三维细胞培养中胰腺肌囊内增生的模拟与操纵

摘要

原代腺细胞分离、蛋白表达或活性调节、培养和下游应用在腺尖囊转牙 (adm) 的体外研究中非常有用, 这是胰腺癌发展的早期事件。

摘要

在胰腺炎和胰腺癌早期发展过程中, 腺形细胞向导管细胞的分化是一个需要进一步研究的关键过程。为了了解调节腺管间增生 (adm) 的机制, 与其他系统相比, 体内三维培养和原代腺细胞向导管细胞分化具有许多优势。利用本文的技术, 蛋白质表达的调节简单而快速, 只需一天就能分离、刺激或病毒感染, 并开始培养原代腺瘤细胞来研究 adm 过程。与使用基底膜基质不同的是, 在胶原蛋白 i 细胞外基质中的腺样体细胞簇的种子, 允许腺瘤细胞在操作前保留其腺瘤的同一性。在测试各种组件对 adm 诱导的贡献时, 这一点至关重要。细胞因子或其他外代给药因素的作用不仅可以通过这种技术进行测试, 而且普通突变、蛋白质表达增加或蛋白表达的击倒的贡献也可以通过病毒感染进行测试。原代腺泡细胞, 使用腺病毒或慢病毒载体。此外, 细胞可以重新从胶原蛋白或基底膜基质在终点, 并分析蛋白的表达。

引言

腺管转增生 (adm) 是胰腺炎期间的一种保护机制, 也是推动胰腺癌发展的关键过程^,需要进一步的机械洞察。虽然炎症引起的 adm 是可逆^{的 2}, 致癌kras突变, 存在于90% 的胰腺癌病例³, 防止分化回阿金纳表型 4^,5,6. 在三维培养中, 将原代腺细胞培养和分化为导管细胞, 可以研究调节 adm 过程的分子机制, 这在体内是很难研究的。这样的体外研究能够实时可视化 adm、其驱动程序和调节器。使用这里描述的方法确定或验证了 adm 过程的几个驱动因素, 以及对其下游信号通路的机械洞察。这些包括由 tgf-mediated (转化生长因子 alpha) 介导的 mmp-7 (基质金属蛋白酶-7) 表达诱导 adm 和激活诺奇 7, 以及 rantes (调节激活, 正常 t 细胞表达和分泌; 也已知作为趋化因子配体5或 cpl5) 和 tnfα (肿瘤坏死因子α)^通过激活 nf-b (核因子-b) 8 诱导的 adm。adm 的另一个介质是致癌 kras^9,10, 这导致氧化应激的上升, 通过增加 egfr (表皮生长因子受体) 及其配体的表达, egf (表皮生长因子) 和 tgf-α¹¹。

虽然胰腺癌细胞系的使用在体外研究中很常见, 但初级细胞培养提供了许多优势。例如, 来自非转基因小鼠或具有启动突变的小鼠的原代腺细胞, 如kras^g12d,是研究 adm 早期事件的最适当模型, 因为这些细胞很少有可控的突变, 这已知在胰腺癌的早期存在。这与许多胰腺癌细胞系形成鲜明对比, 这些细胞系有多种突变, 并根据^第12段的内容表达不同。此外, 通过这种手段确定的信号通路已通过动物研究得到验证。使用原代腺泡细胞的一个警告是, 它们不能像典型的癌症细胞系那样转染。

