单关节膝关节疼痛小鼠模型疼痛的自发性和诱发性测量

摘要

我们已经开发了一个诱发电位的关节炎疼痛的测量, 并结合它与一个标准化的方法来测量自发性疼痛的不同小鼠模型的化学诱发关节炎。这些措施对于不同类型的关节疼痛是敏感和可重现的。

摘要

疼痛是关节炎残疾的主要原因。目前对治疗关节炎疼痛的适当治疗需求尚未得到满足。临床前模型对于研究疼痛的机制和评估关节炎治疗的疗效是必要和有用的。在关节炎的动物模型中测量疼痛是一个挑战。我们已经开发了方法来测量诱发疼痛和自发性疼痛的三种模型的小鼠关节炎。我们量化的诱发电位反应的小鼠在疼痛的膝盖的坚定触诊。我们还评估自发性疼痛的重量比例和时间的数量放置在他们的四肢后, 诱导关节炎疼痛在一个膝盖。这些小鼠模型中的关节疼痛会显著增加诱发的疼痛反应和负重的变化。由于老鼠是四足动物, 它们将疼痛的肢体卸载到对侧肢体、前肢或某种组合中。这些方法简单, 需要最少的设备, 并且是可重现和敏感的检测疼痛。它们对小鼠疾病改变性关节炎治疗和镇痛药的研究都很有用。

引言

疼痛是关节炎^1,2造成残疾的主要原因。目前可用的镇痛药往往无效、有毒, 有可能导致全国范围的麻醉问题³。手术并不总是终末期关节炎的一种选择, 特别是在老年人中, 他们可能有多种共同疾病。关节内类固醇和粘附剂可能是有效的早期疾病, 但通常失去他们的效力, 在晚期疾病⁴。有一个伟大的未得到满足的需要有效的止痛药治疗关节炎疼痛, 不能解决目前可用的治疗方法。

临床前模型对于了解疼痛疗法的作用机制和预测极限毒性是有用的, 但在动物中的疼痛测量是具有挑战性^{的 5}。疼痛措施可以是直接和自发的 (静态或动态负重、脚姿势、步态分析、自发运动和机械或热敏性), 也可以是间接的 (后肢戒断测试、膝盖压缩力或大脑成像)⁶. 对于轻度单关节炎, 步态分析不敏感, 缺乏一致性⁷。静态负重是有用的测量疼痛的大鼠后肢, 但可能是困难的小鼠。机械灵敏度测量, 如冯弗雷测试间接检测到在膝关节关节炎的设置脚垫的敏化, 但不直接测量膝关节疼痛, 是繁琐的执行。用 p. a. m. (压力应用测量) 装置测量的膝关节压缩力可以在大鼠身上使用, 但大型装置很难在小鼠身上使用, 而不会产生不一定反映疼痛的负面行为^.

我们已经开发了方法来测量自发性和诱发疼痛的三种不同的模型的小鼠关节炎是敏感和可重现的, 以测量疼痛严重程度和关节内治疗的镇痛作用^{9, 10}. 我们还可以将止痛与其他疼痛的组织学标记物和筛查药物联系起来, 这在人类中是不可能的。我们可以评估适度有效的镇痛药的协同作用, 以确定更有效的综合疗法。通过使用已被证明的诱发疼痛和自发疼痛的方法, 我们避免了未能识别疼痛的陷阱, 这种痛苦反映在一种类型的疼痛行为中, 而不是另一种类型的疼痛行为, 更接近人类^的疼痛测量11。通过将疼痛评估限制在两种方法上, 我们最大限度地减少了对动物的压力, 这可能会影响疼痛行为, 并最大限度地提高实验室的生产力。

研究方案

所有动物程序和规程都得到了明尼阿波利斯退伍军人事务保健系统 (vahcs) 机构动物护理和使用委员会的批准, 并符合 "实验动物护理和使用指南" (美国国家学术出版社)^12岁

