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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per sintetizzare una Nanoemulsione di un coniugato acido oleico acids-platinum(II) stabilizzato con un tripeptide di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Le forme di Nanoemulsione in condizioni blande sintetiche tramite auto-assemblaggio del KYF e il coniugato.

Abstract

Descriviamo un metodo per produrre una Nanoemulsione composto da un nucleo di acids-Pt(II) acido oleico e un rivestimento (KYF) di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE incapsula PT al 10% in peso, ha un diametro di 107 ± 27 nm e una carica negativa di superficie. KYF-Pt-NE è stabile in acqua e in siero ed è biologicamente attivo. La coniugazione di un fluoroforo di KYF permette la sintesi di una Nanoemulsione fluorescente che è adatto per l'imaging biologico. La sintesi del Nanoemulsione viene eseguita in un ambiente acquoso e le forme di KYF-Pt-NE via auto-assemblaggio di un peptide KYF breve e un coniugato acido oleico acids-platinum(II). L'auto-assemblaggio processo dipende la temperatura della soluzione, il rapporto molare dei substrati e la portata dell'aggiunta del substrato. Passi fondamentali includono mantenendo il tasso ottimale di agitazione durante la sintesi, permettendo un tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e pre-concentrando la Nanoemulsione gradualmente in un concentratore centrifugo.

Introduzione

Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'ingegneria di nanoparticelle per applicazioni biomedicali come consegna della droga e bioimmagini1,2,3,4. La multifunzionalità dei sistemi basati su nanoparticelle richiede spesso incorporando più componenti all'interno di una formulazione. I mattoni che si basano sui lipidi o polimeri spesso differiscono in termini di loro proprietà fisico-chimiche nonché loro biocompatibilità e biodegradabilità, che alla fine potrebbe influenzare la funzione della nanostruttura1, 5,6. Materiali biologicamente derivate, quali proteine e peptidi, hanno da tempo riconosciute come promettente componenti di nanostrutture multifunzionale a causa della loro sequenza flessibilità7,8. Peptidi assemblarsi in architetture supramolecolari altamente ordinate formando elicoidale nastri9,10, impalcature fibroso11,12e molti altri, aprendo così la strada alla costruzione nanostrutture ibride basate su biomolecole utilizzando un ascendente approccio13.

Peptidi sono stati esplorati per applicazioni in medicina e biotecnologia, soprattutto per la terapia anticancro14 e malattie cardiovascolari15 anche per quanto riguarda lo sviluppo antibiotico16,17, metabolica disturbi18e infezioni19. Ci sono oltre un centinaio di piccole-peptide terapeutica in fase di test clinici20. Peptidi sono facili da modificare e veloce di sintetizzare a basso costo. Inoltre, sono biodegradabili, che facilita notevolmente il loro applicazioni biologiche e farmaceutiche21,22. L'utilizzo di peptidi come componenti strutturali comprende l'ingegneria di nanoparticelle reattive, peptidici e idrogel depositi per rilascio controllato23,24,25,26 , 27, biosensori peptidici28,29,30,31o dispositivi bio-elettroniche32,33,34. Cosa importante, sono stati trovati anche brevi peptidi con due o tre residui dell'amminoacido che includono fenilalanina per guidare l'auto-assemblaggio elabora35,36,37 e creare emulsioni stabilizzate38 .

Farmaci a base di platino, a causa della loro alta efficacia, sono utilizzati in molti regimi di trattamento del cancro, sia da solo che in combinazione con altri agenti39,40. Composti del platino inducono danni al DNA formando legami incrociati monoadducts e intrastrand o interstrand. Le lesioni di Pt-DNA sono riconosciute dal macchinario cellulare e, se non riparato, portano all'apoptosi cellulare. Il meccanismo più importante, che contribuisce alla morte della cellula tumorale, PT è l'inibizione della trascrizione del DNA41,42. Tuttavia, i benefici della terapia di platino sono diminuiti di tossicità sistemica di PT che provoca gravi effetti collaterali. Questo porta a più basso dosaggio clinica di PT43, che si traduce spesso in concentrazioni sub-terapeutiche di platino raggiungendo il DNA. Di conseguenza, la riparazione del DNA che segue contribuisce alla sopravvivenza della cellula tumorale e l'acquisizione di resistenza Pt. La chemio-resistenza del platino è un problema importante nella terapia anticancro e la causa principale del trattamento fallimento44,45.

