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摘要

该方案描述了一种合成与赖氨酸-酪氨酸-苯基丙氨酸 (kyf) 三肽稳定的油酸-铂 (ii) 共轭纳米乳液的有效方法。纳米乳液通过 kyf 和共轭的自组装在温和的合成条件下形成。

摘要

我们描述了一种方法, 以产生纳米乳液组成的油酸-pt (ii) 核和赖氨酸-酪氨酸-苯基丙氨酸 (kyf-pt-ne) 涂层。kyf-pt-ne 封装 pt (ii) 为 10 wt%, 直径为 107±27 nm, 表面电荷为负。kyf-pt-ne 在水和血清中都是稳定的, 具有生物活性。荧光体与 kyf 的结合允许合成适用于生物成像的荧光纳米乳液。纳米乳液的合成是在水环境中进行的, kyf-pt-ne 是通过短 kyf 肽和油酸-铂 (ii) 共轭的自组装形成的。自组装过程取决于溶液的温度、基板的摩尔比和基板添加的流速。关键的步骤包括在合成过程中保持最佳的搅拌速率, 允许足够的时间进行自组装, 以及在离心式集中器中逐步预浓缩纳米乳液。

引言

近年来, 人们对用于药物输送和生物成像等生物医学应用的纳米粒子的工程越来越感兴趣, 这些应用包括 1、2、3、4。基于纳米粒子的系统的多功能往往需要将多个组件纳入一个配方。以脂质或聚合物为基础的构建块往往因其物理化学特性及其生物相容性和生物降解性而不同, 这最终可能影响纳米结构1的功能, 5,6。生物衍生材料, 如蛋白质和肽, 由于其序列的灵活性7,8,早已被公认为多功能纳米结构中很有前途的成分。多肽自组装成高度有序的超分子结构, 形成螺旋丝带9,10, 纤维支架11,12和更多, 从而为建设铺平道路采用自下而上的方法13的生物分子基混合纳米结构.

多肽已被探索在医学和生物技术中的应用, 特别是用于抗癌治疗14和心血管疾病15 , 以及抗生素开发16,17, 代谢疾病18, 感染19。有一百多个小肽疗法正在进行临床试验20。多肽易于修改和快速合成在较低的成本。此外, 它们还可生物降解, 极大地促进了它们的生物和制药应用 21,22.多肽作为结构成分的使用包括反应灵敏的、基于肽的纳米粒子和水凝胶库的工程, 用于控制释放 23、24、25、26,27、基于肽的生物传感器28、29、30、31或生物电子设备32、33、34.重要的是, 即使是含有两到三个氨基酸残留物 (包括苯基丙氨酸) 的短肽, 也能指导自组装过程35、36、37, 并产生稳定的乳液38.

铂基药物由于其高效, 在许多癌症治疗方案中单独使用, 并与其他药物结合使用 39,40。铂化合物通过形成单加合物和链内或链间交联来诱导 dna 损伤。pt-dna 病变被细胞机械识别, 如果不修复, 会导致细胞凋亡。最重要的机制, pt (ii) 贡献导致癌细胞死亡, 是 dna 转录41,42的抑制。然而, 铂治疗的好处是减少的系统毒性的 pt (ii), 引发严重的副作用。这导致较低的临床剂量的 pt (ii)43, 这往往导致亚治疗浓度的铂到达 dosing。因此, 随后的 dna 修复有助于癌细胞的存活和获得 pt (ii) 的抵抗力。铂耐药是抗癌治疗中的一个主要问题, 也是治疗失败的主要原因 44,45。

我们开发了一种稳定的纳米系统, 该系统封装了 pt (ii) 剂, 以便在系统循环中提供屏蔽效果, 并减少 pt (ii) 诱导的副作用。该系统是基于油酸-pt (ii) 核心稳定与 kyf 三肽, 形成纳米乳液 (kyf-pt-ne)46。kyf-pt-ne 的构建块, 三肽的氨基酸, 以及油酸, 具有公认的安全 (gras) 地位, 在食品药品监督管理局 (fda)。采用纳米沉淀法47制备了 kyf-pt-ne。简而言之, 油酸-pt (ii) 共轭溶解在有机溶剂中, 然后在37°c 下滴入水 kyf 溶液 (图 1)。该溶液搅拌数小时, 以便 pyf-pt-ne 自行组装。纳米乳液集中在 10 kda 离心式集中器中, 用清水清洗3次。通过对 kyf 的化学改性和荧光粉, 可以合成适用于生物医学成像的荧光 fitc-kyf-pt-ne。

