从环境样品中筛选高通量的安德森菌: 植物组织、散装土壤和根际土壤

摘要

我们提出了一个快速筛选环境样品的协议, 以寻找有助于在陆地系统中实现微量营养素生物利用度和周转的环境样本。

摘要

在各种生态现象中, 从土壤中的铁 (fe) 生物地球化学循环, 到病原体竞争、植物生长促进和跨王国信号转形, 都具有重要的意义。此外, 在含金属矿物和矿石的生物浸出和生物聚集方面, 也具有商业利益。快速、具有成本效益和可靠的方法来定量评估复杂样品中的虹吸菌生产, 是确定基氏菌活性的生态影响的重要方面的关键, 包括生产新的差旅费的微生物。本文提出的方法是评估土壤或植物组织等环境样本中微生物群落的亲菌活性。样品在改性 m9 培养基 (无铁) 中均质稀释, 富集培养3天。使用一种新的96孔微板 cas (铬偶氮醇磺酸盐)-fe agar 法, 在24小时、48小时和 72小时 (h) 对样品中的硅粉产量进行了评估, 这是对传统上繁琐和耗时的色谱法评估西德多磷的一种适应活动, 在个别栽培的微生物分离体上进行。我们将我们的方法应用于4种不同的小麦基因型系, 包括 Lewjain、madsen和pi561725, 以及通常生长在内陆太平洋西北部的 pi561727。在观察到的特定类型的植物组织中, 小麦的基因型对类似物的生产有明显的影响。我们成功地利用我们的方法快速筛选植物基因型对土壤生产的影响, 这是陆地和水生生态系统中的一个关键功能。我们产生了许多技术复制, 在土壤和植物组织中产生了非常可靠的统计差异。重要的是, 结果显示, 该方法可用于快速检测复杂样品中的岩体生产, 具有高度的可靠性, 从而使社区能够保存下来, 以便以后进行识别分类群和功能基因的工作。

引言

Siderophores 是重要的生物分子, 主要涉及铁螯合的生物利用度, 但在陆地和水生生态系统中具有广泛的附加用途, 从微生物仲裁传感、信号到微生物植物宿主,复杂微生物群落内的植物生长促进、合作和竞争¹,²。虹旋动物可根据其活性位点和结构特点进行广泛分类, 形成四种基本类型: 羧酸盐、羟基酸盐、儿茶酚和 3^,4 型混合型。许多微生物能够排泄一种以上的类动物 5, 在复杂的群落中 , 绝大多数生物对膜受体进行生物处理, 以便吸收更多种类的虹吸 1^{, 6}。最近的工作表明, 在社区一级, 甚至在王国间的通信和生物地球化学转移^中, 西德罗帕特别重要, 7^{、8、9、10 ,11}。

硫化铬 (cas) 已被用作螯合剂, 以结合铁 (fe) 的方式, 增加配体 (即 siderophores) 可以导致 cas-fe 复合物的离解, 在培养基中产生很容易识别的颜色变化¹². 当 cas 与 fe 结合时, 染料以皇家蓝色的形式出现, 当 cas-fe 复合物分离时, 介质会根据用于清除 fe^{13 的}配体类型改变颜色。schwyn 和 neilands 于1987年建立的最初的液化培养基已在许多方面进行了修改, 以适应不断变化的微生物目标¹⁴、生长习惯和限制¹⁵, 以及除铁以外的各种金属, 包括铝、锰、钴、镉镍、锂、锌¹⁶、铜¹⁷, 甚至砷¹⁸。

许多人类病原体, 以及促进植物生长的微生物⁽pgpm) 已被确定为产生异种的生物 3^,19, 20, 重要的根际和内生 pgpm 经常测试对幼儿园生产呈阳性⁴。传统的铁基液体法已适用于种植中分离物的微滴法, 用于杀菌剂生产 21.然而, 这些技术没有认识到微生物群落作为一个整体 (微生物群) 的重要性, 在土壤和植物系统中的合作和潜在的生物群落^生产监管22。为此, 我们在传统 cas 检测的基础上, 开发了一种基于传统 cas 检测方法的特定环境下的高通量社区级的硅粉生产评估, 但在微板中具有复制、测量方便、可靠性和可重复性测定。