Abbiamo sviluppato una stabile irraggiungibili che incapsula l'agente PT al fine di fornire un effetto di schermatura nella circolazione sistemica e per diminuire gli effetti collaterali indotti da Pt II. Il sistema si basa su un nucleo di acido oleico acids-Pt(II) stabilizzato con un tripeptide KYF per formare una Nanoemulsione (KYF-Pt-NE)46. Gli elementi costitutivi di KYF-Pt-NE, gli aminoacidi del tripeptide, come pure l'acido oleico, hanno lo status di generalmente riconosciuti come sicuri (GRAS) con la Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE viene preparato utilizzando un metodo di nanoprecipitazione47. In breve, il coniugato acids-Pt(II) oleico è disciolto in un solvente organico e quindi aggiunto goccia a goccia di una soluzione acquosa di KYF (Figura 1) a 37 ° C. La soluzione è agitata per diverse ore consentire l'auto-assemblaggio di KYF-Pt-NE. La Nanoemulsione è concentrata in 10 kDa concentratori centrifughi e lavati tre volte con acqua. La modificazione chimica di KYF con un fluoroforo permette la sintesi di fluorescente FITC-KYF-Pt-NE adatto per imaging biomedico.

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Protocollo

1. sintesi del coniugato acido oleico Acids–Platinum(II)

  1. Attivazione di cisplatino
    1. Sospendere 50 mg (0.167 mmol) di cisplatino in 4 mL di acqua (ad es., nanopure) a 60 ° C.
    2. Aggiungere goccia a goccia 55,2 mg (0.325 mmol) di AgNO3 in 0,5 mL di acqua per la soluzione di cisplatino e mescolare la reazione per almeno 2 h a 60 ° C. Il precipitato bianco di AgCl formerà che indica l'avanzamento della reazione.
    3. Per determinare se la reazione di attivazione è stata completata, eseguire il test con 10% HCl per la presenza dello ione di Ag+ libero in soluzione. Il test dovrebbe essere negativo (nessun precipitato di AgCl ulteriore dovrebbe formare).
    4. Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 x g per 10 min e rimuovere il precipitato bianco di AgCl.
    5. Raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro di siringa di 0,2 mm. Testare il surnatante per la presenza di platino applicando 2-3 gocce della soluzione tramite pipetta Pasteur a SnCl2 cristalli. Il test è positivo se il colore del complesso delle coordinate di stagno con platino è giallo/arancione scuro.
    6. Utilizzare il surnatante con PT attivato per il secondo passaggio.
  2. Reazione dell'acido oleico con PT attivato
    1. Sospendere 94,2 mg di acido oleico (0.333 mmol) in 3 mL di acqua a 60 ° C.
    2. Aggiungere 13,3 mg (0.333 mmol) di NaOH in 1 mL di acqua e mescolare con la soluzione di PT attivato dal passaggio 1.1
    3. Mescolare la reazione per 2 h a 60 ° C e successivamente a temperatura ambiente durante la notte. Il prodotto grezzo è un precipitato oleoso di giallo/marrone.
    4. Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 x g per 10 min e rimuovere il surnatante. Asciugare il prodotto grezzo a 25 ° C, utilizzando un evaporatore rotante. Purificare il prodotto di diversi lavaggi con acetonitrile. Il colore finale di acids–Pt(II) acido oleico puro coniugato è giallo pallido.

