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Resumo

Cordão umbilical humano (UC) podem ser obtido durante o período perinatal como resultado de pré-termo, termo e postterm entrega. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização de UC-derivado células-tronco mesenquimais (UC-MSCs) de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Resumo

Células-tronco mesenquimais (MSCs) têm considerável potencial terapêutico e atrair o interesse crescente no campo biomédico. MSCs são originalmente isolados caracteriza-se da medula óssea (BM), e adquiridos a partir de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais, tais como a placenta, sangue do cordão umbilical (UCB) e do cordão umbilical (UC). MSCs são uma população heterogênea de células com capacidade para (1) a adesão ao plástico em condições de cultura padrão, expressão do marcador (2) superfície de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenótipos de /HLA-DR– –e (3) trilineage diferenciação em adipócitos, condrócitos, como atualmente definidos pela sociedade internacional para terapia celular (ISCT) e osteócitos. Embora BM é a fonte mais amplamente utilizada de MSCs, a natureza invasiva da aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtidos a partir da UC tem vantagens tais como a capacidade de diferenciação e proliferação vigorosa. Não há nenhuma preocupação ética para amostragem de UC, como é normalmente considerado como lixo hospitalar. UC humana começa a desenvolver-se com o contínuo crescimento da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação e continua a crescer até atingir 50 a 60 cm de comprimento, e pode ser isolado durante o período de entrega todo recém-nascido. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização da UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Introdução

Células-tronco mesenquimais (MSCs) são originalmente isoladas e caracterizado da medula óssea (BM)1,2 , mas também pode ser obtidas de uma grande variedade de tecidos, incluindo o tecido adiposo, membrana sinovial, pele, polpa dental e apêndices fetais 3. MSCs são reconhecidos como uma população heterogênea de células que pode se proliferar e se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. Além disso, o MSCs possuem a capacidade de migrar para locais de ferimento, suprimir e modulam respostas imunes e remodelar e reparar a lesão. Atualmente, MSCs de diferentes fontes têm atraído interesse crescente como fonte de terapia celular contra uma série de doenças intratáveis, incluindo doença do enxerto - versus - hospedeiro, infarto do miocárdio e infarto cerebral4,5 .

Embora BM é a fonte mais bem caracterizada do MSCs, a invasão de aspiração BM eticamente limita sua acessibilidade. Capacidade de proliferação e diferenciação de MSCs obtidos de BM geralmente diminuem com a idade do doador. Em contraste, MSCs fetais obtido a partir de apêndices fetais, tais como a placenta, o sangue do cordão umbilical (UCB), e do cordão umbilical (UC) têm vantagens, incluindo preocupações menos éticas de amostragem e robusta de proliferação e diferenciação de capacidade6 , 7. entre fetais apêndices que geralmente são descartadas como resíduos hospitalares, UCB e UC são considerados um órgão fetal, enquanto a placenta é considerado síndrome. Além disso, placenta e UCB precisam ser amostrados e recolhidos no momento da entrega do recém-nascido, Considerando que a placenta e UC podem ser coletadas e processadas após a entrega do recém-nascido. Nesse sentido, UC é uma fonte promissora de MSC para celular terapia8,9.

UC humana começa a desenvolver com a progressiva expansão da cavidade amniótica com 4-8 semanas de gestação, continua a crescer até 50-60 cm de comprimento e pode ser isolado durante todo o prazo de entrega recém-nascido10. Para obter informações sobre a fisiopatologia das doenças intratáveis, usamos UC-derivado MSCs (UC-MSCs) de crianças entregadas às várias idades gestacional11,12. Neste protocolo, descrevemos como isolar e caracterizar UC-MSCs de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Protocolo

O uso de amostras humanas para este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética da Kobe University Graduate School of Medicine (SVGW 1370 e 1694) e conduzido de acordo com as diretrizes aprovadas.

1. isolamento e cultura de UC-MSCs

Nota: UC-MSCs foram isolados com sucesso, culta, e expandido (mais do que o número de passagem 4) de mais de 200 UCs sujeitos ao presente protocolo. Entre mais de 200 UCs, 100% mostraram bem sucedido isolamento UC-MSC, menos de 5% mostraram contaminação acidental, menos do que 15% mostraram a prisão de crescimento, e mais de 80% têm mostrado bem sucedida expansão UC-MSC.