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研究方案

1. 油酸的合成–铂 (ii) 共轭

  1. 顺铂的激活
    1. 在60°c 水中 (例如纳米颗粒) 悬浮50毫克 (0.167 mmol) 顺铂。
    2. 在0.5 毫升的水中加入液位55.2 毫克 (0.325 mmol)agno 3, 在顺铂溶液中搅拌反应至少2小时。agcl 的白色沉淀将形成, 表明反应的进展。
    3. 要确定活化反应是否完成, 请用10% 的 hcl 进行测试, 以确定溶液中是否存在游离银+离子。测试应该是阴性的 (不应该形成额外的 agcl 沉淀)。
    4. 以 3, 220 x克离心反应混合物 10分钟, 并去除 agcl 的白色沉淀物。
    5. 收集上清液, 并通过 0.2 mm 注射器过滤器对其进行过滤。通过巴斯德移液器将2-3 滴溶液应用于 sncl2晶体, 测试上清液是否存在铂金。如果锡与铂的配合物颜色为深黄色/橙色, 则测试结果为阳性。
    6. 在第二步中使用带有激活 pt (ii) 的上清液。
  2. 油酸与活化 pt 的反应 (ii)
    1. 在60°c 的3毫升水中悬浮94.2 毫克油酸 (0.333 mmol)。
    2. 在1毫升的水中加入13.3 毫克 (0.333 mmol) 的 naoh, 并与步骤1.1 中的活化 pt (ii) 溶液混合
    3. 在60°c 下搅拌 2小时, 在室温下搅拌2小时过夜。粗产品为油性棕色/黄色沉淀物。
    4. 以 3, 220 x克离心反应混合物 10分钟, 并去除上清液。使用旋转蒸发器在25°c 下干燥原油。用乙腈多次清洗产品。纯油酸–pt (ii) 共轭的最终颜色是淡黄色。

