早产儿和足月婴儿脐带源性间充质干细胞的分离与鉴定

摘要

人类脐带 (uc) 可以在围生期获得, 这是早产、足月和产后分娩的结果。在该协议中, 我们描述了在妊娠19-40周时从胎儿婴儿中分离和表征 uc 衍生的间充质干细胞 (uc-mscs) 的方法。

摘要

间充质干细胞具有相当大的治疗潜力, 在生物医学领域引起越来越大的兴趣。骨髓间充质干细胞最初是从骨髓 (bm) 中分离出来并具有特征的, 然后从包括脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓和胎儿附属物 (如胎盘、脐带血) 和脐带 (uc)) 在内的组织中获得。骨髓间充质干细胞是一种异质细胞群, 有能力 (1) 在标准培养条件下坚持塑料, (2) cd73⁺/cd90⁺/cd105 +/cd45-/cd34-/cd14^-/cd19 的表面标记表达^--hla-dr-表型, 和 (3) 三系分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞, 目前由国际细胞治疗学会 (isct) 定义.虽然 bm 是 msc 中应用最广泛的来源, 但 bm 吸入的侵入性在伦理上限制了其可访问性。bm 中获得的骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力普遍随着供体年龄的扩大而下降。相反, 从 uc 中获得的胎儿骨髓间充质干细胞具有旺盛增殖和分化能力等优点。u c 抽样不存在伦理问题, 因为它通常被视为医疗废物。人类 uc 开始发展与羊膜腔的持续增长在4-8 的怀孕, 并不断增长, 直到达到50-60 厘米的长度, 它可以在整个新生儿分娩期间被隔离。为了深入了解难治性疾病的病理生理学, 我们使用了不同胎龄婴儿的 uc 衍生骨髓间充质干细胞 (uc-mscs)。在该协议中, 我们描述了在妊娠19-40周时从胎儿婴儿中分离和表征 uc-mscs 的方法。

引言

间充质干细胞 (mscs) 最初是从骨髓 (bm)^1, 2 中分离和表征的, 但也可以从各种组织中获得, 包括脂肪组织、滑膜、皮肤、牙髓和胎儿附属物³. 骨髓间充质干细胞被认为是异质细胞群, 可以增殖并分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。此外, 骨髓间充质干细胞具有迁移到损伤部位、抑制和调节免疫反应、重塑和修复损伤的能力。目前, 不同来源的骨髓间充质干细胞作为细胞治疗的来源, 包括移植物抗宿主病、心肌梗死和脑梗死^{4, 5,}引起了越来越大的兴趣..

虽然 bm 是 msc 最有特色的来源, 但 bm 吸入的侵入性在伦理上限制了其可访问性。bm 中获得的骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力普遍随着供体年龄的扩大而下降。相反, 从胎盘、脐带血 (ucb) 和脐带 (uc) 等胎儿附属物中获得的胎儿骨髓间充质干细胞具有优势, 包括对取样的伦理关注较少, 以及对增殖和分化能力^{的鲁棒性 6,7}. 在通常作为医疗废物丢弃的胎儿附属物中, ucb 和 uc 被视为胎儿器官, 而胎盘被视为胎儿器官。此外, 需要在新生儿分娩的确切时刻对胎盘和 ucb 进行取样和收集, 而胎盘和 uc 则可以在新生儿分娩后收集和处理。因此, uc 是一个有前途的 msc 来源的细胞治疗 8^,9。

人类 uc 开始发展与羊膜腔在4-8 的妊娠, 继续增长, 直到50-60 厘米的长度, 并可以在整个新生儿分娩^期间隔离10。为了深入了解难治性疾病的病理生理学, 我们使用了不同妊娠年龄^{11岁、12岁}的婴儿的 uc 衍生骨髓间充质干细胞 (uc-mscs)。在该协议中, 我们描述了如何在妊娠19-40周时从胎儿婴儿中分离和表征 uc-mscs。