本文详细介绍了腺泡细胞分离技术、通过添加兴奋剂或通过腺病毒或慢病毒感染调节蛋白表达的3d 培养技术, 以及在终点重新分离细胞进行进一步分析的技术。

研究方案

所有的动物工作都得到了梅奥诊所 iacu 的批准。

1. 材料、溶液和三维矩阵基座的制备

1. 切割500μm 和105μm 聚丙烯以76毫米正方形格成76毫米。将每个正方形折叠两半, 以创建一个较小的折叠正方形。将一个500μm 和一个105μm 的网状方块放入可高压灭菌袋中。
2. 高压灭菌聚丙烯网方块, 以及两对剪刀和钳子。
3. 制作100毫升的 10倍 waymouth 溶液。将 waymouth 的粉末中加入50毫升的去离子水中, 并在溶解时加入30毫升的 7.5% (75 g/l) 碳酸氢钠。使用 di 水和过滤消毒, 使最终体积达到100毫升。
   1. 将 10倍 waymouth 的介质存放在 4°c, 并用于制备胶原蛋白凝胶和 1x waymouth 介质。当沉淀物形成时, 丢弃。
4. 加入125μl 的大豆胰蛋白酶抑制剂, 12.5 μl 的 4 mgml 地塞米松, 500μl 的胎牛血清 (fbs), 使每个胰腺 1x waymouth 的完整培养基50毫升。过滤消毒, 48小时内使用。
5. 使用胶原蛋白或基底膜基质准备三维基质碱 (产品信息见材料表)。移液基座时, 将板材放在冰上, 避免气泡, 并在移液每口井体积后立即旋转板, 以确保全覆盖。
   1. 通过在组织培养罩中将以下成分混合在冰上创建胶原蛋白碱: i 型大鼠尾胶原蛋白 5.5 ml, 10x waymouth 培养基 550μl, 0.34 m naoh (过滤) 366.6μl。
      请注意:这是足够的解决方案, 使胶原蛋白基地为一个24井, 12 井, 或6孔板。一个板就足以从一个胰腺中分离出。
   2. 使用以下体积对胶原蛋白基材进行平板: 80μl (8、8、两孔玻璃滑块)、200μl (24 孔板)、400μl (12 孔板) 或 800μl (6 孔板)。
   3. 对于基底膜基体基座, 在没有任何附加成分的情况下, 对基质进行移液。每口井使用以下体积: 50μl (8 孔玻璃滑块)、120μl (24 孔板)、240μl (12 孔板) 或 600μl (6 孔板)。
   4. 让碱基在细胞培养孵化器 (37°c, 5% co₂) 中凝固至少 30分钟, 然后在这些碱基之上创建第二层基质, 并将其嵌入细胞 (步骤 4)。
6. 在准备阿皮纳尔隔离保存一个600毫升烧杯, 三个50毫升管, 蒸压剪刀对, 蒸压钳, 和一个冰桶引擎盖下与三个称重船。然后, 将 hbss 的30毫升与300μl 的100x 青霉素链霉素制成, 将10毫升放入两艘称重船中, 并将最后的 10 ml 保持在 50 ml 管中 (用于步骤1.8.2 和 2.1.4)。
7. 使 hbss + 5% fbs 40 毫升, hbss 20 毫升 + 30% fbs, hbss 中的 2 mgml 胶原酶5毫升。过滤消毒胶原酶 (0.22μm 孔), 并保持室温。将每个 hbss 解决方案放在冰上。
8. 组装胰腺解剖工作区, 可在实验室工作台上完成。
   1. 将吸水垫放在桌子上, 并盖上铝箔的聚苯乙烯盖。然后在铝箔上放置一条有4个针脚的纸巾。
   2. 将以下物品保存在解剖工作区的范围内: 一个焚烧袋、一套蒸压剪刀和钳子、一个70% 乙醇的喷雾瓶和一个冰桶 (从步骤1.6 开始, 用 hbss 的50毫升管含有青霉素链霉素)。
9. 将离心机设置为 4°c, 将振动台设置为37°c。