2. kyf-pt-ne 和 fitc 标记的纳米乳液的合成

  1. kyf 三肽与荧光标记三肽 fitc-kyf 的合成
    1. 使用标准固态肽化学合成 kyf。使用以下标准耦合条件连接每个氨基酸: 王树脂 (2.19 mmol), fmoc 保护氨基酸 (4.38 mmol)、2 (1H-苯并三唑-1-基)-1, 1, 3, 3-四甲基四氟硼酸铵 (tbtu) (4.38 mmol) 和二异丙胺(dipea)(8.76 mmol)。用 tbtu 在二甲基甲酰胺 (dmf) 和 dipea 中溶解氨基酸。
    2. 使用前, 将 fma-l-派 4-烷氧基苯醇树脂 (0.382 meq g) 浸泡在 dmf 25 毫升中1小时。
    3. 用20% 哌啶/dmf 溶液15毫升对 l-苯基丙氨酸氨基酸的胺组进行5分钟的保护, 将溶剂丢弃, 并用20分钟循环重复清洗。
    4. 用下列溶剂清洗树脂 1分钟: dmf、异丙醇 (ipa)、dmf、ipa、dmf、ipa、dmf、dmf、dmf。每次清洗后丢弃溶剂。
    5. 进行凯撒试验, 以确定是否存在游离 nh2 组的树脂 (见子步骤), 如果是阳性 (树脂种子是紫色), 添加 fmoc-l-酪氨酸氨基酸, 并执行一夜的耦合。
      1. 在单独的瓶子中准备凯撒测试解决方案。
      2. 在100毫升乙醇中溶解5克的九氢。
      3. 在乙醇20毫升中溶解80克苯酚。
      4. 将2毫升的 0.001 m 氰化钾水溶液混合在一起
        98毫升吡啶。
      5. 在每个凯撒测试溶液中加入2-3 滴, 在沸水中取样加热5分钟。
    6. 在第二个氨基酸成功耦合后, 执行凯撒测试, 如果阴性, 请执行去保护协议 (步骤 2.1.3 2.1.5)。用 fmoc-fonalanine 氨基酸重复这个过程。
      1. 在所有氨基酸偶联后, 用 dmf、ipa、dmf、甲醇、二氯甲烷和二乙醚等5毫升将树脂洗净 1分钟, 每次清洗后丢弃溶剂。保存树脂以进行进一步加工。
      2. 在接下来的步骤中使用一半的树脂 (2.1.7-2.1.9) 使用 fitc 修改肽。要获得未改性的 kyf 三肽, 请按照2.1.10 开始的程序。
    7. 用 6-偶氮二己酸将 kyf 的 n 端氨基酸改为 kyf-n3 。为此, 将 kyf 王树脂的1克 (0.380 mmol) 和6-azidohexanoic 的12.1 毫克 (0.382 mmol) 混合在 dmf 30 毫升中, 使用245.2 毫克 (0.382 mmol) 的 tbtu 和197.1 毫克 (1.528 mmol) 的 dipea 酸。在室温下连夜搅拌反应。
    8. 通过点击反应, 从 kyf-n3与丙基荧光素的合成中获得 kyf-fitc。为此, 将 kyf-n 3-王树脂的253 毫克 (0.097 mmol) 与 3.3. 78 毫克 (0.097 mmol) 的 cui 固体, 71.9 毫克 (0.193 mmol) 的 propargyl 荧光素和2.24 毫克 (0.097 mmol) 的 dipea。反应应该会把颜色从绿色变成棕色。
    9. 24小时后, 用5毫升 dmf 和 ipa 5次、甲醇和水三次、dmf 和水三次, 用二氯甲烷和二乙醚三次交替清洗树脂1分钟。每次清洗后丢弃溶剂。
    10. 在3小时内, 用三氟乙酸 (tfa)/三异丙基硅烷 (tips)/h2 o 的比率从树脂中分离出 kyf-fitc 或 kyf 肽。
    11. 将粗肽沉淀在冷二乙醚中, 用冷醚三次清洗, 然后在真空下干燥。
  2. pt (ii) (fitc-kyf-pt-ne) 和 kyf-pt-ne 合成 fitc-kyf 稳定纳米乳液
    1. 溶解10毫克 (0.0126 mmol) 的油酸–pt (ii) 共轭 1.5 ml 异丙醇, 并放置在5毫升注射器。
    2. 将带有油酸的注射器-pt (ii) 共轭放入注射器泵中, 并将流量设置为 0.1 ml/min。
    3. 为了合成 fitc-kyf-pt-ne, 在20毫升的水中溶解1毫克 (0.00105 mmol) 的 fitc-kyf 和1毫克 (0.00219 mmol) kyf (fitc-kyf:kyf) 的1:2 摩尔比, 并将溶液的温度调整到37°c。用铝箔覆盖容器的墙壁, 以避免 fitc 荧光粉的光漂白。合成 kyf-pt-ne, 在20毫升的水中溶解 kyf 三肽2毫克 (0.0044 mmol), 并将溶液温度调整到37°c。
    4. 加入油酸–pt (ii) 共轭滴入 fitc-kyfyf 或 kyf 三肽的溶液中。在引擎盖下执行此步骤。
    5. 在室温下搅拌溶液过夜, 蒸发有机溶剂, 并允许 fitc-kyf-pt-ne 或 kyf-pt-ne 的自组装。
    6. 将 fitc-kyf-pt-ne 或 kyf-pt-ne 集中在离心式集中器 (10k mwco) 中, 并用4毫升的纳米水三次清洗。
    7. 将 kyf-pt-ne 和 fitc-kyf-pt-ne 的水溶液存放在4°c。
    8. 按照制造商的指导 48, 使用原子吸收光谱 (aas) 分析铂含量。
      1. 为校准曲线准备 10% hcl 解决方案中的铂金标准 (aas 的有效范围在100至 1, 200 ppb (每10亿分之) 之间)。
      2. 从步骤2.2 中的100μl 中溶解 50μl kyf-pt-ne 溶液 (浓缩盐酸和硝酸的混合物 3:1), 并在室温下过夜。加入850μl 的水, 最终样品体积达到1毫升。使用 aas 分析示例。在所有分析的样品中, 最终的酸浓度应为10%。
      3. 记录 ppb 中 pt 浓度的读数, 并计算样品中的最终铂含量 (考虑到样品稀释和纳米乳液的初始体积)。

