Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

Zusammenfassung

Primäre acinar Zelle isoliert, Protein-Expression oder Aktivität-Modulation, Kultur und Downstream-Anwendungen eignen sich reichlich in der Ex Vivo Studie des acinar-duktale Metaplasie (ADM), einem frühen Ereignis in der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs.

Zusammenfassung

Die Differenzierung der acinar Zellen duktale Zellen bei Pankreatitis und in der frühen Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist ein Schlüsselprozess, die weitere Untersuchung erfordert. Um die Mechanismen zu verstehen bietet regulierende acinar-duktale Metaplasie (ADM), ex-Vivo-3D-Kultur und Differenzierung der primären acinar Zellen zu Duktuszellen viele Vorteile gegenüber anderen Systemen. Mit der Technik hierin ist die Modulation der Proteinexpression einfach und schnell, erfordert nur einen Tag zu isolieren, zu stimulieren oder Viral infizieren und Kultivierung der primäre acinar Zellen untersuchen die ADM-Prozess zu beginnen. Im Gegensatz zu mit Basalmembran Matrix, die Aussaat des acinar Zellcluster im Kollagen ich extrazellulären Matrix ermöglicht acinar Zellen behalten ihre acinar Identität vor Manipulation. Dies ist wichtig, beim Testen des Beitrags der verschiedenen Komponenten zur Induktion von ADM. Nicht nur sind die Effekte der Zytokine oder andere ectopically verabreichten Faktoren testbar durch diese Technik, sondern der Beitrag der gemeinsamen Mutationen, erhöhte Protein-Expression oder Knockdown von Protein-Expression ist überprüfbar über virale Infektion der primäre acinar Zellen, mit adenoviralen oder Lentivirale Vektoren. Darüber hinaus können Zellen von Kollagen oder Basalmembran Matrix am Endpunkt wieder isoliert und analysiert werden für Protein-Expression.

Einleitung

Acinar-duktale Metaplasie (ADM) ist ein Schutzmechanismus bei Pankreatitis und ein Schlüsselprozess fahren Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung¹ , das weitere mechanistische Einblicke erfordert. Während Entzündung induziert ADM reversibel², Onkogene KRAS -Mutationen, die in 90 % der Bauchspeicheldrüsenkrebs Fällen³vorhanden sind, zu verhindern, dass Differenzierung zurück zu einer acinar Phänotyp^{4,5, 6}. Culturing und Differenzierung der primäre acinar Zellen in duktale Zellen in 3D Culture ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung des ADM-Prozess, der schwierig ist, in-vivo Studie. Diese ex-Vivo-Studien ermöglichen Echtzeit-Visualisierung von ADM, seine Fahrer und ihre Aufsichtsbehörden. Mehrere Fahrer der ADM-Prozess sowie die mechanistische Einblicke auf ihre nachgeschaltete Signalwege identifiziert wurden oder verifiziert mit der hier beschriebenen Methode. Dazu gehören ADM Induktion durch TGF-α (transformierende Wachstumsfaktor Alpha)-vermittelten Expression von MMP-7 (Matrix Metalloproteinase-7) und Aktivierung des Notch-⁷sowie RANTES (reguliert auf Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert; auch bekannt als Chemokin Liganden 5 oder CCL5) und TNF (Tumor-Nekrose-Faktor Alpha)-induzierte ADM durch Aktivierung von NF-κB (nuclear Factor-κB)⁸. Ein zusätzliche Vermittler der ADM ist Onkogene KRas^9,10, die einen Anstieg der oxidativen Stress verursacht, das erhöht den ADM-Prozess durch erhöhte Expression von EGFR (Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) und seinen Liganden, EGF ( epidermalen Wachstumsfaktor) und TGF-α-¹¹.

Während der Nutzung der pankreatischen Krebszelllinien für in-vitro-Studien üblich, bieten primären Zellkulturen viele Vorteile. Zum Beispiel sind primäre acinar Zellen von nicht-transgenen Mäusen oder Mäuse beherbergen initiierende Mutationen, wie Kras^G12D, das am besten geeignete Modell für das Studium der frühen Veranstaltung von ADM, weil die Zellen verfügen über nur wenige und kontrollierte Mutationen, die sind dafür bekannt, bereits während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs vorhanden sein. Dies steht im Gegensatz zu vielen pankreatischer Krebs-Zelllinien, die mehrere Mutationen haben und abwechslungsreich Ausdruck basiert auf Durchgang Nummer¹². Darüber hinaus wurden die Signalwege identifiziert mit solchen Mitteln von tierexperimentellen Studien überprüft. Eine Einschränkung der Verwendung von primärer acinar Zellen ist, dass sie wie typische Krebszelllinien transfiziert werden können nicht.