研究方案

这项研究的人体样本使用得到了神户大学医学研究生院伦理委员会的批准 (第1370号和第1694号批准), 并按照批准的准则进行。

1. uc-mscs 的分离和培养

请注意:已成功地从200多个受该协议影响的 uc-mscs 中分离、培养和扩展 (超过第4段)。在200多家用品中, 100% 的 uc-msc 隔离成功, 不到5% 的人出现意外污染, 不到15% 的人表现出生长抑制, 80% 以上的人显示 uc-msc 成功扩张。

1. 收集 uc。
   1. 准备一个50毫升塑料管, 一个无菌剪刀, 和一个500毫升瓶的阿尔法修改鹰的最低必要介质 (α-mL) 在4°c。
   2. 在大约5-10 厘米长的手术剪刀的情况下, 无菌地切割出 uc, 并在新生儿出生后通过剖腹产不久收集。
   3. 立即将 uc 放入50毫升塑料管中, 并在塑料管中加入 20-30 ml 的 alpha mL。
   4. 将 uc 存放在室温 (rt) 下, 直至送往实验室。
      请注意:无菌 uc 可在 rt 的无血清介质中储存长达2天。因此, 从邻近医院获得的 uc 如果在2天内送到实验室, 可以被收集。
2. 解剖 uc。
   1. 准备一个塑料托盘, 消毒剪刀和钳子, 10 毫升移液器, 25 毫升移液器, 两个60毫米组织培养盘, 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 纯化的酶混合物 (见材料表, 用无菌 pbs 重组在一个浓度储存在-80°c 时的 13个 wünsch unitsml, 以及一瓶500毫升的减少血清介质 (见材料表)。
   2. 将 pbs、纯化酶共混物、还原血清培养基和培养基 [α mem 含有10% 的胎牛血清 (fbs) 和1% 抗生素-抗真菌溶液 (aa) 储存在 4°c] 加热到 rt。
   3. 从管子里拿出 u c, 放在塑料托盘里。
   4. 用消毒剪刀称量5克的 uc。
   5. 在 uc 中倒出10毫升的乙醇, 用于使用10毫升的移液器进行灭菌。
   6. 用10毫升的移液器用10毫升的 pbs 清洗 uc 两次。
   7. 将 uc 放入经过消毒的60毫米组织培养盘中 (参见图 1, 步骤 1)。
   8. 在盘中加入10毫升的减少血清中的血清培养基。
   9. 加入0.5 毫升的纯化酶共混物, 最终浓度约为 0.62 wünsch units\ ml。
      请注意:采用纯化的酶共混物代替传统的胶原酶, 提高了 uc 分离出的 uc-mscs 的产量和生存能力。
   10. 用消毒剪刀和钳子将 uc 切割成2-3 毫米的碎片 (参见图 1, 步骤 2)。
       请注意:此过程大约需要30分钟。
   11. 在37°c 条件下, 在5% 的 co2 孵化器中孵育 uc 件 30分钟 。
   12. 将部分消化的 uc 件切割成更小的部件, 很容易流经25毫升的移液器。
       请注意:此过程大约需要30分钟。
   13. 在 5% co2 孵化器中, 在37°c 下孵育较小的 uc 件 15-45.
       请注意:孵化需要继续, 直到均质物变得粘稠。总消化时间约为120分钟。然而, 在使用早产儿的 u c 的情况下, 消化时间可以缩短, 因为这些可以很容易地切割和消化。
3. 隔离 uc-mscs。
   1. 准备四个50毫升塑料管和一个500毫升的培养基。
   2. 使用25毫升移液器将 uc 均质体划分为两个50毫升塑料管, 每个管约 7.5 ml。
   3. 在每管中加入20毫升培养基, 搅拌均匀。
   4. 通过放置在新的 50 ml 收集管顶部的100μm 单元过滤器, 使用 25 ml 移液器收集 uc 衍生的细胞, 从而过滤每个 uc 均质。
      请注意:这个过程每个大约需要 15分钟, 因为消化的 uc 解决方案是粘性的。
   5. 以 1, 000 x g 离心两管5分钟。
   6. 小心地吸气, 并丢弃它。
   7. 用5毫升培养基在两个管中重新填充细胞颗粒。
   8. 将细胞悬浮液转移到新的60毫米板中, 并在37°c 下在 5% co2 孵化器中培养 (参见图 1, 步骤 3).
4. 培养 uc-mscs。
   1. 将 pbs、色氨酸 edta (0.25 w%) 和培养基 (alpha mem 包含 10% fbs 和 1% aa) 加热到 rt。
   2. 当细胞连接到60毫米板上时, 取出培养基, 用5毫升的 pbs 清洗两次, 以清除碎片和红血球。
      请注意:连接的细胞通常出现在初始电镀后的 3-5天 (参见图 1, 步骤 4)。
   3. 每周更换两次培养基, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育至 90%至 100%-100% 融合。
      请注意:这通常需要7-14 的初始电镀后。
   4. 用5毫升的 pbs 清洗细胞两次, 加入 0.5 ml 的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育5-10。
   5. 当细胞变得圆形和分离时, 加入9毫升培养基, 很好地混合以灭活胰蛋白酶。
   6. 将细胞悬浮液转移到新的100毫米板中, 并在37°c 下在5% 的 co2 孵化器中培养 (参见图 1, 步骤 5)。
   7. 每周更换两次培养基, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育至 90%至 100%-100% 融合。
      请注意:这通常需要4-8 的初始电镀后。
   8. 用10毫升的 pbs 清洗细胞两次, 加入1毫升的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育5-10。
   9. 当细胞变得圆形和分离时, 加入9毫升培养基, 很好地混合以灭活胰蛋白酶。
   10. 将细胞悬浮液转移到两个新的100毫米板中, 并在37°c 下在 5% co2 孵化器中培养 (参见图 1, 步骤 5)。
   11. 重复亚文化 (1: 2 拆分) 直到第十段 (参见图 1, 步骤 5)。
       请注意:由于在较不融合条件下培养的细胞往往会达到较早的增殖抑制, 因此, 分裂比例为1:2 的通道细胞很重要。
   12. 使用第五至第八通道的细胞进行细胞表面标记分析、细胞分化分析和其他实验。
       请注意:为了尽可能长时间地保持旺盛的增殖, 细胞一般在 7 0%-8 0% 以上的融合条件下培养。

