用原生动物给鱼作动物感染的载体

摘要

斑马鱼 (dadio rerio)正在成为一种广泛使用的脊椎动物动物模型, 用于微生物定植和发病机制。该协议描述了原生动物帕拉米库姆作为一种载体, 在斑马鱼幼虫的食物传播感染的使用。尾状物容易将细菌内化, 并通过自然捕食行为被幼虫斑马鱼占据。

摘要

斑马鱼 (dadio rerio)由于其透明度、遗传可追踪性和易于维护, 已成为广泛使用的传染病脊椎动物模型。幼虫斑马鱼自然捕食单细胞原生动物的动物尾状花序。该协议描述了使用p. 尾鱼作为一种载体, 在幼虫斑马鱼的食物传播感染。马尾烧内化了多种细菌, 细菌细胞在几个小时内保持活力。斑马鱼然后以尾鱼为食, 细菌负荷在车的消化时释放, 细菌在肠道中繁殖。该协议包括对副虫的维持、细菌的负荷、细菌降解和剂量的测定以及用副虫喂养感染斑马鱼的详细说明。使用这种食源性感染方法的好处是, 它密切模仿在人类疾病中观察到的感染模式, 与浸没协议相比, 导致更强大的定植, 并允许研究各种病原体。斑马鱼模型中的食源性感染可用于调查宿主内细菌基因表达、宿主-病原体相互作用以及致病性特征, 包括细菌负担、定位、传播和发病。

引言

斑马鱼与哺乳动物在形态和功能上保守的特征, 包括粒细胞谱系 (如中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞样细胞、棒状受体、促炎症细胞因子和抗菌肽¹.斑马鱼的肠道在受精后6天充分发育, 并与哺乳动物胃肠道表现出形态和功能的保护, 如肠道上皮细胞的保守转录调节². 这使得斑马鱼成为肠道微生物定植和发病机制的良好模式。在斑马鱼模型中研究了广泛的肠内微生物, 包括肠出血性大肠杆菌³、霍乱弧菌4, 5、肠炎沙门氏菌⁶、斑马鱼^{微生物群 7,8}, 和益生菌在肠道免疫中的作用⁹。斑马鱼模型的一个明显优势是, 它被许多微生物殖民, 而不会破坏内源微生物群, 这使得在混合微生物种群3的情况下可以调查微生物的行为^{3, 6}. 目前, 大多数斑马鱼胃肠定植和疾病模型依靠浴浸泡对微生物的管理, 斑马鱼在细菌悬浮液中孵育一段时间¹⁰。然而, 这使得很难确定所给的细菌的确切剂量, 并导致对一些微生物的有限殖民, 特别是非致病性细菌。或者, 细菌悬浮液^是通过口服灌胃11给鱼服用的, 但这在技术上具有挑战性, 仅限于年龄较大的幼虫和成年鱼类。

该协议描述了使用单细胞原生动物帕拉米库姆作为一种载体, 在食物传播的微生物传递到斑马鱼幼虫的胃肠道。帕拉米西亚易于维护和廉价, 能够以各种微生物为食, 包括藻类、真菌和细菌, 它们通过纤毛的口腔槽^12,13, 14 内化。一旦内化, 细菌就会被控制在液泡中, 最终会酸化, 内容物在几个^{小时 1 5小时}的时间内降解。幼虫斑马鱼在孵化后不久就捕获了作为天然猎物的寄生虫, 根据温度¹⁶的不同, 大约在 3-4 dpf 左右, 并以高效率的方式将其吸收。捕获猎物的过程平均需要1.2 秒, 从检测到^{捕获 17}, 捕获的寄生虫很快就会被消化在斑马鱼的边缘, 从而使内化的细菌被释放到肠道 3.因此, 可以作为一种快速、简单的方法, 将高、一致的细菌剂量输送到斑马鱼的胃肠道。所传递的细菌可以转化为表达荧光蛋白, 如这里所述的 mcherry, 或者, 在基因难解的细菌的情况下, 它们可以用荧光染料进行预染色, 以便在胃肠道。