2. 丙烯酰胺细胞分离

1. 通过 co2 诱导小鼠,并进行颈椎脱位。立即解剖胰腺。要解剖胰腺, 首先将鼠标的爪子固定在聚苯乙烯盖上, 将鼠标定位到尾巴面向研究人员的方向, 然后用70% 的乙醇喷洒腹部。
   注:在代表性结果中使用的鼠标是一个12周的非转基因女性与 c57bl6 背景。讨论部分将进一步讨论鼠标选择。
   1. 使用一套蒸压剪刀和钳子, 在中线用钳子提起皮, 并使用剪刀通过从尿道开口到隔膜胸腔区域的毛皮和皮肤做一个切口。
   2. 在左侧和右侧进行额外的切口, 以便将皮皮剪掉, 形成清晰的腹腔视图。然后, 切入腹膜衬里 (中间和左右), 把它从器官上拉出来, 就像用皮做的那样。
   3. 用钳子提起肠道, 并把它放在鼠标的左侧, 创造空间, 以看到胰腺, 这是浅粉色的颜色, 并附加到脾脏, 这是一个深红色的椭圆形。胰腺组织的特点是其柔软, 海绵状的纹理。切掉胰腺, 胰腺将沿着胃运行, 并与肠道交织在一起。
   4. 将脾脏从胰腺中分离。然后, 将胰腺放入含有10毫升 hbss 的50毫升管中, 并将其带到层流罩中。
      请注意:该协议的剩余步骤应在层流罩中使用无菌技术。
2. 将胰腺和 hbss (用青霉素链霉素) 倒进一艘空称重船, 用钳子用钳子将胰腺旋转干净。然后, 用钳子将胰腺移到第二艘含有 hbss 的称重船上 (用青霉素链霉素)。再次, 通过旋转清洗胰腺。
3. 将胰腺移动到第三个 hbss (用青霉素链霉素)------------------------------------------------------------------------------------------------------接下来, 将胰腺块和 hbss 倒入一个空的50毫升管中。
   1. 要做到这一点, 在称重船倾斜时, 用钳子将胰腺块移动到液体中。一旦所有的碎片不再附着在称重船上, 就把它倒出来。用钳子取起任何剩余的碎片, 用青霉素-链霉素清洗 hbss 中含有胰腺的50毫升管中的钳子。
4. 在4°c 下, 以 931 x克离心 2分钟, 然后用5毫升移液器将 hbss (和任何漂浮的脂肪) 移液离开。
5. 在胰腺中加入5毫升胶原酶 (在步骤1.7 中 hbss 中稀释)。通过用塑料石蜡膜包裹50毫升管, 然后将其放入孵化器中, 在37°c 下以220转/分晃动 20分钟, 以确保密封盖。
   请注意:正如讨论中所指出的, 胶原酶的消化时间可能会有所不同。在孵化结束时, 不应留下任何大块的组织。
6. 为了阻止离解, 将含胰腺管放在冰上, 加入5毫升的冷 hbss + 5% fbs。在4°c 条件下, 以 931 x克离心 2分钟, 然后使用5毫升管器将上清液移开。
7. 在4°c 下, 在 hbss + 5% fbs 和离心机中再置 10分钟, 在 931 x g下再进行2分钟。使用5毫升移液器将上清液移开, 然后用另外10毫升的 hbss + 5% fbs 重复此步骤。
8. 在5毫升的 hbss + 5% fbs 中进行再利用, 并使用 p1000, 一次通过500μm 网格将1毫升转移到 50 ml 管中。通过 p1000 网格添加额外的5毫升 hbss + 5% fbs, 通过网格清洗任何剩余的胰腺细胞。
9. 通过使用 p1000 一次移液1毫升, 将细胞悬浮液从500μm 网格穿过105μm 网格。接下来, 轻轻地将细胞悬浮液移入含有 hbss + 30% fbs 的管中。在顶部会形成一层细胞悬浮液;离心后, 腺形细胞就会下沉形成一个颗粒。
10. 在4°c 下, 以 233 x g 离心2分钟。取出上清液, 并在 1x waymouth 的完整介质中重新悬浮颗粒。
    1. 如果直接进入胶原蛋白或基底膜基质中的细胞嵌入, 则重新悬浮在每个胰腺7毫升的体积中。如果进入腺病毒或慢病毒感染, 在每胰腺4毫升中重新悬浮。