  1. Recolha a UC.
    1. Preparar um tubo de plástico de 50 mL, uma tesoura asséptica e uma garrafa de 500 mL de alfa modificado mínimo essencial médio do águia (alfa MEM) a 4 ° C.
    2. Assepticamente cortado UC com uma tesoura cirúrgica aproximadamente 5-10 cm de comprimento e coletá-lo logo após o nascimento de recém-nascidos por cesárea.
    3. Imediatamente coloque a UC em um tubo de plástico de 50 mL e adicionar 20-30 mL de alfa MEM no tubo.
    4. Armazene a UC em temperatura ambiente (RT) até que ele é transportado para o laboratório.
      Nota: Asséptico UC pode ser armazenado em meio livre de soro no RT por até 2 dias. Portanto, a UC obtido de hospitais vizinhos pode ser coletado se é entregue ao laboratório dentro de 2 dias.
  2. Disse UC.
    1. Prepare uma bandeja plástica, esterilizado tesoura e pinça, pipetas de 10 mL, pipetas de 25 mL, dois pratos de cultura de tecidos de 60mm, tampão fosfato salino (PBS), enzima purificada combina (ver Tabela de materiais, reconstituído com PBS estéril em uma concentração de 13 Wünsch unidades/mL e armazenado a-80 ° C) e um frasco de 500 mL de meio de soro reduzida (ver Tabela de materiais).
    2. Aquecer a PBS, enzima purificada combina, reduzida média de soro e meio de cultura [alfa MEM contendo 10% fetal de soro bovino (FBS) e 1% solução antibiótico antimicótico (AA) armazenadas a 4 ° C] para RT
    3. Retire a UC do tubo e colocá-lo em uma bandeja plástica.
    4. Pesar e dissecar 5g de UC com uma tesoura esterilizada.
    5. Verta o UC para esterilização utilizando uma pipeta de 10 mL, 10 mL de etanol a 70%.
    6. Lave o UC com 10 mL de PBS duas vezes usando uma pipeta de 10 mL.
    7. Coloque o UC em um prato de cultura de tecidos esterilizados 60 mm (ver Figura 1, etapa 1).
    8. Adicione 10 mL de meio de soro reduzida no prato.
    9. Adicione 0,5 mL de misturas de enzima purificada para atingir uma concentração final de aproximadamente 0,62 Wünsch unidades/mL.
      Nota: A utilização de misturas de enzima purificada em vez de colagenase tradicional foi mostrada para melhorar o rendimento e a viabilidade da UC-MSCs isoladas de UC.
    10. Corte a UC em pedaços de 2-3 mm com tesoura esterilizada e pinça (consulte a Figura 1, passo 2).
      Nota: Este processo leva cerca de 30 min.
    11. Incube as peças UC a 37 ° C por 30 min em uma 5% CO2 incubadora.
    12. Corte os pedaços UC parcialmente digerido em pedaços menores que fluem facilmente através de uma pipeta de 25 mL.
      Nota: Este processo leva cerca de 30 min.
    13. Incube os pedaços menores de UC a 37 ° C por 15 a 45 min numa incubadora 5% CO2 .
      Nota: Incubação deve continuar até que o homogenates tornar-se viscoso. O tempo de digestão total é aproximadamente 120 min. No caso de usar o UCs de infantes prematuros, no entanto, o tempo de digestão pode ser encurtado porque aqueles são facilmente cortados e digeridos.
  3. Isole o UC-MSCs.
    1. Prepare-se quatro tubos de plástico de 50 mL e uma garrafa de 500 mL de meio de cultura.
    2. Divida o homogenate UC em dois tubos de plástico de 50 mL com uma pipeta de 25 mL, com cerca de 7,5 mL em cada tubo.
    3. Adicionar 20 mL de meio de cultura em cada tubo e misture bem.
    4. Filtre cada UC homogenate através de um filtro de célula de 100 µm colocado em cima de um novo tubo de coleção de 50 mL, usando uma pipeta de 25 mL para recolher pilhas UC-derivado.
      Nota: Este processo leva cerca de 15 min cada, como a solução UC digerida é pegajosa.
    5. Centrifuga os dois tubos a 1.000 x g por 5 min.
    6. Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante e descartá-lo.
    7. Resuspenda as pelotas de célula em dois tubos com 5 mL de meio de cultura.
    8. Transferir a suspensão de células em uma nova placa de 60 mm e cultura a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 (consulte a Figura 1, etapa 3).
  4. Cultura UC-MSCs.
    1. Aquecer a PBS, do trypsin-EDTA (0,25 w/v%) e meio de cultura (alfa MEM contendo 10% FBS e 1% AA) para RT
    2. Quando as células estão conectadas a uma placa de 60 mm, retire o meio de cultura e lavar com 5 mL de PBS duas vezes para remover detritos e células vermelhas do sangue.
      Nota: Células anexadas geralmente aparecem no 3-5 dias após o chapeamento inicial (consulte a Figura 1, etapa 4).
    3. Substituir o meio de cultura, duas vezes por semana e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 até confluência de 90-100%.
      Nota: Isso geralmente leva 7-14 dias após a inicial do chapeamento.
    4. Lavam-se duas células com 5 mL de PBS, adicionar 0,5 mL de EDTA-tripsina e incubar a 37 ° C, durante 5-10 min.
    5. Quando as células se tornam arredondadas e separada, adicione 9 mL do meio de cultura e misture bem para inactivar a tripsina.
    6. Transferir a suspensão de células em uma nova placa de 100mm e cultura a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 (consulte a Figura 1, passo 5).
    7. Substituir o meio de cultura, duas vezes por semana e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 até confluência de 90-100%.
      Nota: Isto normalmente leva 4-8 dias após a inicial do chapeamento.
    8. Lavam-se duas células com 10 mL de PBS, adicionar 1 mL de EDTA-tripsina e incubar a 37 ° C, durante 5-10 min.
    9. Quando as células se tornam arredondadas e separada, adicione 9 mL do meio de cultura e misture bem para inactivar a tripsina.
    10. Transferir a suspensão de células em duas novas placas de 100 mm e cultura a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 (consulte a Figura 1, passo 5).
    11. Repetem a subcultura (divisões de 1:2) até a décima passagem (ver Figura 1, passo 5).
      Nota: Porque as células cultivadas sob condições menos confluentes tendem a chegar a prisão de proliferação anterior, é importante para as células de passagem com uma razão de split de 1:2.
    12. Use células na passagem de quinta a oitava para análise de marcador de superfície celular, ensaio de diferenciação de células e outras experiências.
      Nota: Para manter a proliferação vigorosa por tanto tempo quanto possível, as células são geralmente cultivadas sob mais de 70-80% condições confluente.