该协议描述了肠致病性大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌(ehec) 和粘附侵入性大肠杆菌 (aiec]) 和伤寒沙门氏菌的食物传递。致病性大肠杆菌和伤寒杆菌都是通过粪便-口腔通道^18、19传播的, 并且可以通过受污染的食物 (如肉类、蔬菜和乳制品) 获得。以刺核为载体,大肠杆菌和伤寒幼虫在与车共同孵化30-60分钟内成功定虫。所获得的细菌负荷足够坚固, 可以直观地显示定植, 并通过电镀组织同质化来确定其负荷。

研究方案

这里描述的斑马鱼护理、繁殖和实验符合《实验动物护理和使用指南》, 并已获得德克萨斯大学健康科学中心动物机构福利委员会的批准, 议定书编号 awc-16-0127。

1.参数的生长和维持

1. 从斑马鱼国际资源中心 (zirc) 等来源获得活的寄生虫培养物。
2. 从一个活的不断增长的文化, 加入1毫升的准麦子培养, 1 毫升的大肠杆菌mg1655 培养 (光学密度 od_600-2.0 ) 重新悬浮在 1x e3 (0.29 g/l 氯化钠, 13 mg/l kcl, 44 mg/cl cl, 81 mglmgsso₄, 0.48 gl hepes, ph 7.0, 无菌), 和8毫升的 1x e3 成10毫升的组织培养瓶。轻轻旋转, 然后存放在22°c。
3. 为了保持培养, 每两周将副虫培养的1毫升放入10毫升的组织培养瓶中, 其中含有9毫升的新鲜 1x e3 培养基, 其中含有 10 8 8 cmu/pe mg1655, 悬浮在 1x e3 中.

2. 斑马鱼的细菌剂量测定

1. 测定对那类细菌的半衰期
   请注意:如下文所述, 从中回收的可行大肠杆菌是通过电镀可行的大肠杆菌来确定的。
   1. 在22°c 时, 细菌 (od₆₀₀合 1.0) 与对角虫孵育2小时后, 将对位菌和细菌共培养结合成一个50毫升的锥形管, 用 1x e3 清洗准虫, 并计算每毫升的准分子数 (如下步骤所述)3.2.7 和 3.2.8)。
   2. 在计算了寄生虫的数量后, 每小时 (暴露后 6小时) 取出50μl 的副虫和细菌共培养, 并将每个样本添加到一个新鲜的 1.5 ml 管中。
   3. 将1050μl 的1% 非离子表面活性剂 (见材料表) 放入磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 溶液中的每个 1.5 ml 管和涡旋中, 为1分钟裂解对副大海素的裂解。使用无菌 pbs 作为稀释剂 (即100μl 在900μl 中) 对每个样品进行 1:10 稀释。
   4. 板材100μl 的每一次稀释在选择性板材上 (lb tet 介质: 1 gl 色氨酸、0.5 g/L l 酵母提取物、1 g/l ncl、30μgml 四环素), 在37°c 孵育16小时。第二天, 只计算孤立和独特的单个菌落, 计算和记录盘子上的细菌菌落数量 (菌落形成单位, cfu)。识别具有稀释的板, 该稀释剂为 30–300 cfu。
   5. 确定使用的稀释系数。例如, 如果将细菌培养的1:100 与99毫升的无菌 pbs 混合, 这是 1:100 (0.01) 稀释。这个数字将是稀释中的 cfu 的数量。对每个时间点执行以下计算, 以确定原始示例中的 cfu:
      