Die Methode hierin beschreibt die Techniken der acinar Zelle isoliert, 3D Culture, die ADM imitiert, indem Stimulanzien oder Modulation der Proteinexpression durch adenoviralen oder Lentivirale Infektion sowie erneute Isolation von Zellen am Endpunkt für weitere Analysen.

Protokoll

Alle tierische Arbeit wurde von der Mayo Klinik IACUC genehmigt.

1. Vorbereitung des 3-dimensionalen Matrix Grundlagen, Materialien und Lösungen

1. Schneiden Sie 500 µm und 105 µm Polypropylen Netze in 76 mm 76 mm Quadrate. Falten Sie jedes Quadrat in der Mitte zweimal erstelle ich ein kleiner gefalteten Quadrat. Platz 1 500 µm und eine 105 µm mesh Platz in einem Beutel autoklavierbar.
2. Autoklaven Polypropylen mesh-Plätze sowie zwei Paare von Scheren und Pinzetten.
3. 100 mL 10 x Waymouth Lösung zu machen. Rühren Sie 1 Durchstechflasche (14 g) Waymouth Pulver in 50 mL entionisiertem Wasser (DI ein) und, als sich auflöste, 30 mL 7,5 % (75 g/L) Natriumbicarbonat. Bringen Sie das Endvolumen auf 100 mL mit DI Wasser und Filter zu sterilisieren.
   1. Speicher 10 X Waymouth bei 4 ° C und Nutzung, Kollagen Gele vorzubereiten und 1 X Waymouth Medien. Wenn Form, Ausscheidungen zu verwerfen.
4. 50 mL 1 x Waymouths kompletten Medien pro Bauchspeicheldrüse indem 125 µL 40 mg/mL Soja-Trypsin-Inhibitor, 12,5 µL Dexamethason 4 mg/mL und 500 µL des fetalen bovine Serum (FBS) zu machen. Sterilisieren durch Filtration und innerhalb 48 h.
5. 3-dimensionale Matrix Basen mit Kollagen oder Basalmembran Matrix vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien für Produktinformationen). Wenn die Basis pipettieren, platzieren Sie die Platte auf dem Eis, vermeiden Sie Luftblasen und drehen Sie die Platte sofort nach dem Pipettieren des Brunnens Volumen um volle Deckung zu gewährleisten.
   1. Kollagen-Grundlagen zu schaffen, durch Mischen der folgenden Komponenten auf dem Eis in einer Gewebekultur Kapuze: 5,5 mL Typ ich Ratte tail, Kollagen, 550 µL 10 x Waymouths Medien und 366.6 µL von 0,34 M NaOH (gefiltert).
      Hinweis: Dies ist genug Lösung Kollagen Grundlagen für eine 24-Brunnen, 12-Well oder 6-Well-Platte zu machen. Ein Teller ist ausreichend für acinar losgelöst von einem Pankreas.
   2. Verwenden Sie die folgenden Bände um die Kollagen-Bodenplatte: 80 µL (8-Brunnen Objektträger), 200 µL (24-Well-Platte), 400 µL (12-Well-Platte) oder 800 µL (6-Well-Platte).
   3. Für die Basalmembran Basen Matrix, Pipettieren der Matrix ohne zusätzlichen Komponenten. Verwenden Sie die folgenden Bände für jede Vertiefung: 50 µL (8-Brunnen Objektträger), 120 µL (24-Well-Platte), 240 µL (12-Well-Platte) oder 600 µL (6-Well-Platte).
   4. Lassen Sie die Grundlagen für mindestens 30 min. in einem Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂) erstarren vor dem Erstellen einer zweiten Schicht der Matrix mit eingebetteten Zellen auf diese Basen (Schritt 4).
6. Halten Sie in Vorbereitung für acinar Isolation einem 600 mL-Becherglas, drei 50 mL Röhrchen, autoklaviert Pair Schere, eine autoklaviert paar Zangen und einem Eiskübel unter der Haube mit drei Boote wiegen. Nehmen Sie dann 30 mL HBSS mit 300 µL von 100 X Penicillin-Streptomycin, 10 mL in jeweils zwei Boote wiegen und halten die letzten 10 mL in der Tube 50 mL (für den Einsatz in den Schritten 1.8.2 und 2.1.4).
7. Machen 40 mL HBSS + 5 % FBS, 20 mL HBSS + 30 % FBS und 5 mL 2 mg/mL Kollagenase in HBSS. Die Kollagenase durch Filtration (0,22 µm Pore) zu sterilisieren und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Halten Sie jede der HBSS Lösungen auf Eis.
8. Montieren Sie einen Arbeitsbereich für Bauchspeicheldrüse Dissektion, die auf einem Labortisch durchgeführt werden kann.
   1. Ort eine saugfähige Unterlage auf dem Tisch, zusammen mit einem Styropor Deckel bedeckt in Folie. Dann legen Sie ein Papiertuch mit 4 Pins auf die Folie.
   2. Halten Sie die folgenden Elemente innerhalb der Reichweite der Dissektion Arbeitsbereich: eine Verbrennung-Tasche, einen Satz von autoklaviert Scheren und Pinzetten, eine Sprühflasche mit 70 % Ethanol und einem Eiskübel (mit den 50 mL Tube HBSS mit Penicillin-Streptomycin aus Schritt 1.6).
9. Legen Sie eine Zentrifuge auf 4 ° C und einem Shaker auf 37 ° C.