1. 动物的选择

注: c57bl6 小鼠用于所有三种关节炎模型。

1. 使用雄性或雌性小鼠, 但请注意, 对关节炎疼痛的反应可能因性别和被测试模型的发病机制而异。
2. 选择已经达到性成熟、不再快速生长、还不够老的小鼠, 可能会出现自发性关节炎, 从而混淆疼痛测量结果。
   注: 在所述模型中, 12周是测量疼痛的理想年龄, 但这取决于研究设计。关节炎开始的年龄取决于模型发展所需的时间。急性炎症性关节炎 (卡拉胶模型) 需要3小时的发展, 因此动物是12周的诱导时。慢性炎症性关节炎 (cfa 模型) 需要3周的发展, 因此动物在诱导时是9周大。慢性退行性关节炎 (胶原酶模型) 需要4周的发展, 因此动物在诱导时是8周。更慢性的退行性关节炎模型可以通过诱导6周大的关节炎来使用。这允许6周的关节损伤的发展。然而, 小鼠慢性退行性关节炎不会产生明显的诱发电位疼痛。
3. 从国家商业饲养员来源获取动物。
4. 将最多8头动物组成的小组放在标准的聚碳酸酯网箱中, 并有脂质啮齿类动物的饮食和水。
5. 在12小时的光/暗周期中保持72°c±1°c 和33% ±1% 的湿度的环境条件。

2. 关节内注射到膝盖

1. 创建一个 30 g 2.5 毫米无菌, 覆盖0.5 英寸针的长度与一个护套制成的聚乙烯管的内径0.38 毫米, 外径1.09 毫米, 只留下2.5 毫米针突出。这样可以防止将针头插入太深, 并在后部退出关节。
2. 选择一个膝盖注射, 剃须它使用任何商业上可用的电动面部修剪器, 并消毒与提供碘擦洗。
3. 用3% 异氟醚在 100% o2 中麻醉小鼠, 在 1 l2 min 处, 用 nosecone 保持麻醉, 在手术过程中使用 nosecone。用脚趾夹紧确认麻醉深度。注意监测呼吸状态, 尽量减少麻醉暴露, 以保持足够的呼吸。
4. 使用无菌护套针进入中线的关节, 一旦小鼠完全麻醉, 就会低于带状疱疹的下边缘。这种前中线方法最大限度地提高了进入关节和注射感兴趣的物质的准确性。
5. 使用相同的方法注射关节炎诱导物质和镇痛物质。由于将针头插入上述, 但不注入任何物质, 就可以产生沙姆控制装置。

3. 关节炎的产生

1. 对动物进行麻醉, 如上文步骤2.3 所示。
2. 称量适当数量的卡拉胶 (见下文), 完成 freund 的佐剂和 iv 型胶原酶, 并在层流罩中用正常的盐水稀释到适当的浓度, 以确保安全和无菌。
3. 在0.9% 无菌盐水中稀释到膝盖上的 10μl, 如以上使用汉密尔顿注射器, 产生急性炎症性关节炎。注射后3小时达到关节炎高峰。
4. 注射30微克 (30μg) 的完全弗罗因德的佐剂 (cfa) 到膝盖, 以产生慢性炎症性关节炎。有一个最初的急性炎症期, 在1周时达到高峰, 然后在注射后3周达到高峰的慢性期。
5. 注入含有 10 iu iv 型胶原酶的 10μl, 以产生慢性退行性关节炎。注射后 4周, 关节炎疼痛达到高峰。

4. 诱发关节疼痛的测量

1. 总是检查正常的比较器膝盖第一, 以尽量减少交叉疼痛反应 (windup) 从疼痛的膝盖¹³。
2. 训练审查员使用油压仪4级施加一致和牢固的压力, 为 700 gfcm 2 = 10 psi;当施加这种压力时, 设备将发出4声蜂鸣声。与正常关节相比, 这种压力会不断引起关节炎关节更大的疼痛反应。
   注: 设备在工厂中进行校准, 以便在施加适当的压力时发出4声蜂鸣声。仅使用该设备进行训练;不要在动物身上使用, 但在检查动物时, 应用通过训练学到的压力量。
3. 用食指和拇指握住脖子的擦边球, 用第4和第5^手指约束尾巴, 以足够^紧致地约束鼠标, 以防止随意的运动。鼠标应该能够作出离散的, 短暂的运动, 努力和刺激时, 但不应该能够自由或连续地移动。
4. 管理重覆牢固 (掌上电脑表水平 4) 触诊同时对每个膝盖的侧和内侧边在近似地联接线与自由的手的拇指和食指一次每秒一次, 同时克制小鼠。不要使用测角仪进行鼠标检查;它仅用于训练。
5. 让第二个观察者数一数动物发声和战斗的次数, 以逃避在这一分钟的时间段内的约束。战斗和发声的总和是被唤起的疼痛得分。
6. 在整个研究过程中, 我们总是相同的审查员, 并确认审查员和观察者对实验条件视而不见。