在这项研究中, 提出了一个具有成本效益的, 高通量 cas-fe 检测硅粉生产, 以评估丰富的硅粉生产从复杂的样品 (即土壤和植物组织同质)。从四个不同的小麦 (Lewjain、madsen、pi56725 和pi561727。据推测, 小麦基因型的根本差异可能导致在招募和选择亲体生产群落方面的差异。特别令人感兴趣的是与 pi561725 等基因系相关的微生物群落之间的差异, 该系与铝相比, 具有almt1 (铝活化麦芽运输器 1), 因此耐铝。敏感的 pi561727 等基因线, 它拥有一个非铝反应形式的基因, almt1^{23,24, 25,26}。这项研究的主要目的是开发一种简单、快速的方法, 定量评估复杂样品类型的 siderophore 丰富培养物中的亲菌产量, 同时保存这些培养物, 供今后的工作使用。

研究方案

注: 现场地点位置: 华盛顿州立大学植物病理学农场 (46°46'38.0"N 117°04'57.4"W)。2017年10月19日, 用机械播种机播种种子。每个小麦基因型都种植在头上, 相距约1米, 以避免根系重叠。2018年8月9日采集了植物和土壤样本, 届时植物已做好收获准备。从四个小麦基因型的三个副本中收集了样本: pi561727、pi561725、madsen、lewjain。

1. 改性 m9 介质的制备

1. 使用 na2 po₄* 7h2 o₍12.8 g/2 ml)、kh₂po 4 (0.3 g2, 200 ml)、ncl (0.5 g2, 200 ml) 和 nh₄cl (1 g/2) 试剂制备 mL 盐溶液。
2. 使用18克 mgso型 9h 2o 在100毫升的双去离子水 (ddh2o₎中制备 0.75 m mgso 4 *7h2o。
3. 通过添加 14.7 gccl * 22o_和100 ml 的 ddh 2H, 使ccl 2* 2h2o 的 1 m.
4. 将 6.0. 48 g 的管溶解在156毫升的 ddh2o 中搅拌, 制备缓冲液_.使用 5m naoh 将 ph 值调整为6.8。
5. 通过将20克葡萄糖溶解成100毫升的 ddh2o, 制备20% 的葡萄糖 (一水葡萄糖).
6. 准备解决方案和单独高压灭菌, 但葡萄糖。高压灭菌 (0.22μm) 后, 对葡萄糖溶液进行灭菌, 以添加到 m9 介质中。
7. 通过将 pipes 缓冲液的 156 ml、mL 盐溶液的 40 ml、ccl 2·2h 2H 溶液的20μl、mgso 4·7h2o 的266μl 和20% 葡萄糖溶液的4 ml 混合在一起制备改性的 mL 介质.柜, 使用无菌技术。
8. 为保存改性的 m9, 密封容器, 用铝箔覆盖, 以防止紫外线, 并放置在4°c。