(2) acinar Zelle isoliert

1. Opfern Sie die Maus über CO₂ Induktion zu, und führen Sie zervikale Dislokation. Sofort sezieren der Bauchspeicheldrüsenkrebs. Sezieren die Bauchspeicheldrüse, die ersten Pin die Pfoten der Maus auf das Styropor Deckel, die Maus zu orientieren, so dass das Heck den Forscher steht und sprühen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol.
   Hinweis: die Maus in die repräsentativen Ergebnisse verwendet wurde ein 12 - Wochen alten nicht-transgenen Weibchen mit C57BL/6 Hintergrund. Mausauswahl ist weiter im Abschnitt Diskussion erörtert.
   1. Mit einem Satz von autoklaviert Scheren und Pinzetten, heben Sie die Fell/Haut mit der Zange an der Mittellinie und verwenden Sie die Schere, um einen Schnitt durch das Fell und Haut von der Harnröhrenöffnung zum Bereich Zwerchfell/Brustkorb zu machen.
   2. Weitere Einschnitte nach links und rechts so gestalten, dass die Fell/Haut geritzt ist Weg, um eine klare Sicht im Bauchraum zu erstellen. Dann schneiden Sie in die peritoneale Auskleidung (in der Mitte und rechts und links) und ziehen Sie es weg von den Organen, wie mit dem Fell/Haut getan wurde.
   3. Heben Sie den Darm mit der Zange und legen Sie es auf der linken Seite der Maus schaffen Raum um die Bauchspeicheldrüse zu sehen, die Licht in der Farbe rosa, und befestigt, die Milz, die eine dunkle rote Oval ist. Die Bauchspeicheldrüse-Gewebe zeichnet sich durch seine weiche, schwammige Beschaffenheit. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse, die läuft entlang den Magen und verflechten sich mit dem Darm.
   4. Trennen Sie die Milz aus der Bauchspeicheldrüse. Dann legte der Bauchspeicheldrüsenkrebs in ein 50 mL-Tube mit 10 mL HBSS mit 1 X Penicillin-Streptomycin und bringen diese in die Laminar-Flow-Haube.
      Hinweis: Die verbleibenden Schritte des Protokolls sollte unter Verwendung sterilen Technik in einem Laminar-Flow-Abzug erfolgen.
2. Gießen Sie die Bauchspeicheldrüse und HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) in ein leeres Boot wiegen und mit Pinzette, die Bauchspeicheldrüse durch Schütteln es waschen. Verschieben Sie dann die Bauchspeicheldrüse mit der Pinzette ein zweites Boot mit HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) wiegen. Wieder, Waschen der Bauchspeicheldrüsenkrebs durch Umschwenken.
3. Verschieben die Bauchspeicheldrüse, der dritte HBSS (mit Penicillin-Streptomycin)-Boot mit wiegen und beginnen, schneiden die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke von 5 mm oder weniger. Anschließend gießen Sie die Bauchspeicheldrüse Stücke und HBSS in eine leere 50 mL-Tube.
   1. Zu diesem Zweck, verwenden Sie die Zange die Bauchspeicheldrüse Stücke in die Flüssigkeit bewegen, wie das Wiegen Boot angespitzt wird. Gießen Sie einmal alle Stücke nicht mehr zum Wiegen Boot befestigt sind. Nehmen Sie Reststücke mit der Zange und waschen Sie die Zange in der 50 mL-Tube mit der Bauchspeicheldrüse in HBSS mit Penicillin-Streptomycin.
4. 931 X g für 2 min bei 4 ° C zentrifugiert und dann die HBSS (und jedes Fett, das schwebt) entfernen, indem es Sie mit einer 5-mL-Pipette pipettieren.
5. Die Bauchspeicheldrüse fügen Sie 5 mL Kollagenase (verdünnt in HBSS im Schritt 1,7 hinzu). Gewährleisten Sie einen abgedichteten Deckel durch Umwickeln der 50 mL Tube in Kunststoff Paraffin Film und dann legen Sie es in einem Inkubator Schütteln bei 220 u/min für 20 min bei 37 ° C.
   Hinweis: Die Kollagenase Aufschlusszeit kann variieren, wie in der Diskussion erwähnt. Am Ende der Inkubationszeit sollte keine große Stücke des Gewebes bleiben.
6. Um die Dissoziation zu stoppen, das Pankreas-haltigen Rohr auf Eis legen und 5 mL kalte HBSS + 5 % FBS. Zentrifugieren Sie bei 931 X g für 2 min bei 4 ° C und dann Pipettieren aus der Überstand mit einer 5 mL pipettieren.
7. Aufschwemmen Sie in 10 mL HBSS + 5 % FBS und Zentrifuge bei 931 X g für 2 min bei 4 ° C. Pipettieren der Überstand mit einer 5 mL Pipettieren ab und wiederholen Sie diesen Schritt mit einem anderen 10 mL HBSS + 5 % FBS.
8. In 5 mL HBSS + 5 % Aufschwemmen FBS und mit einem P1000 übertragen 1 mL gleichzeitig durch ein Netz von 500 µm in einer 50 mL-Tube. Fügen Sie eine zusätzliche 5 mL HBSS + 5 % FBS durch das Gitter mit einem P1000, alle übrigen Zellen der Bauchspeicheldrüsen durch die Maschen zu waschen.
9. Setzen Sie die Zellsuspension aus dem 500 µm-Netz durch das Gitter 105 µm durch Pipettieren 1 mL zu einem Zeitpunkt mit einem P1000. Weiter, sanft pipettieren die Zellsuspension in ein Rohr mit HBSS + 30 % FBS. Eine Zellsuspension wird an der Spitze bilden; bei der Zentrifugation sinkt die acinar Zellen um eine Kugel zu bilden.
10. Zentrifuge bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen das Pellet in 1 x komplette Media Waymouth.
    1. Wenn Sie direkt zur Einbettung der Zellen in Kollagen oder Basalmembran Matrix fortfahren, in einem Volumen von 7 mL pro Bauchspeicheldrüse aufzuwirbeln. Wenn adenoviralen oder Lentivirale Infektion ausgehend, in 4 mL pro Bauchspeicheldrüse aufzuwirbeln.