   6. 使用步骤计算的副虫浓度3.3.1 计算和绘制与接触后时数相对应的可行大肠杆菌/副虫的数量, 并确定准应体内的半衰期 (图 1)。
   7. 使用为每个时间点计算的 cfu 数, 使用步骤3.3.1 计算的副征浓度, 计算和绘制 y 轴上每个副磷脂的可行大肠杆菌数与 x 轴孵育后的时间数。确定在准应体内的半衰期。
2. 从细菌半衰期和捕食率中确定细菌剂量。
   请注意:为了确定细菌的剂量, 必须考虑到对内细菌的半衰期和斑马鱼在上的捕食率 (见步骤 3.4)。
   1. 使用以下公式来确定寄生虫体内的细菌衰变:
      (2)
      如果 n₀是2小时孵育后每个准钙的初始细菌数量, 而 nt 是一个经过一段时间后的剩余数量, 是一个活细菌数量减半的时间, k 是衰变常数。
   2. 从降解实验中, 使用细菌半衰期确定衰变常数 k (即, 在这段时间之后, 可行的细菌/的数量减少了一半)。
      (3)
      对于半衰期的确定, 术语和
      (3) 或
      (2)
      请注意:根据图 1,大肠杆菌在副母细胞中的半衰期约为 2.3 h。因此, 使用公式 (4), 大肠杆菌的衰减率, k是:
      (3)
   3. 确定半衰期实验的衰变率 (k), 以找到斑马鱼幼虫在捕食时间 (t) 后所采取的活细菌 (nt) 的剂量, 其中 (p) 是每小时一条鱼吃的捕食率或食证数量:
      (6) 或
      (4)
      请注意:根据图 1, 2小时孵育 (t) 后每对位菌 (n₀) 的初始细菌数量为 790 cfu。根据电影 1和图 2, 捕食率 (p) 是1539。
   4. 使用这些值替代方程 (7), 计算斑马鱼在2小时孵育后消耗的细菌剂量如下:
      (6)

3. 斑马鱼的食源性感染

1. 用帕拉米西亚培养细菌。
   1. 在感染前一晚准备对副虫和大肠杆菌mg1655 的共同培养。结合8毫升的 e3 培养基, 1 毫升的正在进行的副虫培养, 1 毫升的大肠杆菌mg1655 培养物 (od₆₀₀ = 1.0) 重新悬浮在 1x e3 在 t25 组织培养瓶。在室温 (rt) 下隔夜生瓶。对于每个治疗条件, 准备两个副马鞭刑瓶。
   2. 接种细菌生长介质 (lb:1 gl 色氨酸, 0.5 gl 酵母提取物, 1 g/l ncl) 与传染性菌株的细菌, 通过从一个板使用无菌接种循环选择一个单独的细菌菌落。在37°c 下培养液体, 并以每分钟 110次 (rpm) 过夜的速度保持晃动。
      请注意:应佩戴个人防护设备 (实验室外套和手套), 并在处理传染剂时使用生物安全二级设施。
   3. 第二天, 测量隔夜文化的 od_600. 计算在11毫升介质中重新悬浮时实现 od 600 的培养所需的培养量。
   4. 通过离心 5分钟3.1.2 的离心, 收获细菌的体积, 每瓶 1 块。丢弃上清液, 在 e3 培养基1毫升中重新悬浮细菌颗粒。
   5. 或者, 用荧光染料预先染色细菌。
      1. 添加1μl 的 fm 4-64FX 细菌染色 (5 mg/ml 库存解决方案)。盖上铝箔, 以防止光漂白, 并在 rt 孵育旋转端端端15分钟。
      2. 用 1x e3:6, 000 x g离心剂去除多余的染料, 每次1.5 分钟, 然后在 e3 介质的1毫升中重新悬浮颗粒。重复清洗步骤两次。
      3. 以 6, 000 x克的离心速度收集染色细菌, 5分钟. 去除上清液, 并在 e3 培养基的1毫升中重新悬浮细菌颗粒。
   6. 在新鲜副虫的两个瓶中加入1毫升的细菌悬浮液。在 rt 孵化2小时。
      请注意:如果使用染色细菌, 在 rt 黑暗中孵育2小时。
2. 洗菌/寄生虫共培养。
   1. 将两瓶的副虫菌种共培养成50毫升锥形管。在15°c 条件下以 300 x g离心样品 10分钟. 确保离心机在此步骤之前进行预冷。
   2. 使用血清学移液器去除约10毫升的 e3 上清液, 并在锥形管中加入约10毫升的新鲜 1x e3。
      请注意:在所有的清洗步骤中, 在取出上清液时必须非常快, 因为副虫会开始从颗粒中游出来。一次旋转并从一个管中取出上清液, 以确保在这一步中足够快的处理, 并避免上清液中的副虫丢失。
   3. 在 15°c 下通过 300 x 克离心旋转样品 5分钟, 使用血清学移液器取出约10毫升的 e3 上清液, 并在锥形管中加入约10毫升的新鲜 1x e3。重复此步骤两次。
   4. 在15°c 下以 300 x g离心样品 5分钟, 取出约10毫升的 e3 上清液, 注意不要破坏颗粒。
   5. 将颗粒重新注入剩余的10毫升 e3 介质中, 并将悬浮液的500μl 转移到新的 1.5 ml 微离心管中。通过在 300 x g离心5分钟以计算出寄生虫数的速度, 将500μl 的副虫颗粒状。
   6. 从500μl 样品中取出 e3 上清液400μl。将36.5% 甲醛溶液加入 20μl, 然后轻轻再悬浮, 在22°c 孵育5分钟。
      请注意:此步骤杀死参数, 以便进行计数。
   7. 使用移液器和记录测量实际总体积。用0.4% 的色氨酸蓝色溶液稀释副虫悬浮液 1: 1 v。
   8. 使用细胞计数器或血细胞仪来计算死亡的参数。
      请注意:由于之前的固定步骤, 大多数准应将在这一点上死亡, 但这个数字反映了共同孵化实验的活的准应的数量。作者没有发现细菌共同孵化导致的明显副性死亡, 因此这可以被忽略为一个因素。
3. 共孵育和斑马鱼幼虫。
   1. 计算副那卵的浓度:
      
