Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

Özet

Birincil acinar hücre izolasyon, protein ifade veya etkinlik modülasyon, kültür ve aşağı akış uygulamaları eski bol yararlı vivo çalışmada acinar-için-duktal metaplazi (ADM), pankreas kanseri gelişimi erken bir durumda.

Özet

Duktal hücreler acinar hücrelere farklılaşma pankreatit sırasında ve pankreas kanseri erken gelişiminde daha fazla çalışma gerektirir anahtar bir süreçtir. Düzenleyen acinar-için-duktal metaplazi (ADM), ex vivo 3D kültür ve duktal hücreler birincil acinar hücrelere farklılaşma mekanizmaları anlamak için diğer sistemleri birçok avantaj sunar. İle burada, modülasyon protein ifade basit ve hızlı, ayırma, teşvik veya virally bulaştırmak ve ADM sürecini araştırmak için birincil acinar hücre kültürü çalışmalarının başlaması için sadece bir gün gerektiren bir tekniktir. Tohum kollajen acinar hücre kümelerinin ben hücre dışı matriks, membran matrisi kullanarak aksine manipülasyon önce acinar kimliklerini korumak acinar hücreleri sağlar. Bu adm indüksiyon için çeşitli bileşenleri katkısını sınarken önemlidir Sadece etkileri sitokinler veya ectopically yönetilen diğer faktörler bu tekniği ile test edilebilir, ancak ortak mutasyonlar, artan protein ifade veya nakavt protein ifade viral enfeksiyon test edilebilir birincil acinar hücreleri kullanarak Adenoviral veya lentiviral vektörel çizimler. Ayrıca, hücreleri kollajen veya membran matris uç noktada yeniden ayrılmış olabilir ve protein ifade için analiz edilebilir.

Giriş

Acinar duktal metaplazi (ADM) pankreatit ve bir anahtar oluşum daha fazla mekanik kavrama gerektirir pankreas kanseri geliştirme¹ sürüş sırasında koruyucu bir mekanizmadır. İltihap kaynaklı ADM tersinir²olmakla birlikte, pankreas kanseri durumlarda^%390 mevcut, oncogenic KRAS mutasyonlar farklılaşma başa bir acinar fenotip^4,5, önlemek ⁶. Culturing ve 3D kültür duktal hücre içine birincil acinar hücreleri ayırt sağlar içinde vivo çalışma zordur ADM süreci düzenleyen moleküler mekanizmaları çalışma için. Böyle ex vivo çalışmalar ADM, sürücülerinin ve onun regülatörleri gerçek zamanlı görselleştirme etkinleştirin. Çeşitli sürücüleri Mekanik kavrama üstünde onların aşağı akım sinyal yolları yanı sıra ADM işlemi tanımladığınızda veya doğrulanmış burada kullanarak yöntemi açıklanır. Bu ADM indüksiyon TGF-α (dönüştürme büyüme faktörü alfa) tarafından içerir-ifade MMP-7 (matriks metalloproteinaz-7) ve çentik⁷, hem de RANTES (harekete geçirmek üstünde normal T ifade ve salgılanan; Ayrıca bilinen hücre düzenlenir aktivasyonu aracılı kemokin ligand 5 veya CCL5) olarak ve TNFα (tümör nekrozis faktör alfa)-ADM NF-κB (nükleer faktör-κB)⁸aktivasyonu ile indüklenen. ADM ek bir arabulucu artırır artan ifade EGFR (epidermal büyüme faktörü reseptörü) ADM sürecinde ve ligandlar, EGF (oksidatif stres bir artış neden oncogenic KRas^9,10, bu Epidermal büyüme faktörü) ve TGF-α¹¹.

Pankreas kanseri hücre hatları kullanımı için tüp bebek çalışmalar ortak olmakla birlikte, birincil hücre kültürleri birçok avantaj sunar. Örneğin, birincil acinar sigara transgenik fareler veya Kras^G12Dgibi Başlatan mutasyonlar yataklık fareler hücreleri kaç ve kontrollü mutasyonlar, çünkü ADM erken olay eğitim için en uygun modeli hücrelerdir hangi erken pankreas kanseri gelişiminde mevcut olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak birden çok mutasyonlar var birçok pankreas kanseri hücre satırlar için bu ve çeşitli geçiş sayı¹²tarihinde temel ifade. Ayrıca, bu tür yöntemlerle tespit sinyal yolları hayvan çalışmaları tarafından doğrulanmıştır. Birincil acinar hücreleri kullanarak bir uyarı tipik kanser hücre hatları gibi onlar transfected değil mi.