2. superfície marcador expressão da UC-MSCs

  1. Preparar as células em uma placa de 100mm e dissociá-los com 1 mL de EDTA-tripsina a 37 ° C por 5-10 min.
  2. Adicione 9 mL do meio de cultura e centrifugar a 1.000 x g por 5 min.
  3. Aspirar o sobrenadante e descartá-lo.
  4. Resuspenda as pelotas de celular com 10 mL de PBS e centrifugar a 1.000 x g por 5 min. Repita este passo lavar duas vezes.
  5. Ressuspender as células com buffer de fluxo cytometry (FCM) (PBS contendo EDTA 2 mM e 10% bloqueio reagente) ~ 1 × 106 células/ml.
  6. Transferir 50-100 µ l de suspensão de células em um tubo de 1,5 mL; Adicionar ficoeritrina (PE)-conjugados com anticorpos contra CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 ou HLA-DR; e incubar no gelo por 45 min.
  7. Lavagem de células com FCM buffer duas vezes e adicionar 50-100 µ l da solução de tintura de viabilidade de 0,2% (ver Tabela de materiais).
  8. Incube a RT por 15 min, lavagem de células com buffer do FCM duas vezes e filtro células através de um filtro de célula de 70 µm.
  9. Executar as células através da FCM e analisar os resultados obtidos utilizando software FCM de acordo com as instruções do fabricante.