3. 病毒感染

1. 由于一个胰腺足以治疗两种病毒感染 (控制和实验, 例如 null 和 cre), 因此将细胞悬浮液在两个35毫米板的盖子之间分开。使用板的盖子可以在悬浮液中感染, 因此以后很容易移动到最终的基板上。
   1. 在使用病毒时, 将所有使用过的移液器吸嘴浸泡在10% 的漂白剂中至少15分钟。
      请注意:35毫米板和4毫升体积的使用对8至16周大的非转基因小鼠的细胞效果很好。对于胰腺较小或较大的动物, 可能需要调整板的大小和体积。
2. 对于腺病毒感染, 在1:1000 稀释时, 将病毒 (滴度至少为 10^{7 tuml} ) 添加到每个板和漩涡的盖子中 (图 2, gfp 腺病毒)。将钢板放入细胞培养孵化器 (37°c, 5% co₂), 每15分钟旋转一次, 持续孵育 2小时, 然后将细胞嵌入胶原蛋白或基底膜基质中。
3. 在引擎盖中完成病毒工作后, 用10% 的漂白剂将所有成分浸泡在引擎盖中至少 15分钟, 然后使用70% 的乙醇彻底清洁漂白剂。

4. 胶原蛋白或基底膜基质中细胞的嵌入

1. 结合7毫升 i 型大鼠尾胶原蛋白 (3.3 mg/ml)、10x waymouth 培养基700μl 和 0.34 m naoh 466.μl, 在冰上制作胶原蛋白凝胶。
2. 采取相同体积的胶原蛋白凝胶和细胞悬浮液, 轻轻混合。如果添加刺激或抑制剂, 将其与胶原细胞悬浮液结合使用。一次一个井的板材 (板材从步进 1.5.3);保持板在冰上, 旋涡均匀地分布胶原细胞层。
   1. 在每口井中, 将以下体积的胶原蛋白细胞悬浮液: 200μl (8 孔玻璃滑块)、500μl (24 孔板)、1000μl (12 孔板) 或 2000μl (6 孔板)。请注意, adm 是通过图 2中的 tgf-α (50 ngml) 刺激而产生的。
3. 对于基底膜基质中的细胞嵌入, 将单部分基底膜基质与两部分细胞悬浮液混合。与胶原蛋白一样, 保持基质细胞悬浮液以及冰上的板。一次用4.2.1 中提到的相同体积进行一次管道, 旋转均匀分布。
4. 将板材放入细胞培养孵化器 (37°c, 5% co₂) 30分钟, 固化, 然后在任何刺激或抑制剂中添加 1x waymouth 的完整培养基 (图 2使用 tgf-α在 50 ng/ml 时)。第二天改变介质 (有刺激或抑制剂), 然后每隔一天改变一次。根据刺激的不同, adm 可以在第3天和第5天之间观察到。

5. 从胶原蛋白或基底膜基质中收集细胞

1. 收集从胶原蛋白中提取细胞所需的下列材料: 在 hbss 中稀释的 1 mgml 胶原酶30毫升、在冷 hbss 中稀释的40毫升、31毫升的冷 pbs、两个 spatulas、两个 50 ml 管和冰。如果比较两个以上的培养条件 (每个条件都是一个板块的一半), 请调整喷丸的数量、管道和溶液的数量。将离心机设置为 4°c, 并将晃动孵化器设置为37°c。
2. 去除培养基, 然后使用 spatulas 去除嵌入细胞的胶原蛋白盘。对于每个条件, 将磁盘放入一个单独的、空的 50 ml 管中。
3. 在 hbss 中加入10毫升 1 mgml 胶原酶, 在每个 50 ml 管中加入。用塑料石蜡膜包裹管道, 并在225转/分的37°c 晃动孵化器中放置, 最长45分钟。监测消化和删除管时, 没有更多可见的胶原蛋白。
4. 在4°c 下以 233 x g离心 2分钟, 减速最小。脱下上清液, 在每管5毫升胶原酶溶液中重新悬浮。在25°c 晃动的孵化器中, 在225转/分或直到没有可见胶原蛋白时, 进行消化。
5. 通过加入5毫升的冷 hbss, 然后在4°c 下在 233 x g离心 2分钟, 并以最小的减速, 停止消化。
   1. 在15ml 冷 hbss 中再进行再离心, 在4°c 下进行 2分钟 , 减速最小。重复。
6. 将颗粒在 pbs 的1毫升中重新装中, 并转移到 1.5 ml 管。在233xg 的秋千桶中离心 2分钟, 4°c 时, 减速最小。在液氮或干冰中去除上清液和夹头。
   请注意:电池颗粒可存储在-70°c, 也可立即用于下游应用。
7. 为了收获基底膜基质嵌入细胞, 从每口井的移液培养基进入冰上的一个50毫升管。然后, 在每口井中加入基底膜基质回收液, 将细胞凝胶混合物刮入50毫升管中。
   请注意:添加到每口井的基底膜基质回收溶液体积如下: 150μl (8、8、孔玻璃滑块)、420μl (24 孔板)、845μl (12 孔板) 和 2000μl (6 孔板)。
8. 用基底膜基质回收溶液冲洗每口井两次, 将冲洗加入50毫升管。
   请注意:每次冲洗的基底膜基质回收溶液体积如下: 150μl (8 孔玻璃滑块)、420μl (24 孔板)、845μl (12 孔板) 和 2000μl (6 孔板)。
9. 将管放在冰上 1小时, 或直到基底膜基质溶解, 然后在4°c 下以 300 x g离心5分钟。取出上清液, 重新悬浮冷 pbs 1 毫升中的颗粒 (如果需要细胞颗粒, 可转移到 1.5 ml 管)。
10. 在4°c 下, 以 3, 500 x g 离心3分钟。取出上清液, 将细胞颗粒卡住冷冻, 或添加裂解缓冲液, 直接进入下游应用。