Burada yöntemi acinar hücre izolasyon, ADM uyarıcılar ekleyerek veya protein ifade yolu ile adenoviral ya da lentiviral hastalık, hem hem daha fazla analizleri için uç noktada hücrelerinin yeniden yalıtım oransal taklit eden 3D kültür teknikleri ayrıntıları.

Protokol

Tüm hayvan iş Mayo Kliniği IACUC tarafından kabul edildi.

1. hazırlık malzemeleri, çözümleri ve 3 boyutlu matris bazlar

1. 500 µm ve 105 µm Polipropilen kafesler içine 76 mm tarafından 76 mm kareler kesin. Her kareye iki kez katlanmış bir daha küçük kare oluşturmak için ikiye katlayın. Yer bir 500 µm ve bir 105 µm kare bir autoclavable kese kafes.
2. Otoklav polipropilen mesh kareler yanı sıra iki çift makas ve forseps.
3. 10 Waymouth'ın çözüm x 100 mL olun. Waymouth'ın tozu 1 flakon (14 g) 50 mL deiyonize (DI) su karıştırın ve çözünmüş zaman 30 mL % 7,5 (75 g/L) sodyum bikarbonat ekleyin. Son hacim DI kullanarak 100 mL su getirin ve filtre sterilize.
   1. Mağaza 10 x Waymouth'ın medya 4 ° C ve kollajen jelleri hazırlamak için kullanın ve 1 x Waymouth'ın medya. Ne zaman precipitates formu, atmak.
4. 50 mL 1 x Waymouth'ın tam medya pankreas başı 40 mg/mL soya tripsin inhibitörü 125 µL, 4 mg/mL deksametazon 12.5 µL ve fetal Sığır serum (FBS) 500 µL ekleyerek olun. Filtrasyon tarafından sterilize ve 48 saat içinde kullanın.
5. Kollajen veya membran matrisi kullanarak 3 boyutlu matris üsleri hazırlamak (malzemeler tablo ürün bilgi için bakın). Ne zaman Bankası pipetting, plaka buza koyun, kabarcıklar önlemek ve hemen her kuyu birim tam kapsama sağlamak için pipetting sonra plaka döndürmek.
   1. Buz bir doku kültürü başlıklı aşağıdaki bileşenler karıştırılarak kollajen üsleri oluşturun: Ben fare türü 5.5 mL kuyruk kollajen, 10 Waymouth'ın medya x 550 µL ve 366.6 µL 0,34 M NaOH (filtre).
      Not: Kollajen üsleri bir 24-şey, 12-şey veya 6-şey plaka için yapmak için yeterli bir çözüm bu. Bir tabak bir pankreas acinar izolasyonu için yeterlidir.
   2. Kollajen Bankası plaka için aşağıdaki birimler kullanın: 80 µL (8-şey cam slayt), 200 µL (24-şey plaka), 400 µL (12-şey plaka) veya 800 µL (6-şey plaka).
   3. Membran için matris üsleri, damlalıklı matris diğer ek bileşenleri olmadan. Her şey için aşağıdaki birimler kullanın: 50 µL (8-şey cam slayt), 120 µL (24-şey plaka), 240 µL (12-şey plaka) veya 600 µL (6-şey plaka).
   4. Üstünde tepe-in bu üslerin (adım 4) katıştırılmış hücrelerle matris ikinci tabakası oluşturmadan önce en az 30 dakika bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂) için kuvvetlendirmek üsleri izin.
6. Acinar yalıtım için hazırlık bir 600 mL kabı, üç 50 mL tüpler, makas, pens autoclaved bir çifti ve nedense odamızda buz kovası üç tartmak tekne ile örtünün altına autoclaved bir çifti tutun. Sonra HBSS 30 mL 100 x penisilin-streptomisin 10 mL her iki tartmak tekne içine koyarak ve son 10 mL (kullanılmak üzere adım 1.8.2 ve 2.1.4) 50 mL tüp içinde tutmak, 300 µL ile yapın.
7. HBSS + 5 40 mL olun % FBS, HBSS 20 mL + %30 FBS ve 5 mL 2 mg/mL collagenase HBSS içinde de. Collagenase filtrasyon (0,22 µm gözenek) tarafından sterilize ve oda sıcaklığında tutmak. Her HBSS çözüm buz üzerinde tutun.
8. Bir laboratuvar tezgah üzerinde yapılabilir pankreas diseksiyon için bir çalışma alanı oluşturun.
   1. Yer bir emici Ped masada, polistren bir kapak ile birlikte folyo kaplı. Sonra bir kağıt havlu ile 4 PIN folyo üzerine yerleştirin.
   2. Aşağıdaki öğeler diseksiyon çalışma alanı ulaşmak içinde tutmak: bir ölü yakma çanta, bir dizi autoclaved makas ve forseps, bir sprey şişesinde % 70 etanol ile ve nedense odamızda buz kovası (ile penisilin-streptomisin adım 1.6 içeren HBSS 50 mL tüp).
9. Bir santrifüj 4 ° C ve bir shaker ile 37 ° c olarak ayarlayın