      
      请注意:计算出了从阶跃3.2.5 到50毫升锥形管中的副性。
   2. 计算在 e3 的最终体积为3毫升的最终体积中浓度为 2 x 10 5 的 parcecil 所需的洗涤的的体积。
      请注意:对位基因的浓度可以根据所需的细菌剂量进行调整, 这需要优化。
   3. 通过在 100 mm tris ph 8.0 中加入旋塞因, 将10头斑马鱼转移到6井板的每口井中, 将含有适当浓度的鱼的新鲜 e3 总体积为3毫升 (按步骤计算), 从而对斑马鱼进行麻醉3.3.2). 确保以最少的液体转移幼虫, 以确保它们从接受者的麻醉中恢复。
   4. 在日光条件下, 在30°c 下在白天孵化器中孵育 2小时, 以确保最佳的捕食雷电条件。
   5. 将含有3毫升新鲜 e3 的新井中, 每次含有 100 mg ticaine, 将斑马鱼至少清洗5次。
      请注意:在清洗过程中, 不要试图省略毛滴虫。在没有麻醉的情况下转移移动幼虫会增加对动物造成伤害和痛苦的风险。
   6. (可选) 将斑马鱼嵌入3毫升的 1% 低熔体琼脂在黑墙6井板中进行成像: 低熔融琼脂糖在1xe3 中制成, 并在微波中加热。一旦熔融, 将毛滴原添加到 160 mg/ml 的最终浓度中。将鱼放置在立体显微镜下, 使用剪下的凝胶加载尖端, 确保头部在左侧, 尾巴在右侧 (图 3)。等待 5分钟, 使琼脂糖设置, 然后覆盖嵌入的鱼与 1x e3 含有 160 mgmml 旋塞因成像。
4. 确定捕食率。
   请注意:不需要设置单独的实验来确定捕食率。相反, 这可以在步骤3.3.4 中完成, 如下所述。
   1. 在步骤3.3.4 中, 在立体显微镜下观看捕食斑马鱼的情况, 并拍摄猎物捕获的视频画面。
   2. 在录像中打分。猎物捕捉的特点是斑马鱼向猎物撞击。将每次攻击计算为一个猎物捕获事件, 尽管这只是一个近似值 (请参阅讨论)。
   3. 从多个视频剪辑计算每小时捕获猎物事件的平均数量, 每个视频剪辑代表不同的斑马鱼幼虫 (图 2)。

