Aislamiento y caracterización de humanas derivadas de cordón Umbilical las células madre mesenquimales de prematuros y recién nacidos a término

Resumen

Cordón umbilical humano (UC) puede obtenerse durante el período perinatal como consecuencia de la prematuro, término y entrega de postterm. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-derivados de células madre mesenquimales (MSCs-UC) de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial terapéutico considerable y atraen creciente interés en el campo biomédico. MSCs son originalmente aislados caracterizados de la médula (BM), y adquirió de tejidos incluyendo el tejido adiposo, membrana sinovial, piel, pulpa dental y apéndices fetales tales como placenta, sangre del cordón umbilical (UCB) y del cordón umbilical (Cu). MSCs son una población heterogénea de células con capacidad para (1) adherencia al plástico en condiciones de cultivo estándar, expresión de marcadores (2) superficie de CD73⁺/CD90⁺/CD105⁺/CD45 /CD34^––/CD14 /CD19^– Fenotipos de /HLA-DR^{– –}y (3) diferenciación del trilineage en adipocitos, osteocitos y condrocitos, tan definidos por la sociedad internacional de terapia celular (ISCT). Aunque el BM es la fuente más usada de MSCs, la naturaleza invasiva de aspiración BM éticamente limita su accesibilidad. Capacidad de proliferación y diferenciación de MSCs obtenidos del BM generalmente disminuir con la edad del donante. Por el contrario, MSCs fetales obtenidos de la UC tienen ventajas como la vigorosa proliferación y capacidad de diferenciación. No hay ninguna preocupación ética para el muestreo de la UC, como normalmente se considera como desechos médicos. UC humano comienza a desarrollarse con un continuo crecimiento de la cavidad amniótica en 4-8 semanas de gestación y sigue creciendo hasta llegar a 50-60 cm de longitud, y puede ser aislado durante el período de entrega de todo recién nacido. Para ganar la penetración en la patofisiología de enfermedades intratables, hemos utilizado deriva de UC MSCs (UC-MSCs) de los niños entregados diferentes edades gestacionales. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-MSCs de fetos/recién nacidos 19-40 semanas de gestación.

Introducción

Las células madre mesenquimales (MSCs) son originalmente aisladas y caracterizado de la médula (BM)^1,2 pero también puede obtenerse una gran variedad de tejidos incluyendo el tejido adiposo, membrana sinovial, piel, pulpa dental y apéndices fetales ³. MSCs son reconocidos como una población heterogénea de células que puede proliferar y diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos. Además, MSCs poseen la capacidad de migrar a sitios de lesión, inhiben y modulan la respuesta inmune y remodelar y reparar lesiones. En la actualidad, MSCs de diferentes fuentes han atraído un interés creciente como fuente para terapia celular contra un número de enfermedades intratables, como injerto - versus - host disease, infarto de miocardio, infarto cerebral^4,5 .

Aunque el BM es la fuente más bien caracterizada de MSCs, la invasividad de la aspiración de BM éticamente limita su accesibilidad. Capacidad de proliferación y diferenciación de MSCs obtenidos del BM generalmente disminuir con la edad del donante. En cambio, MSCs fetales obtienen de apéndices fetales tales como placenta, sangre del cordón umbilical (UCB), y del cordón umbilical (Cu) tienen ventajas como menos éticos preocupaciones con respecto a la toma de muestras y robusta la proliferación y diferenciación capacidad^{6 , 7}. entre los apéndices fetales que normalmente se desechan como residuos, UCB y UC se consideran un órgano fetal, mientras que la placenta se considera del fetomaternal. Además, placenta y UCB deben ser muestreados y recogidos en el momento exacto de la entrega del recién nacido, mientras que la placenta y UC pueden ser recogido y procesado después de la entrega del recién nacido. Por consiguiente, la UC es una fuente prometedora de MSC para celular terapia^8,9.

UC humano comienza a desarrollarse con la progresiva expansión de la cavidad amniótica en 4-8 semanas de gestación, crece hasta 50-60 cm de longitud y puede ser aislado durante todo el período de recién nacido entrega¹⁰. Para ganar la penetración en la patofisiología de enfermedades intratables, utilizamos derivados del UC MSCs (UC-MSCs) de los niños entregados diferentes edades gestacionales^11,12. En este protocolo, describimos cómo aislar y caracterizar MSCs UC de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.

Protocolo

El uso de muestras humanas para el presente estudio fue aprobado por el Comité de ética de Kobe posgrado escuela de medicina de la Universidad (homologación Nº 1370 y 1694) y realizado de conformidad con los lineamientos aprobados.