2. sintesi di KYF-Pt-NE e la FITC-labeled Nanoemulsione FITC-KYF-Pt-NE

  1. Sintesi del tripeptide KYF e il tripeptide fluorescente contrassegnati FITC-KYF
    1. Sintetizzare il KYF utilizzando chimica standard del peptide a stato solido. Utilizzare il seguente standard condizioni di accoppiamento per collegare ogni amminoacido: Wang resina (2,19 mmol), Fmoc protetto amminoacido (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 mmol) e diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Sciogliere gli aminoacidi con TBTU in dimetilformammide (DMF) e DIPEA.
    2. Immergere 5,7 g di resina di Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol (0,382 meq/g) in 25 mL di DMF per 1 h prima dell'uso.
    3. DEPROTECT il gruppo amminico dell'aminoacido L-fenilalanina con 15 mL di soluzione al 20% piperidina/DMF per 5 min, scartare il solvente e ripetere il lavaggio con ciclo di 20 min.
    4. Lavare la resina per 1 min con i seguenti solventi: DMF, alcool isopropilico (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Eliminare il solvente dopo ogni lavaggio.
    5. Eseguire il test di Kaiser per determinare la presenza di gruppo di2 NH libero sulla resina (Vedi passaggi secondari) e se positivo (il seme di resina è viola), aggiungere l'aminoacido Fmoc-L-tirosina ed eseguire l'accoppiamento durante la notte.
      1. Preparare Kaiser soluzioni di test in bottiglie separate.
      2. Sciogliere 5 g di ninidrina in 100 mL di etanolo.
      3. Sciogliere 80 g di fenolo in 20 mL di etanolo.
      4. Mescolare 2 mL di soluzione acquosa 0,001 M di cianuro di potassio con
        98 mL di piridina.
      5. Aggiungere 2-3 gocce di ogni Kaiser testare soluzioni campione e calore in acqua bollente per 5 min.
    6. All'accoppiamento riuscito del secondo amminoacido, eseguire il test di Kaiser e se negativo procede con protocollo deprotezione (passaggi 2.1.3 per 2.1.5). Ripetere il processo con l'aminoacido Fmoc-fenilalanina.
      1. Al accoppiamento di tutti gli aminoacidi, lavare la resina per 1 min con 5 mL di DMF, IPA, DMF, metanolo, diclorometano ed etere etilico, dopo ogni lavaggio scartare il solvente. Salvare la resina per l'ulteriore elaborazione.
      2. Utilizzare la metà della resina per i passaggi successivi (2.1.7-2.1.9) per modificare il peptide con FITC. Per ottenere non modificato KYF tripeptide, seguire la procedura a partire da 2.1.10.
    7. Modificare l'amminoacido N-terminale di KYF KYF-N3 con acido 6-azidohexanoic. A tal fine, mescolare 1 g (0,382 mmol) di KYF Wang resina e 120,1 mg (0.764 mmol) di acido 6-azidohexanoic con 245,2 mg (0.764 mmol) di TBTU e mg 197,1 (1.528 mmol) di DIPEA in 30 mL di DMF. Mescolare la reazione durante la notte a temperatura ambiente.
    8. Ottenere il KYF-FITC dalla sintesi di KYF-N3 con fluoresceina propargile tramite una reazione di clic. A tal fine, è necessario mescolare 253 mg (0.097 mmol) di KYF-N3 Wang resina con 3,78 mg (0,019 mmol) di CuI tinta, 71,9 mg (0.193 mmol) di fluorescina propargile e 2,24 mg (0,017 mmol) di DIPEA. La reazione dovrebbe cambiare colore da verde a marrone.
    9. Dopo 24 h, lavare la resina per 1 min in alternanza con 5 mL di DMF e IPA cinque volte, acqua tre volte, DMF, metanolo e acqua tre volte e con diclorometano ed etere etilico tre volte. Eliminare il solvente dopo ogni lavaggio.
    10. Fendere il KYF-FITC o KYF peptide dalla resina con una soluzione di acido trifluoroacetico (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) / h2O al rapporto di 95/2.5/2.5 oltre 3 ore.
    11. Precipitare il peptide grezzo in un freddo etere etilico, lavare tre volte con etere freddo e quindi asciugare sotto il vuoto.
  2. Sintesi di Nanoemulsione FITC-KYF-stabilizzato con PT (FITC-KYF-Pt-NE) e KYF-Pt-NE
    1. Sciogliere 10 mg (0.0126 mmol) di acido oleico acids–Pt(II) coniugato in 1,5 mL di isopropanolo e posto in una siringa da 5 mL.
    2. Inserire la siringa con acido oleico acids–Pt(II) coniugato in una pompa a siringa e impostare il flusso a 0,1 mL/min.
    3. Al fine di sintetizzare la FITC-KYF-Pt-NE, sciogliere 1 mg (0.00105 mmol) di FITC-KYF e 1 mg (0.00219 mmol) di KYF (rapporto molare 1:2 di FITC-KYF:KYF) in 20 mL di acqua e regolare la temperatura della soluzione a 37 ° C. Ricoprono le pareti del contenitore con carta stagnola per evitare photobleaching del fluoroforo FITC. Per sintetizzare il KYF-Pt-NE, sciogliere 2 mg (0.0044 mmol) di tripeptide KYF in 20 mL di acqua e regolare la temperatura della soluzione a 37 ° C.
    4. Aggiungere il coniugato acido oleico acids–Pt(II) goccia a goccia la soluzione di FITC-KYF/KYF o KYF tripeptide. Eseguire questo passaggio sotto il cofano.
    5. Agitare la soluzione durante la notte a temperatura ambiente per far evaporare i solventi organici e per consentire l'auto-assemblaggio di FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-Nefi
    6. Concentrare la FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-NE in un concentratore centrifugo (10K MWCO) e lavare tre volte con 4 mL di acqua nanopure.
    7. Memorizzare le soluzioni acquose di KYF-Pt-NE e FITC-KYF-Pt-NE a 4 ° C.
    8. Analizzare per platino contenuto mediante spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), seguito guida48 del produttore.
      1. Preparare gli standard platino in soluzione di HCl 10% per la curva di taratura (gamma efficace per AAS è tra 100 a 1.200 ppb (parti per miliardo)).
      2. Sciogliere 50 µ l di soluzione di KYF-Pt-NE da passo 2.2 in 100 µ l di acqua regia (una miscela 3:1 di acido cloridrico concentrato e acido nitrico) e lasciare a temperatura ambiente per una notte. Aggiungere 850 µ l di acqua per raggiungere un volume di campione finale di 1 mL. Analizzare il campione utilizzando AAS. La concentrazione di acido finale dovrebbe essere il 10% in tutti i campioni analizzati.
      3. Registrare la lettura della concentrazione di Pt in ppb e calcolare il contenuto di platino finale del campione (l'account per la diluizione del campione e volume iniziale di Nanoemulsione).