结果

对偶校验尾状物很容易将各种细菌内化到储存液泡中。细胞内细菌密度取决于共培养中细菌和副母细胞的密度, 以及所使用的细菌种类。随着时间的推移, 液泡酸化和细菌降解接踵而至。对于所使用的所有菌株, 降解速率必须单独确定。对于致病性大肠杆菌, 最初的细菌密度为790细菌/参数, 细菌降解的半衰期约为 2.3 h (图 1)。

图 1: 细菌半衰期的测定.(a) 在与传染性大肠杆菌共同孵育2小时后,对进行了清洗, 并转移到没有细菌的培养基中。在指示的时间点上, 通过在选择性琼脂上稀释电镀来确定活菌大肠杆菌细胞的数量。结果是均值的±标准误差 (sem; n = 3)。(b) 有明亮的场 (bi)、荧光细菌 (bii) 和合并通道 (bii) 的准 me子携带内化细菌的典型图像。刻度杆 = 20μm。请点击这里查看此图的较大版本.

此外, 还研究了斑马鱼的捕食率, 即斑马鱼在共同孵化后将细菌感染的寄生虫在家中的速率。幼虫斑马鱼开始捕猎和捕捉活猎物从 5 dpf^20,虽然它被发现, 当提高在 30°c, 幼虫发展加速, 并且动物显示猎物行为从 4 dpf。捕食伴随着一个典型的打击行为²⁰ (图 2a), 和捕食率的确定是基于假设, 每次罢工导致内部化的一个参数, 虽然这只能被视为近似 (参见讨论)。根据本文所描述的对食肉斑马鱼幼虫的观察, 对的吸收率大约为每小时 1, 539 (图 2b)。

图 2: 斑马鱼捕食率的测定.(a) 来自一个捕食视频的静止不动的图像, 显示了一个斑马鱼幼虫 (5 dpf) 捕食携带荧光细菌的。时间 (以秒为单位)。箭头表示在撞击过程中运动的主轴。(b) 根据 n = 在整个2小时曝光时间内拍摄的10个视频对捕食率 (每小时摄入的参数) 进行量化。请点击这里查看此图的较大版本.

在对子症内化后, 斑马鱼有效地降解猎物在放弃, 释放感染性细菌到消化系统。正如本文所描述的, 副水球菌降解进行得很快, 在捕食后30分钟内就可以在肠道中检测到游离细菌。自由细菌然后从放弃到中肠和后肠, 在捕食开始后大约1-2小时被检测到它们 (图 3)。肠道中的细菌持久性取决于物种和剂量, 但在大肠杆菌和肠炎的情况下, 从几小时到几天不等。肠系膜主要位于肠道黏膜, 有一些上皮浸润 (图 3C), 导致中性粒细胞渗入上皮 (图 3c)。

图 3: 斑马鱼与细菌的殖民化.5 dpf 的斑马鱼没有感染 (a), 或与 mcherry 一起殖民, 表达 (b) 大肠杆菌或 (c) s. enterica。感染实验可以在野生型 (a和b) 鱼类或转基因线路 (例如, 线 tg (mpo::: egfp) 114 表示绿色荧光中性粒细胞 (c)^所示.直肠开口用箭头标记。(d) 从感染肠炎沙门氏菌感染的全装嵌入幼虫中提高肠道部分的放大倍率。(di) 蓝色 = hoechst 标记核, (dii) 紫色 = phalloidin 标记 f-肌动蛋白, (diii) 红色 = 沙门氏菌, (分区) 合并。刻度杆 = 5μm。请点击这里查看此图的较大版本.

电影 1: 猎物捕捉的视频画面.请点击此处下载此视频.