1. aislamiento y cultivo de UC-MSCs

Nota: UC-MSCs se han aislado con éxito, cultivadas, y ampliado (más número de paso 4) de más de 200 UCs sometidos a este protocolo. Entre más de 200 UCs, 100% han mostrado éxito aislamiento UC-MSC, menos del 5% han demostrado contaminación accidental, a menos de 15% presentan detención del crecimiento, y más del 80% han demostrado exitosa expansión de UC-MSC.

1. Recoger UC.
   1. Preparar un tubo de plástico de 50 mL, una tijera aséptico y una botella de 500 mL de alpha modificaron medio esencial mínimo de Eagle (alfa MEM) a 4 ° C.
   2. Asépticamente corte UC con una tijera quirúrgica en aproximadamente 5-10 cm de longitud y recoger poco después del nacimiento del recién nacido por cesárea.
   3. Inmediatamente Coloque la UC en un tubo de plástico de 50 mL y agregar 20-30 mL de alfa MEM en el tubo.
   4. Almacenar la UC a temperatura ambiente (RT) hasta que se transporta al laboratorio.
      Nota: UC aséptica puede almacenarse en medio libre de suero a temperatura ambiente hasta por 2 días. Por lo tanto, se puede recoger UC Obtenido de hospitales vecinos si es entregada al laboratorio dentro de 2 días.
2. Diseccionar el UC.
   1. Preparar una bandeja de plástico, esterilizar las tijeras y pinzas, pipetas de 10 mL, pipetas de 25 mL, dos platos de cultivo de tejidos de 60 mm, con tampón fosfato salino (PBS), mezcla de enzima purificada (véase Tabla de materiales, reconstituida con PBS estéril a una concentración de 13 Wünsch unidades/mL y se almacenó a-80 ° C) y una botella de 500 mL de medio con suero reducido (véase Tabla de materiales).
   2. Calentar el PBS, mezclas de enzima purificada, medio reducido suero y de la cultura media [alfa MEM con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% solución antibiótico-antimicótico (AA) almacenados a 4 ° C] a RT.
   3. Sacar de la UC desde el tubo y colóquelo en una bandeja de plástico.
   4. Pesan y diseccionar 5 g de la UC con una tijera esterilizada.
   5. Vierta 10 mL de etanol al 70% sobre la UC para la esterilización con una pipeta de 10 mL.
   6. Lave la UC con 10 mL de PBS dos veces con una pipeta de 10 mL.
   7. Coloque la UC en un plato de cultivo de tejidos esterilizados 60 mm (ver figura 1, paso 1).
   8. Añadir 10 mL de medio de suero reducido en el plato.
   9. Agregar 0,5 mL de enzima purificada mezclas para alcanzar una concentración final de aproximadamente 0.62 Wünsch unidades/mL.
      Nota: El uso de mezclas de enzima purificada en lugar de colagenasa tradicional se ha demostrado para mejorar el rendimiento y viabilidad de UC-MSCs aislada de UC.
   10. Trocear la UC 2-3 mm con tijeras esterilizadas y pinzas (ver figura 1, paso 2).
       Nota: Este proceso tarda unos 30 minutos.
   11. Incubar las piezas de la UC a 37 ° C durante 30 minutos en un incubador de 5% CO₂ .
   12. Cortar las piezas parcialmente digeridos de la UC en trozos más pequeños que fluyen fácilmente a través de una pipeta de 25 mL.
       Nota: Este proceso tarda unos 30 minutos.
   13. Incubar los pedazos más pequeños de la UC a 37 ° C durante 15-45 minutos en un incubador de 5% CO₂ .
       Nota: Incubación debe continuar hasta que los homogenados se vuelven viscosos. El tiempo de digestión total es aproximadamente de 120 min. En caso de utilizar UCs de prematuros, sin embargo, el tiempo de digestión puede ser acortado debido a los fáciles de cortar y digeridos.