3. fitc-kyf-pt-ne 细胞吸收的共聚焦成像

  1. 种子6个卵巢癌细胞系 (a2780、cp70、skov3、ov90、tov21g 和 es2), 进入4个井室共聚焦培养皿, 密度为每室 4.7 x10 4个细胞, 并在37°c 下进行隔夜培养。
  2. 24小时后, 用磷酸盐缓冲盐 (pbs) 三次清洗细胞, 并在细胞培养基中用 fitc-kyf-pt-ne 孵育 15分钟 (细胞系具体细节见步骤 6.1)。
  3. 孵育后, 取出培养基, 用 pbs 清洗细胞三次。
  4. 用冷甲醇将细胞固定 5分钟, 在-20°c 下, 用1毫升的 pbs 清洗3次。
  5. 在室温下, 用0.1% 的 triton-x 对细胞进行1毫升的渗透 10分钟, 并用1毫升的 pbs 清洗三次。
  6. 在室温下, 在 pbs 中进行1:50 稀释, 用 lamp1 抗体与亚历克莎 fluor 647 (1 毫升) 结合对细胞进行90分钟的培养。接下来, 用 pbs 清洗细胞3次。
  7. 在 pbs 中稀释 dapi 库存溶液 (1 mg/ml) 到 1 mg/ml。然后, 在每个腔中加入1毫升稀释后的溶液, 在室温下孵育15分钟。用 pbs 清洗细胞3次。
  8. 使用安装介质将盖板安装在幻灯片上。
  9. 在激发波长为 405 nm、405 nm 和 633 nm 的激发波长下, 使用活细胞共聚焦显微镜对细胞进行成像。将检测参数设置如下: 激光功率为 0.2%, 不超过 1%, 皮诺莱1气单元, 增益母版 650-750, 数字偏移0。
  10. 在成像软件中打开图像。在显示的图像下, 选择 "图形", 然后选择 "插入缩放栏", 将刻度栏插入到图像中。

4. 药物释放研究

  1. 在 pbs 中开展药物释放研究。将三个 pbs 缓冲液的 ph 值分别调整为7.4、6.8 和5.0。
  2. 在适当 ph pbs 的180μl 中稀释 5μl kyf-pt-ne, 转移到 3.5 kda mwco 微型透析杯, 并在 pbs 中37°c 孵育。
  3. 在2、4、6、24、48和140小时内从每三个微型透析管中去除缓冲液, 并通过 aas 测量铂浓度。根据步骤2.2.8 准备所有样品, 但将样品的最终体积调整为500μl。

5. 细胞培养方法

  1. 培养细胞系 a2780、cp70、bovine、ov-90、tov-21g、细胞培养基中的 es-2 (dmem) 补充 10% (a2780、cp70、bovine、es-2) 或 15% (tov-21g, ov-90) 胎儿牛血清 (fbs), 含 l-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。在5% 的 co2 中生长所有细胞, 在37°c 下的水饱和大气中生长。
  2. 种子 3 x 10 5 细胞在每个96孔板和培养前过夜的体外培养实验。在水中准备 kyf-pt-ne、顺铂和卡铂溶液。调整 kyf-pt-ne 中 pt (ii) 的浓度, 以匹配每个细胞系的卡铂和顺铂浓度。在37°c 下孵化72小时。
  3. 孵育后, 使用比色法 (mtt 细胞增殖法) 评估细胞活力。简单地去除培养基, 在各井中加入110μμl 的 10% mtt, 在37°c 下孵育2小时。然后在每口井中加入100μl 洗涤剂, 在37°c 下孵育5小时。
  4. 使用板式读取器检查 570 nm 的吸收率。使用 z-测试和 p-测试的统计分析分析结果。