2. uc-mscs 的表面标记表达

1. 在100毫米的板中制备细胞, 并在37°c 下用1毫升的色氨酸 edta 分离5-10。
2. 加入9毫升培养基, 离心机以 1, 000 x 克的速度加入, 5分钟。
3. 吸收上清液并丢弃它。
4. 以 1, 000 x g 的速度将10毫升 pbs 和离心机的细胞颗粒重新弹回用, 每次 5分钟. 重复此清洗步骤。
5. 流式细胞仪 (fcm) 缓冲液 (pbs 含有 2 mm edta 和10% 阻断试剂) 在 ~ 1x10⁶细胞中排斥细胞。
6. 将50-100μl 的细胞悬浮液转移到 1.5 ml 管中;加入针对 cd14、cd19、cd34、cd45、cd73、cd90、cd105 或 hla-dr 的植物菊酯 (pe) 共轭抗体;在冰上孵育45分钟
7. 用 fcm 缓冲液清洗细胞两次, 并添加50-100μl 的0.2% 活力染料溶液 (见材料表)。
8. 在 rt 中提取 15分钟, 用 fcm 缓冲液清洗细胞两次, 并通过70μm 的滤网过滤器过滤细胞。
9. 通过 fcm 运行单元, 并根据制造商的说明使用 fcm 软件分析获得的结果。