3. Trilineage diferenciação de UC-MSCs

  1. Execute adipogenesis.
    1. Prepare uma suspensão de células em meio de cultura em concentrações de 5 × 103 células/mL.
    2. 1 mL de suspensão de células em uma placa de 12 da placa e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para ~ 24 h.
    3. Substituir o meio de cultura com o meio de diferenciação de adipogenic (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por 2-3 semanas. Alterar o meio de diferenciação de adipogenic duas vezes por semana.
    4. Lave as células com PBS três vezes.
    5. Incubar as células em solução de formol 4% durante 30 min à RT
    6. Lave as células com PBS três vezes e com isopropanol 60% três vezes.
    7. Preparar 0,5% óleo vermelho O solução dissolvendo-se 84 mg de óleo O vermelho em 10 mL de isopropanol 100% e adição de 6,7 mL de água destilada. Mancha de células com 1 mL de solução de O óleo vermelho 0,5% em RT por 20 min.
    8. Lavar as células com isopropanol 60% três vezes e Visualizar em um microscópio.
  2. Execute a osteogênese.
    1. Prepare uma suspensão de células em meio de cultura em uma concentração de 1 × 104 células/mL.
    2. 1 mL de suspensão de células em uma placa de 12 da placa e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para ~ 24 h.
    3. Substituir o meio de cultura com o meio de diferenciação de osteogeneic (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 por 1-2 semanas. Alterar o meio de diferenciação osteogênica duas vezes por semana.
    4. Lave as células com PBS três vezes.
    5. Incubar as células em solução de formol 4% durante 30 min à RT
    6. Lave as células com PBS três vezes.
    7. Prepare 2% vermelho de alizarina S solução dissolvendo-se 200 mg de alizarina S vermelho com 10 mL de água destilada. Mancha de células com 1 mL de solução de S de vermelho de alizarina 2% em RT por 3 min.
    8. Lavar poços com PBS três vezes e Visualizar em um microscópio.
  3. Execute a condrogênese.
    1. Prepare uma suspensão de células em meio de cultura em uma concentração de 1,6 × 107 células/mL.
    2. Coloque uma gota de 5 µ l de suspensão de células do centro do poço em uma placa de 12 (micromass culturas) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para 2-3 h.
    3. Delicadamente, adicione 1 mL de meio de diferenciação de chondrogenic (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 4-7 dias. Alterar o meio de diferenciação de chondrogenic duas vezes por semana.
    4. Lave as células com PBS três vezes.
    5. Incubar as células em solução de formol 4% durante 30 min à RT
    6. Lave as células com PBS três vezes.
    7. Prepare a solução de azul de toluidina 0,05% dissolvendo-se 250 mg de azul de toluidina com 500 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M com pH 4.1. Mancha de células com 1 mL de solução de azul de toluidina 0,05% em RT por 30 min.
    8. Lavar as células com PBS três vezes e Visualizar em um microscópio.

Resultados

Os procedimentos de coleta de UC à cultura MSC são resumidos na Figura 1. UC de aproximadamente 5 a 10 cm de comprimento pode ser coletada de todos os recém-nascidos entregados por cesárea. UC começa a desenvolver-se em 4-8 semanas de gestação e continua a crescer até 50-60 cm de comprimento, como mostrado na Figura 2. Existem duas artérias (A), (V) de uma veia, forro de cabo (CL) e geleia de Wharton (WJ) em UC, conforme...

Discussão

MSCs podem ser isoladas em uma variedade de tecidos e são uma população heterogênea de células que fazer express não todos os marcadores fenotípicos mesmos. Aqui, nós esboçamos um protocolo que orienta a coleta e a dissecação da UC de infantes prematuros e de termo e permite o isolamento e cultura de UC-MSCs. Na sequência deste protocolo, isolamos com êxito o UC-MSCs que cumprir os critérios ISCT19 de fetos/recém-nascidos entregues às 19-40 semanas de gestação e demonstrou que el...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Grants-in-Aid para Scientific Research (C) (número de concessão: 25461644) e jovens cientistas (B) (conceder números: 15 19614 K, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
50mL plastic tubeAS One Coporation, Osaka, JapanViolamo 1-3500-22
12-well plateAGC Techno Glass, Tokyo, JapanIwaki 3815-012
60mm dishAGC Techno Glass, Tokyo, JapanIwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2350
Alpha MEMWako Pure Chemical, Osaka, Japan135-15175
Fetal bovine serumSigma Aldrich, St. Louis, MO172012
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientific, waltham, MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycoticThermo Fisher Scientific, Waltham, MA Gibco 15240-062
Trypsin-EDTAWako Pure Chemical, Osaka, Japan209-16941
PBSTakara BIO, Shiga,JapanT900
Purified enzyme blendsRoche, Mannheim, GermanyLiberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347497Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ340364Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555822Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555483Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ550257Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555596Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ560839Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DRBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347367Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotypeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555749Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotypeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555574Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotypeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555743Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dyeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJFixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagentDainippon Pharmaceutical, Osaka, JapanBlock Ace UKB80
FCMBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSAria  III Cell Sorter
FCM softwareBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSDiva
Adipogenic differentiation mediumInvitrogen, Carlsbad, CAStemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation mediumInvitrogen, Carlsbad, CAStemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CAStemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
FormaldehydePolyscience, Warrigton, PA16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red OSigma Aldrich, St. Louis, MOO0625
Arizarin Red SSigma Aldrich, St. Louis, MOA5533
Toluidine BlueSigma Aldrich, St. Louis, MO198161
MicroscopeKeyence, Osaka, JapanBZ-X700

Referências

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