3. Aislar el UC-MSCs.
   1. Preparar cuatro tubos de plástico de 50 mL y una botella de 500 mL de medio de cultivo.
   2. El homogeneizado de la UC se dividen en dos tubos de plástico de 50 mL con una pipeta de 25 mL, con aproximadamente 7,5 mL en cada tubo.
   3. Añadir 20 mL de medio de cultivo en cada tubo y mezclar bien.
   4. Filtrar cada homogenado UC 100 μm células colador colocado encima de un nuevo tubo de recogida de 50 mL, utilizando una pipeta de 25 mL para recoger las células derivadas de UC.
      Nota: Este proceso tarda unos 15 minutos cada uno, como la solución de comunicaciones unificadas digerida es pegajosa.
   5. Centrifugar dos tubos a 1.000 x g durante 5 minutos.
   6. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y deséchelo.
   7. Resuspender el pellet celular en dos tubos con 5 mL de medio de cultivo.
   8. Transferir la suspensión de células en una nueva placa de 60 mm y la cultura a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ (ver figura 1, paso 3).
4. Cultura UC-MSCs.
   1. Calentar el PBS, tripsina-EDTA (0.25 w/v%) y medio de la cultura (alfa MEM con 10% FBS y 1% AA) a RT.
   2. Cuando las células se unen a una placa de 60 mm, retire el medio de cultivo y lavado con 5 mL de PBS dos veces para eliminar los residuos y células de sangre rojas.
      Nota: Adjunto las células aparecen generalmente en 3-5 días después de la galjanoplastia inicial (ver figura 1, paso 4).
   3. Reemplazar el medio de cultivo dos veces por semana e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ hasta 90-100% de confluencia.
      Nota: Esto toma generalmente 7-14 días después de la galjanoplastia del inicial.
   4. Células de lavado con 5 mL de PBS dos veces, Añadir 0,5 mL de tripsina-EDTA e incuban a 37 ° C durante 5-10 minutos.
   5. Cuando las células se convierten en redondeados y separado, añadir 9 mL de medio de cultivo y mezclar bien para inactivar la tripsina.
   6. Transferir la suspensión de células en cultivo a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ y nueva placa de 100 mm (ver figura 1, paso 5).
   7. Reemplazar el medio de cultivo dos veces por semana e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ hasta 90-100% de confluencia.
      Nota: Esto toma generalmente 4-8 días después de la galjanoplastia del inicial.
   8. Lavar las células con 10 mL de PBS dos veces, añadir 1 mL de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C durante 5-10 minutos.
   9. Cuando las células se convierten en redondeados y separado, añadir 9 mL de medio de cultivo y mezclar bien para inactivar la tripsina.
   10. Transferir la suspensión de células en dos nuevas placas de 100 mm y la cultura a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ (ver figura 1, paso 5).
   11. Repetir subcultivo (1:2 divisiones) hasta el décimo paso (ver figura 1, paso 5).
       Nota: Porque las células cultivadas bajo condiciones menos confluentes tienden a llegar a la anterior detención de proliferación, es importante para las células de paso con relación split 1:2.
   12. Utilice las células en el paso de quinta a octava para análisis superficial del marcador de la célula, análisis de la diferenciación de la célula y otros experimentos.
       Nota: Para mantener la proliferación vigorosa durante el tiempo que sea posible, las células se cultivan generalmente en más de 70-80% condiciones confluente.

