 합니다. 수익률이 너무 낮으면, 원심 분리 속도 증가. 제품 만큼 순수 하지 않으면 4.2.2 단계를 반복 합니다.

5. AFM 이미지

  1. C64nt 나노와이어, c84nt 나노와이어, acDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-E(O), 및 cDAO-c84nt-E(O), 무한 한 2D 격자 갓 쪼개진된 운 모 표면에 단련 된 샘플의 2 μ를 입금. 운 모 표면에 DNA 격자의 흡착에 대 일 분 동안 둡니다. 두 번의 이온된 수 100 µ L로 표면 세척 하 고 압축 공기에 의해 건조.
  2. 탭핑 모드 아래 삼각형 AFM 프로브 운 모 표면 스캔 하 여 공기의 무한 한 DNA 격자 들의 AFM 이미지를 얻을. 검색에 대 한 다음 매개 변수를 설정: 스캔 크기 0.5 ~ 5 µ m, 512 라인의 해상도 스캔 하 고 스캔 3.5 hz (그림 4).
  3. 5 × 6의 유한 DNA 격자 cDAO-c64nt-O와 5 × 6 cDAO c74 & c84nt-O 입금 1의 80 µ L x TAE· Mg 갓 쪼개진된 운 모 표면에 버퍼입니다. 다음 버퍼에 한정 된 샘플의 5 µ L를 추가 합니다. 운 모 표면에 DNA 격자의 흡착에 대 일 분 동안 둡니다. 1의 또 다른 50 µ L를 추가 x TAE· AFM 프로브에 Mg 버퍼입니다.
  4. 탭핑 모드 아래 삼각형 AFM 프로브 운 모 표면 스캔 하 여 액체에서 유한 DNA 격자의 AFM 이미지를 얻을. 검색에 대 한 다음 매개 변수를 설정: 스캔 크기 0.5-1 µ m, 256 라인의 해상도 스캔 하 고 스캔 1.5 hz (그림 5).

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결과

원형 DNA 젤 섬유23,,2425원형 DNA 내부 기 공에 침투 하기 때문에 페이지 (그림 2)을 변성 시키기 및 지진의 전조 선형 DNA 보다 약간 느리게 이동 합니다. 올리고 단위체 cyclization에 대 한 올바른 결 찰 반응 효율 기판 시퀀스 및 농도, 반응 온도, 시간, 등등에 따라 달라 집니다. ?...

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토론

작은 원형 DNA 분자의 합성 및 DNA nanostructures의 조립에이 기사 초점에 프로토콜. 무작위로 순서가 DNA 디자인의 대부분은이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 원형 DNAs의 순수성이 DNA 어셈블리의 성공을 위해 중요 합니다. 5'-phosphorylated 선형 DNA;의 농도 낮추는 방법으로 cyclization의 생산 수율을 향상 시킬 수 있습니다. 그러나,이 원형 DNAs의 동일한 금액을 생산 하기 위해 작업 부하를 증가 합니다. 부...

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공개

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

감사의 말

우리는 NSFC (보조금 번호 91753134 및 21571100), 그리고 국가 열쇠 실험실의 Bioelectronics의 동남 대학에서 재정 지원에 대 한 감사.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
T4 ligaseTaKaRa2011A
T4 bufferTaKaRa2011A
TE bufferSangonB548106
Thermo bottleThermosSK-3000
Thermo cyclerBio GenerGE4852T
Exonuclease ITaKaRa2650A
Exonuclease I bufferTaKaRa2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1)SangonB546016
TAE premix podwerSangonB540023
Mg(Ac)2·4H2ONanjing Chemical ReagentC0190550223
UreaSangonA510907
TEMEDBBIA100761
Ammonium PersulfateNanjing Chemical Reagent13041920295
Power supplyBeijing LiuyiDYY-8C
Water bathSumsungDK-S12
FormamideBBIA100314
DNA Marker (25~500 bp)SangonB600303
DNA Marker (100~3000 bp)SangonB500347
Loading bufferSangonB548313
PAGE electrophoresis systermBeijing Liuyi24DN
FilterASD5010-22250.22 µM
UV imaging SystemTanon2500R
n-butanolSangonA501800
Absolute EthanolSCR10009257
NaOAcNanjing Chemical Reagent12032610459
CentrifugeeppendorfCentrifuge 5424R
Vacuum concentratorCHRISTRVC 2-18
Ultraviolet spectrumAllshengNano-100
nucleic acid stainBiotium16G1010GelRed
AgaroseBiowestG-10
Agarose electrophoresis systermBeijing LiuyiDYCP-31CN
Heating PlateJiangsu JintanDB-1
TBE premix podwer SangonB540024
filter columnBio-Rad7326165Freeze 'N Squeeze column
AFMBrukerDimension FastScan
PEG8000BBIA100159
MicaTed PellaBP50
triangular AFM probe in airBrukerFastScan-C
triangular AFM probe in fulidBrukerScanAsyst-fluid+
DNA strandsSangon

참고문헌

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