结果

完成协议在一天内, 并在刺激下, adm 是在3-5天内看到。图 1描述了该方法的顺序, 即在第一天完成步骤1到4。这包括制剂、腺苷类分离、病毒感染和嵌入胶原蛋白或基底膜基质。当基底膜基质诱导 adm 时, 胶原蛋白中的腺形细胞需要刺激, 如 tgf-α, 以进行分化到导管细胞。第1天, 胶原蛋白或基底膜基质中的细胞具有类似葡萄的圆形外观, 如果使用病毒感染...

讨论

分离、感染和电镀原代腺细胞的时间相对较短, 是这种方法的一个优势。相反, 从外植体生长中培养腺样细胞几乎不需要动手时间, 但腺细胞¹³的生长需要7天。一种用于腺法分离的替代协议¹⁴指出了获取腺酰亚耳细胞的一种非常短的方法;然而, egf 是使用该协议隔离时保持腺酰亚细胞存活的重要组成部分。由于 egf 刺激腺泡细胞向导管细胞分化, 本文的方法不需要 ad...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 °C shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator	NUAIRE	NU-5500
50 ml tubes	Falcon	352070
Absorbent pad, 20" x 24"	Fisherbrand	1420662
Adenovirus, Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Aluminum foil	Fisherbrand	01-213-101
BD Precision Glide Needle 21G x 1/2	Fisher Scientific	305167	Use as pins for dissection
Beaker, 600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
Bleach, 8.25%	Clorox	31009
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G	Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone	Sigma	D1756	Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C.
Ethanol, 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926-100mL
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Forceps	Fine Science Tools	91127-12
Glass slide, 8-well	Lab-Tek	177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red	Fisher Scientific	SH3048801
Ice bucket, rectangular	Fisher Scientific	07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisherbrand	01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)	Minigrip	SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower	Invitrogen	44-2050
Matrigel	Corning	356234	Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm	Bemis	PM992	Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS	Fisher Scientific	SH30028.02
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pipet tips, 10 µl	USA Scientific	1110-3700
Pipet tips, 1000 µl	Olympus Plastics	24-165RL
Pipet tips, 200 µl	USA Scientific	1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipettes, 10 ml	Falcon	357551
Pipettes, 25 ml	Falcon	357525
Pipettes, 5 ml	Falcon	357543
Plate, 12-well	Corning Costar	3513
Plate, 24-well plate	Corning Costar	3524
Plate, 35 mm	Falcon	353001
Plate, 6-well	Falcon	353046
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003-G	Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C.
Polypropylene Mesh, 105 µm	Spectrum Labs	146436
Polypropylene Mesh, 500 µm	Spectrum Labs	146418
Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8	Gibco	17075029
Spatula	Fisherbrand	21-401-10
Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters	Millipore	SCGP00525
TGF-α	R&D Systems	239-A-100
Type I Rat Tail Collagen	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder)	Sigma	W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium	Fisherbrand	02-202-101