(3) Virusinfektion

1. Wie ein Pankreas ausreichend für zwei Virusinfektionen ist (Kontrolle und experimentell, z. B. Null und Cre), teilen die Zellsuspension zwischen den Deckeln aus zwei 35-mm-Platten. Des Deckels der Platten ermöglicht eine Infektion in Federung und daher leichte Bewegung auf das letzte Substrat später.
   1. Beim Arbeiten mit Virus einweichen Sie alle verwendeten Pipettenspitzen in 10 % Bleichmittel für mindestens 15 Minuten.
      Hinweis: Nutzung von den 35-mm-Platten und 4 mL Volumen eignet sich gut für Zellen von nicht-transgenen Mäusen zwischen 8 und 16 Wochen alt. Die Plattengröße und das Volumen können für Tiere mit kleineren oder größeren Bauchspeicheldrüse angepasst werden müssen.
2. Adenovirale Infektion das Virus hinzufügen (mit einem Titer von mindestens 10⁷ TU/mL) bei einem 1:1,000 Verdünnung auf den Deckel der einzelnen Platte und wirbeln (Abbildung 2, GFP Adenoviren). Legen Sie die Platten in eine Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂) und wirbeln alle 15 Minuten für 1 h weiter Inkubation für weitere 2 h und dann zur Einbettung der Zellen im Kollagen oder Basalmembran Matrix.
3. Nach Abschluss der viralen arbeiten in der Kapuze, mindestens 15 Minuten einweichen Sie alle Komponenten in der Haube mit 10 % Bleichmittel und dann reinigen Sie das Bleichmittel mit 70 % igem Ethanol.