2. acinar hücre izolasyon

1. Fareyi CO₂ indüksiyon yoluyla kurban ve servikal çıkığı gerçekleştirin. Hemen pankreas incelemek. Pankreas, ilk PIN incelemek için belgili tanımlık paws polistren kapağı, fare kuyruğu araştırmacı karşı karşıya olduğu gibi fare gelecek şekilde yönlendirin ve karın % 70 etanol ile sprey.
   Not: C57BL/6 arka plan olan 12 - hafta eski bir transgenik olmayan dişi temsilcisi sonuçlarında kullanılan fare oldu. Fare seçimi daha fazla tartışma bölümünde açıklanır.
   1. Birtakım autoclaved makas ve forseps kullanarak, orta hat, forseps ile kürk/cilt kaldırın ve makas kürk ve diyafram/göğüs kafesi alanına üretral açılış deri yoluyla bir kesi yapmak için kullanın.
   2. Öyle ki kürk/deriyi kesme ek insizyon sol ve sağ olun uzak karın boşluğu açık bir görünümünü oluşturmak için. O zaman, periton astar (orta aşağı ve sağa ve sola) kesilmiş ve kürk/deri ile olduğu gibi uzak organlara, çekin.
   3. Bağırsak forseps ile Asansör ve pankreas görmek için alan oluşturma fare sol tarafına koymak, hangi ışık rengi pembe ve koyu kırmızı oval dalak için bağlı. Pankreas dokusu onun yumuşak, süngerimsi doku tarafından ayırt edilir. Hangi koşmak mide ve bağırsak ile iç içe pankreas kesip.
   4. Dalak, pankreas ayırın. O zaman, pankreas HBSS 10 mL 1 x penisilin-streptomisin ile içeren bir 50 mL tüp koymak ve bu laminar akış hood için getirdin.
      Not: Protokol kalan adımları kullanarak steril tekniği laminar akış başlıklı yapılmalıdır.
2. Pankreas dökün ve boş bir içine (ile penisilin-streptomisin) HBSS tekne tartmak ve forseps, kullanarak pankreas dönen tarafından yıkayın. Sonra bir saniye için forseps ile pankreas tartmak HBSS (penisilin-streptomisin) içeren tekne hareket. Yine, pankreas dönen tarafından yıkayın.
3. Üçüncü HBSS (ile penisilin-streptomisin) pankreas taşımak-tartmak içeren tekne ve 5 mm veya daha az küçük parçalara pankreas kesme başlar. Ardından, pankreas parçalar ve HBSS bir boş 50 mL tüp içine dökün.
   1. Bunu yapmak için forseps tartmak tekne uçlu olarak pankreas adet sıvı içine taşımak için kullanın. Tüm parçaları artık tartmak tekneye iliştirildikten sonra dökün. Forseps ile herhangi bir kalan parçaları toplamak ve HBSS pankreasta penisilin-streptomisin ile içeren 50 mL tüp forseps yıkayın.
4. Vasıl 931 x g 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi ve o kapalı 5 mL pipet ile pipetting tarafından HBSS (ve kayıp gidiyor gözlerimden herhangi bir yağ) kaldırın.
5. Collagenase (HBSS içinde adım 1.7 seyreltilmiş) 5 mL pankreas için ekleyin. 50 mL tüp Plastik parafin filmde sarma tarafından mühürlü kapak emin olun ve sonra 37 ° C'de 20 dk için 220 rpm'de sallayarak bir kuluçka yerleştirin
   Not: Tartışmada belirtildiği gibi collagenase sindirim zaman değişebilir. İnkübasyon sonunda, doku yok büyük parça kalması gerekir.
6. Ayrılma durdurmak için pankreas içeren tüp buza koyun ve soğuk HBSS + %5 5 mL ekleyin FBS. Vasıl 931 x g 4 ° C, sonra damlalıklı 5 mL damlalıklı kullanarak süpernatant kapalı 2 dk santrifüj kapasitesi.
7. HBSS + %5 FBS ve vasıl 931 x g santrifüj 4 ° C'de 2 min için 10 ml resuspend Damlalıklı 5 mL damlalıklı kullanarak süpernatant kapalı ve başka bir 10 mL HBSS + % 5 ile bu işlemi tekrarlayın FBS.
8. 5 mL HBSS + % 5 resuspend FBS, bir P1000 kullanarak transfer ve 1 mL 500 µm mesh ile bir seferde 50 mL tüp içine. HBSS + % 5 ek bir 5 mL ekleyin FBS üzerinden mesh mesh ile kalan herhangi bir pankreas hücreleri yıkamayı P1000 ile.
9. Hücre süspansiyon 500 µm kafes 105 µm kafes bir P1000 kullanarak bir zamanda tarafından pipetting 1 mL koymak. İleri, yavaşça damlalıklı hücre süspansiyon içeren HBSS + % 30 bir tüp içine FBS. Hücre süspansiyon tabakası üstünde oluşturacak; Santrifüjü acinar hücreleri bir Pelet oluşturmak için lavabo olacaktır.
10. 4 ° C'de 2 min için 233 x g , santrifüj Süpernatant çıkarın ve 1 x Waymouth'ın tam medya Pelet resuspend.
    1. Eğer doğrudan sıkıştırılma kollajen veya membran matris hücre için devam, pankreas başı 7 mL hacminde resuspend. Adenoviral ya da lentiviral hastalık devam Eğer pankreas başı 4 ml resuspend.