3. confocale Imaging di assorbimento cellulare di FITC-KYF-Pt-NE

  1. 6 linee cellulari di cancro ovarico (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G ed ES2), di semi in 4 piatti confocale pozzo-camera alla densità di 4.7 x 104 cellule per camera e pre-cultura durante la notte a 37 ° C.
  2. Dopo 24 h, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tampone fosfato (PBS) e incubare con FITC-KYF-Pt-NE nel mezzo di coltura cellulare (Vedi punto 6.1 per cella linea dettagli specifici) per 15 min a 37 ° C.
  3. Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte con PBS.
  4. Fissare le cellule con metanolo freddo per 5 min a-20 ° C e lavare tre volte con 1 mL di PBS.
  5. Permeabilize le cellule con 1 mL di 0.1% Triton-X per 10 min a temperatura ambiente e lavare tre volte con 1 mL di PBS.
  6. Incubare le cellule per 90 min con LAMP1 anticorpo coniugato con Alexa Fluor 647 (1 mL) alle 01:50 diluizione in PBS a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule 3 volte con PBS.
  7. Diluire la soluzione di riserva DAPI (1 mg/mL) a 1 mg/mL in PBS. Aggiungere 1 mL della soluzione diluita per ogni camera, quindi incubare per 15 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 3 volte con PBS.
  8. Montare le lamelle su una diapositiva utilizzando il mezzo di montaggio.
  9. Immagine le celle utilizzando il microscopio confocale cellule vive a lunghezza d'onda di eccitazione di 405 nm, 488 nm e 633 nm. Impostare i parametri di rilevamento come segue: potere del laser da 0,2% e non più di 1%, Pinole 1 ariose unità, guadagno master 650-750, offset digitale 0.
  10. Aprire l'immagine nel software di imaging. In immagine visualizzata, selezionare grafica e selezionare Inserisci barra della scala, inserire la barra di scala per l'immagine.

4. drug Release studi

  1. Effettuare gli studi di rilascio del farmaco in PBS. Regolare i valori di pH di tre buffer di PBS a 7,4, 6.8 e 5.0 rispettivamente.
  2. Diluire 5 μL di KYF-Pt-NE in 180 μL di tampone PBS pH appropriato, trasferimento a 3,5 tazza di dialisi mini MWCO kDa e incubare a 37 ° C in PBS.
  3. Rimuovere il tampone da ogni tre tubi di dialisi mini a 2, 4, 6, 24, 48 e 140 h e misurare le concentrazioni di platino di AAS. Preparare tutti i campioni secondo passo 2.2.8 ma regolare il volume finale del campione a 500 µ l.