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结果

图 2a 显示了使用该协议编写的 kyf-pt-ne 的代表性 tem 图像。kyf-pt-ne 在形态上呈球形, 分散良好, 尺寸均匀。kyf-pt-ne 的核心直径为 107±27 nm, 直接从三个 tem 图像中测量, 至少完成了200次测量。利用动态光谱 (dls) 对 kyf-pt-ne 的流体动力直径进行了分析, 发现其动态直径为240纳米, 多分散性指数为0.156。确定了 kyf-pt-ne 在水中的 zeta 电位, 确定了三个独立合成?...

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讨论

纳米乳液合成的关键步骤包括调整基材的摩尔比, 在油酸-pt (ii) 加法期间保持温度和流速控制, 为自组装提供足够的时间, 并使用离心式集中机柱。这些参数影响 kyf-pt-ne 的大小和形态;因此, 保持适当的摩尔比, 正确调整合成条件尤为重要。

纳米乳液合成过程中基板的比例 (步骤 3) 对自组装过程至关重要, 并决定了产品的最终尺寸。kyf 与油酸-pt (ii) 摩尔比为 1:3, 水中三聚酰亚胺?...

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披露声明

作者没有利益冲突可以披露。

致谢

我们感谢国家癌症研究所提供的财政支持, 提供 sc2ca206194。没有宣布相互竞争的金融利益。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		ANASPEC INC.:AS-20376SPPS
4-well chamber confocal dishLab-Tek II, Thermo Fisher Scientific154526For imaging
6-bromohexanoic acidChem-Impex INT’L INC.24477Click modification for peptide
A2780Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai HospitalOvarian cancer cell line
Barnstead NanopureThermo FisherD11901water filtration system
BUCHI rotavapor R-3BuchiZ568090For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 Reppendorf5811FFor platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99%Acros Organics19376-0050in vitro tests
CP70Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai HospitalOvarian cancer cell line
Digital water bathVWR97025-134For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS)Brookhaven Instrument CorporationFor nanoparticle size measurments
ES-2ATCCCRL-1978ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%Chem-Impex INT’L INC.00493SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g),Chem-Impex INT’L INC.01914SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%Alfa AesarH59730SPPS
HERACELL 150i CO2 incubatorThermo Scientific Fisherincubator
High pressure syringe pumpNew Era1010-USFor platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrerVWR12365-382For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647)Santa Cruz Biotechnologysc-18821 AF647For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)Oakwood Chemical005027SPPS
Ninhydrin 99%Alfa AesarA10409Kaiser test
Oleic acidChem-Impex INT’L INC.01421For platinum complex synthesis
OV90ATCCCRL-11732Ovarian cancer cell line
PBSCorning21-031-CVFor cell wash
Permount mounting mediumFisher ChemicalSP15-100For imaging
PhenolFisher ChemicalA92500Kaiser test
Phosphotungstic acidFisher ChemicalA248-25negative stain for TEM
Piperidine 99%BTC219260-2.5LSPPS
Platinum AAS standard soultionAlfa Aesar880861000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97%Alfa AesarL10595For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinetThermo Scientific Fisher1385Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum SystemWelch2028Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrateAcros Organics19768-0250Cisplatin activation
SKOV3ATCCHTB-77Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxideFisher ScientificS313-1For platinum complex synthesis
Tin (II) chlorideSigma Aldrich208256Test for Platinum presence
TOV21GATCCCRL-11730Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA)Alfa AesarL06374SPPS
Triisopropylsilane (TIPS)Chem-Impex INT’L INC.01966SPPS
Triton-XSigma AldrichT8787-100MLFor imaging
Uranine powder 40%Fisher ScientificS25328AFor alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO)SartoriousVS2001For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted MicroscopeVWR89404-462For cell culture monitoring

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