3. viral enfeksiyon

1. Bir pankreas iki viral enfeksiyonlar için yeterli olduğu gibi (denetim ve deneysel, örneğin, null ve cre), hücre süspansiyon iki 35 mm tabak kapakları arasında bölünmüş. Plakaların kapak kullanarak enfeksiyon süspansiyon ve daha sonra final substrat üzerine bu nedenle kolay hareket sağlar.
   1. Virüs ile çalışırken, tüm kullanılan pipet ipuçları % 10 çamaşır suyu içinde en az 15 dakika boyunca bekletin.
      Not: 35 mm plakalar ve 4 mL cilt hücrelerinden 8 ve 16 haftalık arasında sigara transgenik fareler için iyi çalışıyor. Plaka boyutu ve birim daha küçük veya daha büyük pancreata ile hayvanlar için ayarlanması gerekebilir.
2. Adenoviral enfeksiyon için virüs ekleyin (en az 10 titresi ile⁷ TU/mL) her kapak için bir 1:1,000 seyreltme, plaka ve (Şekil 2, GFP adenovirus) girdap. Tabakları (37 ° C, % 5 CO₂) bir hücre kültür kuluçka makinesine koyun ve 1 h. devam kuluçka için her 15 dakikada bir ek 2 h için girdap ve sıkıştırılma kollajen veya membran matris hücre için devam edin.
3. Kapüşonlu viral çalışma işlemini tamamladıktan sonra tüm bileşenleri başlıklı % 10 çamaşır suyu ile en az 15 dakika boyunca ıslatın ve % 70 etanol kullanarak kapalı çamaşır suyu iyice temizleyin.