5. metodi di coltura cellulare

  1. Linee cellulari di cultura A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 nel medium di coltura cellulare (DMEM) completati con 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) o con 15% (TOV - 21G, OV-90) siero bovino fetale (FBS), con L-Glutammina e penicillina/streptomicina. Crescere in tutte le cellule in un 5% di CO2, atmosfera satura di acqua a 37 ° C.
  2. Cellule di seme 3 x 105 in ogni piastra a 96 pozzetti e pre-cultura durante la notte per gli esperimenti in vitro di incubazione. Preparare le soluzioni KYF-Pt-NE, cisplatino e carboplatino in acqua. Regolare la concentrazione di PT in KYF-Pt-NE per abbinare la concentrazione di carboplatino e cisplatino per ogni linea cellulare. Incubare per 72 ore a 37 ° C.
  3. Dopo l'incubazione, valutare la vitalità cellulare utilizzando un saggio colorimetrico (il saggio di proliferazione delle cellule di MTT). Brevemente, rimuovere il mezzo e aggiungere 110 μL di 10% MTT in mezzo ad ogni pozzetto ed incubare per 2 ore a 37 ° C. Quindi aggiungere detersivo di 100 μL in ogni pozzetto e incubare per 5 h a 37 ° C.
  4. Verifica l'assorbanza a 570 nm utilizzando il lettore di piastre. Analizzare i risultati usando l'analisi statistica con Z-test e P-test.

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Risultati

Immagine rappresentante TEM di KYF-Pt-NE preparato usando questo protocollo è mostrato nella Figura 2A. KYF-Pt-NEs sono sferici in morfologia, ben dispersero e di dimensioni uniformi. Il diametro del nucleo di KYF-Pt-NEs, misurata direttamente da tre immagini TEM con un minimo di 200 misure effettuate, è 107 ± 27 nm. Il diametro idrodinamico di KYF-Pt-NE, analizzato usando la spettroscopia luce dinamica (DLS), è stato trovato per essere 240 nm con un indi...

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Discussione

Fasi critiche nella sintesi Nanoemulsione includono il rapporto molare dei substrati di regolazione, mantenendo il controllo di tasso di flusso e temperatura durante l'aggiunta di acido oleico acids–Pt(II), fornire tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e purificare il prodotto utilizzando un colonna di concentratore centrifugo. Questi parametri influenzano le dimensioni e la morfologia di KYF-Pt-NE; Pertanto, è particolarmente importante mantenere il corretto rapporto molare e regolare correttamente le condizioni ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno un conflitto di interessi di divulgare.

Riconoscimenti

Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dal National Cancer Institute, concedere SC2CA206194. Concorrenti interessi finanziari non vengono dichiarati.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		ANASPEC INC.:AS-20376SPPS
4-well chamber confocal dishLab-Tek II, Thermo Fisher Scientific154526For imaging
6-bromohexanoic acidChem-Impex INT’L INC.24477Click modification for peptide
A2780Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai HospitalOvarian cancer cell line
Barnstead NanopureThermo FisherD11901water filtration system
BUCHI rotavapor R-3BuchiZ568090For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 Reppendorf5811FFor platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99%Acros Organics19376-0050in vitro tests
CP70Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai HospitalOvarian cancer cell line
Digital water bathVWR97025-134For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS)Brookhaven Instrument CorporationFor nanoparticle size measurments
ES-2ATCCCRL-1978ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%Chem-Impex INT’L INC.00493SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g),Chem-Impex INT’L INC.01914SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%Alfa AesarH59730SPPS
HERACELL 150i CO2 incubatorThermo Scientific Fisherincubator
High pressure syringe pumpNew Era1010-USFor platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrerVWR12365-382For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647)Santa Cruz Biotechnologysc-18821 AF647For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)Oakwood Chemical005027SPPS
Ninhydrin 99%Alfa AesarA10409Kaiser test
Oleic acidChem-Impex INT’L INC.01421For platinum complex synthesis
OV90ATCCCRL-11732Ovarian cancer cell line
PBSCorning21-031-CVFor cell wash
Permount mounting mediumFisher ChemicalSP15-100For imaging
PhenolFisher ChemicalA92500Kaiser test
Phosphotungstic acidFisher ChemicalA248-25negative stain for TEM
Piperidine 99%BTC219260-2.5LSPPS
Platinum AAS standard soultionAlfa Aesar880861000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97%Alfa AesarL10595For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinetThermo Scientific Fisher1385Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum SystemWelch2028Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrateAcros Organics19768-0250Cisplatin activation
SKOV3ATCCHTB-77Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxideFisher ScientificS313-1For platinum complex synthesis
Tin (II) chlorideSigma Aldrich208256Test for Platinum presence
TOV21GATCCCRL-11730Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA)Alfa AesarL06374SPPS
Triisopropylsilane (TIPS)Chem-Impex INT’L INC.01966SPPS
Triton-XSigma AldrichT8787-100MLFor imaging
Uranine powder 40%Fisher ScientificS25328AFor alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO)SartoriousVS2001For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted MicroscopeVWR89404-462For cell culture monitoring

Riferimenti

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