4. die Einbettung von Zellen in Kollagen oder Basalmembran Matrix

1. Machen Kollagen Gel auf Eis durch die Kombination von 7 mL Typ-I-Ratte Schweif Kollagen (3,3 mg/mL), 700 µL 10 x Waymouths Medien und 466.6 µL von 0,34 M NaOH.
2. Unter gleichen Volumina von Kollagen Gel und Zelle Federung, vorsichtig mischen. Wenn Sie eine Anregung oder Inhibitor hinzufügen, kombiniert mit der Kollagen-Zellsuspension. Platte einen Brunnen zu einem Zeitpunkt (Platten aus Schritt 1.5.3); halten Sie die Platte auf dem Eis, Wirbel um die Kollagen-Zellschicht gleichmäßig zu verteilen.
   1. In jede Vertiefung Pipettieren folgende Mengen an Kollagen-Zellsuspension: 200 µL (8-Brunnen Objektträger), 500 µL (24-Well-Platte), 1000 µL (12-Well-Platte) oder 2000 µL (6-Well-Platte). Beachten Sie, dass ADM über Stimulation mit TGF-α induziert wird (50 ng/mL) in Abbildung 2.
3. Zur Einbettung der Zellen in der Basalmembran Matrix mischen Sie einteilige Basalmembran Matrix mit zwei Teile Zellsuspension. Wie bei Kollagen, halten Sie die Matrix-Zellsuspension sowie der Platte auf dem Eis. Pipettieren eine gut zu einem Zeitpunkt mit der gleichen Volumina in 4.2.1 und Wirbel für eine gleichmäßige Verteilung festgestellt.
4. Platzieren Sie die Platte in eine Zelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂) für 30 min, um zu festigen und fügen Sie dann 1 x Waymouths kompletten Medien mit Impuls oder Inhibitor (Abbildung 2 Verwendungen TGF-α bei 50 ng/mL). Wechseln Sie das Medium (mit Impuls oder Inhibitor), am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag. Je nach den Reiz kann zwischen 3 und Tag 5 ADM beobachtet werden.

5. Ernte Zellen Kollagen oder Basalmembran Matrix

1. Sammeln Sie die folgenden Materialien, die für die Ernte der Zellen von Kollagen benötigt: 30 mL 1 mg/mL Kollagenase in HBSS, 40 mL kalte HBSS, 31 mL kaltem PBS, zwei Spachteln, zwei 50 mL Röhrchen und Eis verdünnt. Passen Sie die Anzahl der Spatel, Röhren und Menge an Lösungen, wenn mehr als zwei Kulturbedingungen vergleichen (wobei jede Bedingung ist ½ von einer Platte). Die Zentrifuge auf 4 ° C und schütteln Inkubator auf 37 ° C.
2. Entfernen Sie das Medium und verwenden Sie Spatel, um die Kollagen-Datenträger mit eingebetteten Zellen zu entfernen. Für jede Bedingung, legen Sie die Scheiben in eine Separate leer 50 mL-Tube.
3. Jeweils 50 mL-Tube 10 mL von 1 mg/mL Kollagenase in HBSS hinzufügen. Wickeln Sie die Rohre mit Kunststoff Paraffin Film und steckte in einem 37 ° C Inkubator bei 225 u/min für bis zu 45 Minuten schütteln. Überwachen Sie die Verdauung und entfernen Sie Rohre zu, wenn es nicht mehr sichtbar Kollagen ist.
4. Zentrifugieren Sie bei 233 X g bei 4 ° C für 2 min mit minimaler Verzögerung. Der Überstand abnehmen und in 5 mL Kollagenase Lösung pro Röhre aufzuwirbeln. In einem 37 ° C schütteln Inkubator bei 225 u/min für 10 min oder bis es keine sichtbaren Kollagen gibt zu verdauen.
5. Stoppen Sie die Verdauung durch Hinzufügen von 5 mL kalte HBSS und anschließend Zentrifugieren bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung.
   1. In 15 mL kalte HBSS Aufschwemmen und erneut Zentrifugieren bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung. Den Vorgang wiederholen.
6. Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL PBS und nach 1,5 mL-Tube. Zentrifuge in einem Schwung Eimer bei 233 X g für 2 min bei 4 ° C mit minimaler Verzögerung. Entfernen Sie überstand und Snap-Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis.
   Hinweis: Die Zelle Pellet kann bei-70 ° C gelagert oder sofort im Downstream-Anwendungen verwendet werden.
7. Basalmembran Matrix eingebettet Zellen, Pipettieren Medien aus jedem Brunnen in ein 50 mL Röhrchen auf dem Eis zu ernten. Dann fügen Sie Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung in jede Vertiefung und kratzen Sie die Zelle-Gel-Mischung in der 50 mL Tube.
   Hinweis: Das Volumen der Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung hinzufügen, zu jedem Brunnen ist wie folgt: 150 µL (8-Brunnen Objektträger), 420 µL (24-Well-Platte), 845 µL (12-Well-Platte) und 2.000 µL (6-Well-Platte).
8. Spülen Sie nun zweimal mit der Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung, die 50 mL-Tube die Spülungen hinzufügen.
   Hinweis: Das Volumen der Basalmembran Matrix-Recovery-Lösung für jede Spülung ist wie folgt: 150 µL (8-Brunnen Objektträger), 420 µL (24-Well-Platte), 845 µL (12-Well-Platte) und 2.000 µL (6-Well-Platte).
9. Lassen Sie das Rohr auf Eis für 1 h oder, bis die Basalmembran Matrix löst sich auf und folgen Sie mit Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° c Den Überstand zu entfernen und erneut das Pellet in 1 mL kaltem PBS (möglicherweise auf 1,5 mL-Tube übertragen, wenn Zelle Pellet gewünscht wird).
10. Zentrifuge bei 3.500 X g für 3 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen und entweder Snap Einfrieren der Zelle Pellet oder Lyse Puffer und fahren Sie direkt mit downstream-Anwendungen.