4. sıkıştırılma kollajen veya membran matris hücre

1. 7 mL birleştirerek buz üzerinde olun kollajen jel tip ı sıçan kuyruk kollajen (3.3 mg/mL), 10 Waymouth'ın medya x 700 µL ve 466.6 µL 0,34 M NaOH.
2. Karışımı eşit miktarda kolajen jel ve hücre süspansiyon alarak, yavaşça. Eğer bir uyarıcı veya inhibitörü ekleyerek, bu kollajen-hücre süspansiyon ile birleştirin. Bir şey bir anda adım 1.5.3 (tabak); plaka plaka buz üzerinde tutarak, kollajen-hücre katmanı olarak dağıtabilmenizi girdap.
   1. Her iyi, damlalıklı aşağıdaki miktarda kolajen-hücre süspansiyon: 200 µL (8-şey cam slayt), 500 µL (24-şey plaka), 1000 µL (12-şey plaka) veya 2000 µL (6-şey plaka). ADM stimülasyon ile TGF-α ile indüklenen Not (50 ng/mL) Şekil2.
3. İçin sıkıştırılma hücre membran matris tek parça membran matris hücre süspansiyon iki-parçalar ile karıştırın. Kollajen gibi matris hücre süspansiyon yanı sıra plaka buz üzerinde tutun. Damlalıklı biri de bir anda 4.2.1 ve hatta dağıtım için girdap kaydetti aynı birimleri kullanma.
4. Bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂) plaka kuvvetlendirmek ve 1 x herhangi bir uyarıcı veya inhibitörü (Şekil 2 kullanır TGF-α, 50 ng/mL) ile Waymouth'ın tam ortam eklemek için 30 dk yerleştirin. Medya (uyarıcı veya engelleyici ile) ertesi gün ve daha sonra her gün değiştirin. Uyarıcı bağlı olarak ADM gün 3 ile 5 gün arasında görülebilir.

5. hasat hücreleri kollajen veya membran matris

1. Kollajen hücrelerden hasat için gerekli aşağıdaki malzeme toplamak: 1 mg/mL collagenase 30 mL soğuk PBS, iki spatula, iki 50 mL tüpler ve buz 31 mL soğuk HBSS, 40 mL HBSS içinde seyreltilmiş. Eğer ikiden fazla kültür koşulları (burada her koşul ½ plaka adıdır) karşılaştırma spatula, tüpler ve çözümleri miktarı sayısını ayarlayın. 4 ° C-santrifüj ayarlayabilirsiniz ve sallayarak kuluçka 37 ° C'ye
2. Medyayı çıkarın ve katıştırılmış hücreleri kollajen disklerle kaldırmak için spatula kullanın. Diskler ayrı bir koymak her koşul için 50 mL tüp boş.
3. 1 mg/mL collagenase 10 mL HBSS içinde her 50 mL tüp ekleyin. Tüpler plastik parafin film ile sarın ve 37 ° C kuluçka 225 devir / dakikada 45 dakika kadar sallayarak koymak. Sindirim izlemek ve daha fazla görünür kollajen tüpler kaldırın.
4. Vasıl 233 x g 4 ° c en az yavaşlama ile 2 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant almak ve 5 mL collagenase çözüm tüp başına resuspend. Kuluçka makinesi 10 dk ya kadar hiçbir görünür kollajen 225 devir / dakikada sallayarak 37 ° C olarak sindirmek.
5. 5 mL soğuk HBSS de ekleyerek ve sonradan vasıl 233 x g için en az yavaşlama ile 4 ° C'de 2 dk centrifuging sindirimi durdurmak.
   1. 15 mL soğuk HBSS resuspend ve daha vasıl 233 x g için en az yavaşlama ile 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi. Tekrar ediyorum.
6. Pelet 1 mL PBS resuspend ve 1,5 mL tüp taşıyın. Bir salıncak kova vasıl 233 x g için en az yavaşlama ile 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant ve ek-freeze sıvı azot veya kuru buzda kaldırın.
   Not: Hücre Pelet-70 ° C'de depolanan veya hemen aşağı akışı uygulamalarında kullanılan.
7. Membran matris gömülü hücreleri, buz üzerinde 50 mL tüp her kuyuya medyadan damlalıklı hasat için. Daha sonra her şey için membran matris kurtarma çözümü ekleyin ve hücre-jel karışımı 50 mL tüp kazımak.
   Not: Membran matris kurtarma çözümü için her şey aşağıdaki gibi eklemek hacmi: 150 µL (8-şey cam slayt), 420 µL (24-şey plaka), 845 µL (12-şey plaka) ve 2.000 µL (6-şey plaka).
8. Her biri 50 mL tüp durular ekleyerek de iki kez membran matris kurtarma çözümü, durulayın.
   Not: Birimin her durulama için membran matris kurtarma çözümü aşağıdaki gibidir: 150 µL (8-şey cam slayt), 420 µL (24-şey plaka), 845 µL (12-şey plaka) ve 2.000 µL (6-şey plaka).
9. Membran matris çözülür ve 300 x g 4 ° C'de 5 min için de aralıklarla takip kadar tüp veya 1 h için buza terk Süpernatant kaldırmak ve pelet 1 mL soğuk PBS (hücre Pelet isterseniz 1.5 mL tüp transferi) resuspend.
10. 4 ° C'de 3 min için 3.500 x g , santrifüj Süpernatant kaldırmak ve her iki ek hücre Pelet dondurmak veya lizis arabellek ekleyin ve doğrudan aşağı akım uygulamaya devam edin.