3. uc-mscs 的三叶草分化

1. 进行发育。
   1. 在培养基中制备细胞悬浮液, 浓度为 5x10^{3 细胞}。
   2. 细胞悬浮液的片板1毫升在12井板中, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育 ~ 24小时。
   3. 将培养基替换为脂原分化培养基 (见材料表), 并在37°c 时在5% 的 co2 孵化器中孵育 2-3周。每周两次改变脂原分化培养基。
   4. 用 pbs 清洗细胞三次。
   5. 在 rt 中将4% 甲醛溶液中的细胞孵化30分钟。
   6. 用 pbs 清洗细胞三次, 用60% 异丙醇清洗细胞三次。
   7. 在100% 异丙醇的10毫升中溶解84毫克的油红色 o, 加入6.7 毫升的蒸馏水, 制备0.5% 的油红色 o 溶液。在 rt 中使用 1 ml 0.5% 油红色 o 溶液的染色细胞20分钟。
   8. 用60% 异丙醇清洗细胞三次, 并在显微镜下显示。
2. 进行成骨。
   1. 在培养基中制备细胞悬浮液, 浓度为 1x10⁴ cellsl。
   2. 细胞悬浮液的片板1毫升在12井板中, 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育 ~ 24小时。
   3. 用成骨分化培养基取代培养基 (见材料表), 在37°c 时在5% 的 co2 孵化器中孵育 1-2周 。每周两次改变成骨分化介质。
   4. 用 pbs 清洗细胞三次。
   5. 在 rt 中将4% 甲醛溶液中的细胞孵化30分钟。
   6. 用 pbs 清洗细胞三次。
   7. 用10毫升蒸馏水溶解200毫克的阿利素红色 s, 制备2% 的阿利沙林红色 s 溶液。在 rt 处用1毫升的2% 阿利沙林红色 s 溶液染色细胞3分钟。
   8. 用 pbs 清洗三次井, 并在显微镜下可视化。
3. 进行软骨病。
   1. 在培养基中制备细胞悬浮液, 浓度为 1.6x10^{7 细胞}。
   2. 将5μl 细胞悬浮液液滴放入12孔板 (微囊培养物) 的井心, 在37°c 的 5% co2 孵化器中孵育 2-3小时.
   3. 轻轻加入1毫升的软骨分化培养基 (见材料表), 在37°c 时在 5% co2 孵化器中孵育 4-7.每周两次改变软骨基因分化培养基。
   4. 用 pbs 清洗细胞三次。
   5. 在 rt 中将4% 甲醛溶液中的细胞孵化30分钟。
   6. 用 pbs 清洗细胞三次。
   7. 通过溶解250毫克的甲苯胺蓝与500毫升 0.1 m 醋酸钠缓冲液, ph 4.1, 制备0.05% 的甲苯胺蓝溶液。在 rt 处用1毫升0.05% 的甲苯胺蓝色溶液染色细胞30分钟。
   8. 用 pbs 清洗细胞三次, 并在显微镜下可视化。

结果

图 1总结了从 uc 集合到 msc 区域性的过程。大约5-10 厘米长的 uc 可以从所有新生儿剖宫产中收集。uc 开始发展在4-8 的妊娠, 并继续增长, 直到50-60 厘米的长度, 如图 2所示。uc 中有两条动脉 (a)、一条静脉 (v)、脐带衬里 (cl) 和沃顿果冻 (wj), 如图 3和图 4所示。uc-mscs 可以从所有电源线区?...

讨论

骨髓间充质干细胞可以从各种组织中分离出来, 并且是异质性的细胞群, 并不都表达相同的表型标记。在这里, 我们概述了一个协议, 指导从早产儿和足月婴儿的收集和解剖 uc, 并实现 pc-mscs 的隔离和培养。根据该协议, 我们成功地从妊娠19-40周的胎儿婴儿中分离出符合 isct 标准^的uc-msc, 并证明它们代表了难治性疾病病理生理学的某些方面在产前发展^{期间 11,}...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50mL plastic tube	AS One Coporation, Osaka, Japan	Violamo 1-3500-22
12-well plate	AGC Techno Glass, Tokyo, Japan	Iwaki 3815-012
60mm dish	AGC Techno Glass, Tokyo, Japan	Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Falcon 35-2350
Alpha MEM	Wako Pure Chemical, Osaka, Japan	135-15175
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	172012
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific, waltham, MA	OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA	Wako Pure Chemical, Osaka, Japan	209-16941
PBS	Takara BIO, Shiga,Japan	T900
Purified enzyme blends	Roche, Mannheim, Germany	Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	347497	Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	340364	Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555822	Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555483	Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	550257	Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555596	Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	560839	Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	347367	Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555749	Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555574	Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555743	Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent	Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan	Block Ace UKB80
FCM	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde	Polyscience, Warrigton, PA	16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	O0625
Arizarin Red S	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5533
Toluidine Blue	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	198161
Microscope	Keyence, Osaka, Japan	BZ-X700