Ergebnisse

Fertigstellung des Protokolls hierin erfolgt innerhalb eines Tages und nach Stimulation, ADM ist in 3-5 Tagen zu sehen. Abbildung 1 zeigt den Ablauf des Verfahrens, wobei die Schritte 1 bis 4 am ersten Tag abgeschlossen sind. Dazu gehören Vorbereitung, acinar Isolation, Virusinfektion und Einbettung in Kollagen oder Basalmembran Matrix. Während die Basalmembran Matrix ADM induziert, acinar Zellen innerhalb Kollagen ich benötige einen Reiz, wie TGF-α, unte...

Diskussion

Die relativ kurze Zeitspanne für Isolation, Infektion und Plattieren primäre acinar Zellen ist ein Vorteil dieser Methode. Im Gegensatz dazu Kultivierung acinar Zellen aus einem modellabhängigen Auswuchs erfordert wenig Arbeitsaufwand beträgt, aber es dauert sieben Tage für Auswuchs von acinar Zellen¹³. Ein alternatives Protokoll für acinar Isolierung¹⁴ weist eine sehr kurze Methode zur Erlangung acinar Zellen; EGF ist jedoch ein wesentlicher Bestandteil in lebendig a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 °C shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator	NUAIRE	NU-5500
50 mL tubes	Falcon	352070
Absorbent pad, 20" x 24"	Fisherbrand	1420662
Adenovirus, Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Aluminum foil	Fisherbrand	01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2	Fisher Scientific	305167	Use as pins for dissection
Beaker, 600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
Bleach, 8.25%	Clorox	31009
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G	Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone	Sigma	D1756	Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C.
Ethanol, 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926-100mL
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Forceps	Fine Science Tools	91127-12
Glass slide, 8-well	Lab-Tek	177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red	Fisher Scientific	SH3048801
Ice bucket, rectangular	Fisher Scientific	07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisherbrand	01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)	Minigrip	SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower	Invitrogen	44-2050
Matrigel	Corning	356234	Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm	Bemis	PM992	Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS	Fisher Scientific	SH30028.02
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pipet tips, 10 µL	USA Scientific	1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL	Olympus Plastics	24-165RL
Pipet tips, 200 µL	USA Scientific	1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL	Gilson	F123601
Pipettes, 10 mL	Falcon	357551
Pipettes, 25 mL	Falcon	357525
Pipettes, 5 mL	Falcon	357543
Plate, 12-well	Corning Costar	3513
Plate, 24-well plate	Corning Costar	3524
Plate, 35 mm	Falcon	353001
Plate, 6-well	Falcon	353046
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003-G	Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C.
Polypropylene Mesh, 105 µm	Spectrum Labs	146436
Polypropylene Mesh, 500 µm	Spectrum Labs	146418
Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8	Gibco	17075029
Spatula	Fisherbrand	21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters	Millipore	SCGP00525
TGF-α	R&D Systems	239-A-100
Type I Rat Tail Collagen	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder)	Sigma	W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium	Fisherbrand	02-202-101