Sonuçlar

İletişim kuralı burada tamamlanması 1 gün içinde oluşur ve stimülasyon, ADM 3-5 gün içinde görülür. Şekil 1 sayede 1-4 arası adımları ilk gün tamamlandı yöntemi, dizi gösteriyor. Bu hazırlık, acinar yalıtım, viral enfeksiyon ve sıkıştırılma kollajen veya membran matris içerir. Kollajen acinar hücrelerde membran matris ADM neden olmaktadır, ben geçmesi bir uyarıcı, TGF-α gibi gerektirir duktal hücrelere farklılaşma. Gün...

Tartışmalar

Yalıtım, enfeksiyon ve birincil acinar hücreleri kaplama için nispeten kısa süreyi bu yöntemin bir avantajı var. Buna ek olarak, bir explant sonucu acinar hücrelerden kültür küçük eller zaman gerektirir, ama acinar hücreleri¹³akıbet için yedi gün alır. Acinar yalıtım¹⁴ için alternatif bir protokol acinar hücreleri elde etmek için çok kısa bir yöntem notları; Ancak, EGF acinar hücreleri hayatta ne zaman o protokolü kullanılarak izole tutmak ön...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 °C shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator	NUAIRE	NU-5500
50 mL tubes	Falcon	352070
Absorbent pad, 20" x 24"	Fisherbrand	1420662
Adenovirus, Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Aluminum foil	Fisherbrand	01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2	Fisher Scientific	305167	Use as pins for dissection
Beaker, 600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
Bleach, 8.25%	Clorox	31009
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G	Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone	Sigma	D1756	Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C.
Ethanol, 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926-100mL
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Forceps	Fine Science Tools	91127-12
Glass slide, 8-well	Lab-Tek	177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red	Fisher Scientific	SH3048801
Ice bucket, rectangular	Fisher Scientific	07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisherbrand	01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)	Minigrip	SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower	Invitrogen	44-2050
Matrigel	Corning	356234	Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm	Bemis	PM992	Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS	Fisher Scientific	SH30028.02
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pipet tips, 10 µL	USA Scientific	1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL	Olympus Plastics	24-165RL
Pipet tips, 200 µL	USA Scientific	1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL	Gilson	F123601
Pipettes, 10 mL	Falcon	357551
Pipettes, 25 mL	Falcon	357525
Pipettes, 5 mL	Falcon	357543
Plate, 12-well	Corning Costar	3513
Plate, 24-well plate	Corning Costar	3524
Plate, 35 mm	Falcon	353001
Plate, 6-well	Falcon	353046
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003-G	Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C.
Polypropylene Mesh, 105 µm	Spectrum Labs	146436
Polypropylene Mesh, 500 µm	Spectrum Labs	146418
Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8	Gibco	17075029
Spatula	Fisherbrand	21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters	Millipore	SCGP00525
TGF-α	R&D Systems	239-A-100
Type I Rat Tail Collagen	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder)	Sigma	W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium	Fisherbrand	02-202-101