讨论

这里描述的基本方案已经针对致病性大肠杆菌进行了优化, 并已成功地适应了其他细菌物种, 包括肠炎沙门氏菌和霍乱弧菌。对于一些不在沐浴后对斑马鱼肠道进行殖民的物种, 包括一些肠炎沙门氏菌菌株和一些厌氧菌, 这里描述的食源性感染可以用来成功地建立定植。与微灌胃相比, 微灌胃也被用来在幼虫肠道中建立较高的细菌负担, 食源性感染在技术上的挑战性较低, 需要的专门设备也较少。但是, 对于要使用的细菌物种和菌株, 应优化关键参数。这些因素包括细菌-对阿美的共培养步骤的细菌和对代虫密度: 如果对菌群中的细菌数量较低, 可以通过增加共培养步骤中的细菌密度来改善这一点。一些细菌物种可能会对寄主造成损害, 这应该用显微镜来评估。

这一协议中的另一个重要因素是斑马鱼捕获猎物。这里描述的捕食率是基于这样的假设, 即每一次猎物捕获都会导致摄入一个。该协议中使用了每条鱼的高密度对映体, 以确保高捕食率。然而, 猎物捕获取决于系统中的副虫的密度, 在非常稀薄的对位菌培养中, 猎物率可能低至每小时^13-15对位虫2122。一个限制是, 猎物捕获率也在很大程度上取决于照明条件, 在黑暗中, 捕获率比光线条件²¹低 80%, 在设置实验时应考虑到这一点。如果必须扩大猎物的接触时间, 以优化定植, 就必须考虑通过粪便二次接触细菌。在上述条件下--猎物接触 2小时--这种接触可以忽略不计, 因为细菌的肠道通过时间超过 1小时, 而车辆中的细菌浓度远远高于粪便中。然而, 如果猎物接触时间显著增加, 这可能成为一个重要因素。

该议定书应包括适当的管制措施, 包括在喂养含有非致病性大肠杆菌mg1655 的副菌菌喂养后对斑马鱼进行定植。如果比较多个细菌菌株对斑马鱼寄主的殖民能力, 重要的是要测试它们在帕拉米西亚中的半衰期是否相当。细菌突变, 包括那些损害细胞壁完整性或酸检测的突变, 可能会损害副原体内的细菌稳定性。在这种情况下, 斑马鱼喂养必须进行调整, 以考虑到剂量的差异。

这里描述的协议可用于调查细菌定植及其后果, 包括通过上述斑马鱼的细菌定植成像, 以及通过从组织同质化³中确定每斑马鱼的 cfu, 或调查与感染相关的发病率和死亡率。理想情况下, 对于细菌可视化, 应使用表达荧光蛋白 (如 mcherry 或红色荧光蛋白 (rfp)) 的细菌菌株。这将使人们能够想象不断增长的细菌数量。如果细菌菌株在基因上不可追踪, 或者由于其他原因而排除使用荧光蛋白表达, 则细菌在与参数共培养之前, 可能会被荧光染料 (如 fm 4-64fx) 染色。当使用这里描述的协议时, 与副菌区的共培养不会降低染料的亮度, 在斑马鱼肠道中可以清楚地看到染色的细菌。然而, 如果斑马鱼寄主体内出现明显的细菌增殖, 染料将随着时间的推移而稀释。无论哪种情况, 红色荧光细菌都优于绿荧光细菌, 因为组织自体荧光在绿色中可能高于红色通道。

研究发现, 该方案可适用于好氧和微氧细菌种类。它可能是可能的, 以适应喂养孢子和真菌物种, 虽然这仍有待试验。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paramecium caudatum, live	Carolina	131554	no not store growing cultures below room temperature
0.4% Trypan Blue Solution	Sigma	T8154-20ML	liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML	store in a solvent safety cabinet
Escherichia coli, MG1655	ATCC	ATCC 700926	can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain
FM 4-64FX stain	Thermo Fisher	F34653	aliquot and store frozen
Formaldehyde	Sigma	F8775-4X25ML
LB Broth	Sigma	L3397-1KG
Phosphate buffered saline tablets	Thermo Fisher	18912014
Tetracycline	Sigma	87128-25G	toxic, irritant
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%	Sigma	93595-50ML
UltraPure Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher	16520050
hemocytometer or cell counter	any
stereomicroscope	any
table-top centrifuge
microwave
rotator wheel
heated shaking incubator
aquatics facilities
breeding tanks