5. 测量自发性关节疼痛。

注: 高级动态重量轴承 (adwb) 装置计算动物在每个肢体上花费的总时间的百分比和每个肢体上的总重量的百分比。

1. 在塑料烧杯上装满2升的水。将设备附带的泡沫垫和中等密度纤维板与填充烧杯一起放置在实验室刻度上, 并记录组合重量。
2. 打开 adwb 程序, 然后选择"鼠标传感器类型"。
3. 在每次实验之前校准系统:
   1. 在"校准" 菜单下选择"完全校准"。输入0.00 作为tare 值和泡沫垫、中等密度纤维板、塑料烧杯和水的重量作为校准重量, 然后选择"下一步"。
   2. 在传感器上放置任何内容之前, 请选择 " tare" 。在选择增益预览之前, 按顺序, 用提供的泡沫垫、中密度纤维板和装满2升水的塑料烧杯覆盖传感器垫。在传感器上的校准重量后, 选择 "增益预览" 。
   3. 调整校准重量, 使其均匀分布在各个传感器上, 当校准指示器的值超过95时, 选择"增益定义"。这个过程为各个传感器产生了归一化的均值, 并确认了各个传感器的完整性。最后, 选择"下一步"。
   4. 将校准文件保存到校准文件夹中。
4. 选择"新建" , 并在提供的位置输入要测试的第一个鼠标的"项目名称" 和"动物名称"。
5. 选择"浏览"并打开为项目创建的校准文件。选择"下一步", 确保选择了 "启用视频捕获" , 然后选择"确定"。
6. 称重动物, 选择"捕获", 并在软件中记录重量。选择"确定"。
7. 在收集数据之前, 不要将小鼠接触到房间, 因为这种装置测量自发的行为。
8. 将鼠标放入室内进行5分钟的测试。当动物在房间中, 选择发射.该软件将记录动物在此期间的活动, 捕获视频并与传感器数据同步, 并自动将此视频划分为可分析和不可分析的段。
   注: 当检测到至少一个稳定区域时, 软件会考虑可分析的段。当传感器在一个传感器上检测到≥2 g, 至少有一个相邻传感器检测≥1 g, 并且一个区域的重量分布稳定在 0.38 s 以上时, 就会产生一个稳定的区域。
9. 在系列中的第一次分析之前, 请选择"轻松评分" 和"独立爪子" 设置。
   注: 简单评分允许迭代验证段, 其中稳定区域不会根据该段的第一个稳定区域的验证而更改。独立的爪子设置为观察者提供了对键盘快捷键的访问, 允许对每个爪子进行单独标识。观察者指定的区域符合最低标准, 如右后、左后、右前、左前、前爪、其他身体部位或忽略区域, 同时将光标停留在视频的段上, 并缩放地图激活传感器。
10. 选择> >移动到第一个可分析段。如果一个稳定的区域没有识别出正确的爪子, 然后将光标放在该区域上, 然后按快捷方式 (右后、 s; 左后, a; 右前, w; 左前, q; 两个前爪, e; 其他部分身体的, z, 忽略区域, x) 对应于正确的身体部分。
    注: 至少需要1.5分钟的可分析时间才能达到分析阈值。分析的段被添加和平均自动为输出的每个爪子 (s) 由软件。
11. adwb 软件然后自动计算在四个肢体选项中的每一个上花费的被分析时间和体重 (g) 的百分比。通过选择"结果"、 "导出"、"是" 导出为提示问题 (询问是否只应导出前五个汇总行) 以及选择输出位置, 将这些值导出到新的电子表格中.
12. 在研究期结束时, 通过吸入 co2 对动物进行安乐死, 然后进行开胸手术。
13. 对于同一组中的每个其他动物, 选择"新建"并输入唯一的动物名称, 但不更改项目名称。选择"下一步", 确保选择了 "启用视频捕获" , 然后选择"确定"。对于第一个动物, 请按照步骤5.5 到5.12 操作。