2. marcador superficial expresión de UC-MSCs

1. Preparar las células en una placa de 100 mm y disociar con 1 mL de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5-10 minutos.
2. Añadir 9 mL de medio de cultivo y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos.
3. Aspirar el sobrenadante y deséchelo.
4. Resuspender el pellet celular con 10 mL de PBS y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos repetir este lavado dos veces.
5. Resuspender las células con buffer de flujo cytometry (FCM) (PBS conteniendo EDTA 2 mM y 10% bloqueo reactivo) ~ 1 × 10⁶ células/ml.
6. Transferencia de 50-100 μl de la suspensión celular en un tubo de 1.5 mL; Añadir ficoeritrina (PE)-conjugado anticuerpos contra CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 y HLA-DR; e incubar en hielo durante 45 minutos.
7. Células de lavado con FCM búfer doble y añadir 50-100 μl de solución de tinte de viabilidad de 0.2% (véase Tabla de materiales).
8. Incubar a RT durante 15 min, células de lavado con tampón de FCM dos veces y células filtrantes a través de un tamiz celular de 70 μm.
9. Recorren las células de la FCM y analizar los resultados obtenidos utilizando el software de la FCM según las instrucciones del fabricante.

3. Trilineage diferenciación de MSCs UC

1. Realizar la adipogénesis.
   1. Preparar una suspensión celular en medio de cultivo a una concentración de 5 x 10³ células/mL.
   2. 1 mL de la suspensión celular en una placa de 12 pozos de la placa e incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO₂ ~ 24 h.
   3. Reemplazar el medio de cultivo con medio de diferenciación adipogenic (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ para 2-3 semanas. Cambiar el medio de diferenciación de adipogenic dos veces a la semana.
   4. Lavar las células con PBS tres veces.
   5. Incubar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a TA.
   6. Lavar las células con PBS tres veces y con isopropanol 60% tres veces.
   7. Preparar una solución de 0,5% aceite rojo O disolviendo 84 mg de aceite O rojo en 10 mL de isopropanol al 100% y la adición de 6,7 mL de agua destilada. Se tiñen las células con 1 mL de solución 0,5% aceite rojo O a temperatura ambiente durante 20 minutos.
   8. Lavar las células con isopropanol 60% tres veces y visualizar al microscopio.
2. Realizar la osteogénesis.
   1. Preparar una suspensión celular en medio de cultivo a una concentración de 1 × 10⁴ células/mL.
   2. 1 mL de la suspensión celular en una placa de 12 pozos de la placa e incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO₂ ~ 24 h.
   3. Reemplazar el medio de cultivo con medio de diferenciación de osteogeneic (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ 1-2 semanas. Cambiar el medio de la diferenciación osteogénica dos veces a la semana.
   4. Lavar las células con PBS tres veces.
   5. Incubar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a TA.
   6. Lavar las células con PBS tres veces.
   7. Preparar 2% rojo de alizarina S solución disolviendo 200 mg de alizarina roja S con 10 mL de agua destilada. Se tiñen las células con 1 mL de solución 2% rojo de alizarina S a temperatura ambiente durante 3 minutos.
   8. Lavar los pocillos con PBS 3 veces y visualizar al microscopio.
3. Realizar la condrogénesis.
   1. Preparar una suspensión celular en medio de cultivo a una concentración de 1,6 × 10⁷ células/mL.
   2. Coloque una gota de 5 μl de la suspensión celular en el centro del pozo de una placa de 12 pozos (micromass culturas) e incubar a 37 ° C en un incubador 5% CO₂ para 2-3 h.
   3. Agregar cuidadosamente 1 mL de medio de diferenciación condrogénica (véase Tabla de materiales) e incubar a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ 4-7 días. Cambio medio de diferenciación condrogénica dos veces a la semana.
   4. Lavar las células con PBS tres veces.
   5. Incubar las células en una solución de formaldehído 4% durante 30 min a TA.
   6. Lavar las células con PBS tres veces.
   7. Preparar la solución de azul de toluidina 0,05% disolviendo 250 mg de azul de toluidina con 500 mL de tampón de acetato de sodio de 0.1 M a pH 4.1. Se tiñen las células con 1 mL de solución de azul de toluidina 0,05% a temperatura ambiente durante 30 minutos.
   8. Lavar las células con PBS tres veces y visualizar al microscopio.

Resultados

Los procedimientos de colección de la UC a la cultura MSC se resumen en la figura 1. UC de aproximadamente 5-10 cm de longitud se puede recoger en todos los recién nacidos por cesárea. UC comienza a desarrollarse en 4-8 semanas de gestación y continúa creciendo hasta 50-60 cm de longitud, como se muestra en la figura 2. Hay dos arterias (A), una vena (V), forro de cable (CL) y jalea (WJ de Wharton) en UC, como se muestra en ...

Discusión

MSCs pueden aislarse de una variedad de tejidos y son una población heterogénea de células que express no todos los mismos marcadores fenotípicos. Aquí delineamos un protocolo que guía la recolección y disección de la UC de neonatos prematuros y de término y permite el aislamiento y la cultura de la UC-MSCs. Siguiendo este protocolo, hemos aislado con éxito UC-MSCs que cumplan con los criterios ISCT¹⁹ de fetos/bebés entregados en 19-40 semanas de gestación y demostrado que representan ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50mL plastic tube	AS One Coporation, Osaka, Japan	Violamo 1-3500-22
12-well plate	AGC Techno Glass, Tokyo, Japan	Iwaki 3815-012
60mm dish	AGC Techno Glass, Tokyo, Japan	Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Falcon 35-2350
Alpha MEM	Wako Pure Chemical, Osaka, Japan	135-15175
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	172012
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific, waltham, MA	OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA	Wako Pure Chemical, Osaka, Japan	209-16941
PBS	Takara BIO, Shiga,Japan	T900
Purified enzyme blends	Roche, Mannheim, Germany	Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	347497	Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	340364	Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555822	Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555483	Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	550257	Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555596	Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	560839	Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	347367	Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555749	Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555574	Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555743	Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent	Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan	Block Ace UKB80
FCM	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde	Polyscience, Warrigton, PA	16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	O0625
Arizarin Red S	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5533
Toluidine Blue	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	198161
Microscope	Keyence, Osaka, Japan	BZ-X700