结果

急性和慢性炎症性和慢性退行性关节疼痛是由 ia 注射到 C57BL/6J 雄性和雌性小鼠的左膝之前使用上述方案概述的方案的疼痛评估。关节疼痛被测量为诱发疼痛评分 (eps) 和自发性疼痛行为测量与先进的动态负重 (adwb) 装置。为了本报告的目的, 使用学生的 t 测试进行了个人比较。对于比较镇痛剂量的实验, 方差分析可能是更合适的统计比较。

eps (统计战斗加发声的总和) 随着所有三种类型的关节疼痛而增加 (图 1)。在急性和慢性炎症性关节疼痛中, adwb 对左后肢负重百分比的测量与天真的小鼠相比有所下降。女性而男性慢性退行性关节疼痛 (col) 在 adwb 措施中也出现了类似的减少 (图 2a)。与天真的动物相比, 有急性炎症性关节疼痛的男性将更多的重量转移到前肢。与天真的, 雌性小鼠对前肢的重量增加, 但男性慢性退行性关节疼痛 (col) 没有增加 (图 2b)。adwb 对受影响的左后肢时间百分比的测量比急性和慢性炎症性关节疼痛的小鼠相比下降, 但这在统计学上并不显著。这些动物在左后肢上花费的时间确实明显少于在右后肢上花费的时间。在慢性退行性关节疼痛的男性和女性中, 与天真相比, 在左后肢上度过的时间没有差异。慢性退行性关节疼痛的女性在非关节炎右后肢上花费的时间比天真的女性多 (图 3a)。急性炎症性关节疼痛的小鼠和慢性退行性关节疼痛的女性在前肢上的时间明显多于天真的动物 (图 3b)。

图 1.左 (蓝色柱) 和右 (红柱) 后肢诱发疼痛评分.右后肢起到内部控制的作用, 没有接受任何 ia 注射。在以下条件下进行了测量: 未注射的天真 (男性和女性), 急性炎症性卡拉胶引起的关节炎 (car), 慢性炎症完全弗罗因德的佐剂引起的关节炎 (cfa) 和慢性非炎症胶原酶引起的关节炎 (col-男性和女性)。在天真的动物中, 左后膝的 eps 在统计学上与雄性的右 (* * p = 0.038) 在统计上没有差异, 只有在雌性中只有很小的差异 (** p = 0.038), 原因可能是由于交叉疼痛导致第二 (左) 检查的膝盖疼痛反应增加响应。在所有关节炎组中, 关节炎左膝关节 eps 明显大于非关节炎对侧右膝关节。当将关节炎组的左膝关节 eps 与天真的动物进行比较时, 与天真的左膝相比, 所有关节炎组的左膝关节关节关节炎的 eps 得分都要高得多。男性和女性都是如此。*p < 与男性相比, 男性天真,# p < 0. 0, 女性天真。所有误差线在所有数字中都是 sem。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 自发性疼痛行为, 以四肢体重百分比来衡量.(a) 自发性疼痛行为, 以左 (蓝柱) 和右 (红柱) 体重的总百分比来衡量。在男性和女性天真的动物中, 左、右后肢的体重百分比没有显著差异。男性小鼠与 car 和 cfa 诱导关节疼痛和女性与 col 诱导关节疼痛的左后肢的重量明显低于天真。*p < 与男性相比, 男性天真,# p < 0. 0, 女性天真。(b) 自发性疼痛行为, 以前肢总重量百分比来衡量。在男性与 car 引起的急性关节疼痛和女性与 col 引起的慢性关节疼痛, 有显著增加的重量承担在前肢。这在男性中没有发现 cfa 或 col 引起的关节疼痛。天真的雌性比天真的雄性更容易在前肢上承受更多的重量 (p = 0.02)。额外的重量可能由其他身体部位承担, 如尾巴或臀部。这些通常是最小的, 并没有显著有助于对疼痛反应的理解, 因此没有显示出来。*与男性天真相比, p < 0.05, #p < 与女性天真的比较, 男性 4周 col 与男性 4周 col 相比, 前肢体重。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:自发性疼痛行为, 以花费在四肢上的时间百分比来衡量.(a) 自发性疼痛行为, 以左 (蓝柱) 和右 (红柱) 的总时间百分比来衡量。男性和女性天真的小鼠的右后肢和左后肢与在肢体上花费的时间相比没有显著差异。与天真相比, 患有 car 和 cfa 诱发关节炎的雄性小鼠与关节炎左后肢的负重时间似乎较少, 但这在统计学上并不显著, 而且很可能是由于这些小鼠在这一指标中的变异性增加。这些动物比较右左有显著差异, 因为右后肢的总时间比左肢多。在有 col 诱发关节炎的女性中, 右后肢的权重比天真的女性具有更大的时间比例。*p < 0. 5 比较右左, #p < 0. 5 与女性天真相比, 男性 4周 col 在前肢上的时间。(b) 自发性疼痛行为, 以前肢所花费的总时间来衡量。在男性与 car 诱导关节炎和女性与 col 诱导关节炎的小鼠花更多的时间在前肢比天真的动物。雌性天真的老鼠比雄性天真的老鼠花在前肢上的时间更多。*p < 与男性相比, 男性天真,# p < 0. 0, 女性天真。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

测量炎症性关节炎和退行性关节疾病的临床前模型中的关节疼痛是评估关节炎疼痛和恢复关节功能^{9,10 的}新治疗方法越来越有价值的工具。测量慢性退行性关节疾病小鼠的疼痛行为具有挑战性。作为四足动物, 它们可以将疼痛的肢体卸载到其他三肢或尾巴的任意组合上。一个肢体的功能下降可能不会像双足人类那样明显地显示出来。作为猎物动物, 老鼠有生存的好处, 以尽量减少疼痛行为。

该报告表明, 不同病理机制的关节疼痛可以用简单和相对便宜的方法在小鼠身上测量。炎症性关节疼痛会导致负重时间和分布的较大变化, 因此可能是检测镇痛的一个更敏感的模型。然而, 在评估新的潜在镇痛药时, 其他关节疼痛模型将是重要的, 因为疼痛的开始和维持机制可能因不同的病理而不同。我们发现男性和女性之间的卸载模式和不同型号的关节炎疼痛之间的差异。

重要的是要认识到, 在^{14、15、16岁的}小鼠的疼痛行为中, 可能会有应变和性别差异。人们还知道, 疼痛阈值有明显的应变差异。我们发现, 在 c57/bl6 小鼠中, 雌性表现出的自发疼痛行为 (前肢体重和时间增加) 明显多于慢性退行性关节疼痛的雄性小鼠 (图 2和图 3)。我们没有确定这些雌性小鼠的雌激素阶段, 所以我们不能说这是否对我们的结果有任何影响, 但其他人已经确定, 雌激素阶段并没有解释观察到的性别差异在 c57/bl6 小鼠¹⁷。

诱发疼痛行为对所有类型的关节疼痛检测都很敏感, 具有良好的重现性。至关重要的是, 审查员应接受培训, 以提供一致的, 标准化的触诊压力, 并使用一致的约束方法, 使疼痛行为的范围, 以检测疼痛和镇痛。重要的是要首先检查正常的膝盖, 以最大限度地减少由于交叉效应的正常膝关节的疼痛反应, 并最大限度地区分正常和疼痛的膝关节之间的疼痛反应。使用第二个观察者来统计构成 eps 的疼痛反应是必要的, 以便审查员专注于一致的触诊, 并使发声和战斗持续统计。可能有必要特别练习约束方法, 以确保动物能够对疼痛做出充分反应, 但不会反应太容易, 从而冲淡疼痛反应。eps 测量的优点是类似于测量人类患者的关节压痛。

我们认为这些方法优于现有的方法, 因为它们直接测量来自小鼠膝关节的疼痛, 它们可以用于不同的单关节炎疼痛模型, 它们既包括自发的疼痛反应, 也包括诱发疼痛的反应, 而且相对价格低廉, 但可靠且可重复。随着治疗开发, 以更有效地治疗关节炎, 这些方法将有助于确认治疗是否真的有效的关节炎, 疼痛的最致残的结果。

我们的方法有一些局限性。主要是, eps 措施受到对单个审查员和观察者的要求以及对非常一致的技术的要求的限制。诱发疼痛的措施更加自动化, 不受观察者间差异的影响。eps 测量的进一步改进可能包括计算发声以响应触诊的自动化方法, 例如使用超声波蝙蝠检测器来计算发声。这种方法需要与我们目前的方法进行比较, 以确认灵敏度和特异性, 才能得到广泛实施。

总之, 我们描述了两种不同的疼痛行为措施量化关节疼痛的小鼠。在选择实验模型之前, 必须考虑性别和应变差异。诱发疼痛的措施需要仔细的培训和审查员的一致实施。自发性和诱发疼痛行为都被推荐用于评估疼痛的严重程度和功能限制, 并应被用来充分评估新的潜在镇痛药的效果。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Dynamic Weightbearing Device	Bioseb In Vivo Research Instruments, Vitrolles, France	Model: BIO-DWB-M - For mice
C57/Bl6 mice (male and female)	Jackson Labs, Bar Harbor ME	Stock No: 000664 | Black 6
Carrageenan	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	22049-5G-F
Complete Freund's Adjuvant	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F5881
Palpometer	Palpometer Systems, Inc. Victoria, B.C	Not available - no longer in business
Type IV Collagenase	Worthington Biomedical Corp, Lakeville, NJ	LS004210