2. cas-fe-agar 培养基的制备

1. 在 cas 检测中使用前, 在 100 mm hcl 100 mmhno₃中酸洗所有玻璃器皿至少2小时。
2. 准备一个充满实验室级沙子的铝制烤盘, 并用铝箔覆盖。在121°c 下的高压灭菌器 30分钟, 并放在一边。
3. 将 0.0365 g 添加到20毫升 ddh2o_,制备 hdtma (六烷基三甲基溴铵), 并将溶液置于 37°c, 以促进增溶。
4. 以 10 mm hcl 为溶剂制备 10 mm hcl 并生成 1 mm fcl 3·6h2o_.在用无菌磁搅拌棒轻轻搅拌时, 将 0.0302 g cas_加入25 毫升的 ddh2o。然后在 cas 溶液的25毫升中加入5毫升fecl 3·6h2o (10 mm hcl), 同时继续轻轻搅拌 (溶液变成深红色黑色).
5. 在轻轻搅拌的同时, 慢慢地将 hdtma 溶液的20毫升加入 fe-cas 溶液中 (这就产生了一个深蓝色的溶液)。
6. 将15.12 克的管材溶解到375毫升的 ddh2o 中, 轻轻搅拌, 制备缓冲液。使用 5m naoh 将 ph 值调整为6.8。加水, 使体积达到450毫升。在溶液中加入5克琼脂糖。在121°c 下对管板缓冲液和 cas-fe 溶液进行30分钟的高压灭菌。
7. 在每个方案都经过高压灭菌后, 请小心地将整个 cas-fe 解决方案添加到生物安全柜中的整个 pipes 缓冲器中。
8. 将混合溶液放在50°c 的水浴中。
   注: 在每次检测之前, 在 cas-fe-agar 介质中快速制备所有试剂, 因为在50°c 下的长期储存会导致 cas-fe 复合物的沉淀, 并在凝固介质中冷却。
9. 将无菌试剂船放置在生物安全柜中的无菌砂中, 加热至50°c。将 cas-fe-agar 转移到船上, 然后在一个清晰的、平底的、无菌的96孔微板中快速将100μl 输送到每口井。

3. Pyoverdine/EDTA 标准制剂

1. 吡咯烷酮制剂
   1. 在以前制备的改性 m9 培养基中制备800μm 吡咯烷酮标准 (琥珀酸、2-羟基谷氨酰胺和琥珀氨酸形式的吡咯烷酮的混合物)。
   2. 将此解决方案稀释为400、200、100、50、25、12.5 和6.25μm 解决方案。
2. edta 标准制备
   1. 加入0.594 克乙二胺四乙酸 (edta:c₁₀h 14 n 2 na 2o 8. 2h2 o),加入 500毫升, 制备 3200μm edta 标准.
   2. 将此解决方案稀释为1600、800、400、200、100、50、25、12.5 和6.25μm 解决方案。
3. 标准曲线生成
   1. 加入每浓度吡咯烷酮和 edta 100μl, 分离含有 100μl cas-fe 琼脂培养基的96孔微板的井。对每个浓度进行重复的技术复制。此外, 添加只有 m9 (没有 edta 或吡咯烷酮) 的空白井。
   2. 使用微板读取器, 测量在22°c 孵育1小时、6小时和24小时后的吸收率 (在420纳米和665纳米), 并使用吸收率测量生成标准曲线。
      注: 对于420纳米测量, 从含有井的吡咯烷酮或 edta 的吸收率中减去空白的吸收率。对于665纳米, 从空白处减去含有井的吡咯烷酮或含有井的 edta 的吸收率。然后, 将日志₁₀(μm 吡咯酮或 edta) 回归到吸收率测量中。为了便于解释样品结果, 请使用吸收作为 x 轴, 并使用日志₁₀(μm 吡咯烷酮或 edta) 作为 y 轴。

4. 收集环境样本: 土壤和植物组织

1. 用0.22μm 过滤的 ddh 2o_清洗取样设备 (铲子和剪刀), 然后用70% 乙醇擦拭, 取样前和样品之间用纸巾擦拭, 以保持无菌技术, 减少交叉污染。
2. 从田间植物中的植物组织 (谷物和芽) 中获取垃圾, 并将其放入贴有标签的塑料储物袋中, 留下足够的茎茬, 以便轻松地拔除所需的土壤和根部样品。
3. 挖出一个约15厘米深、23厘米宽的小根球, 放在一个单独的、贴有标签的塑料袋中, 以便在实验室环境中制备样品。这一步骤类似于 mmpherson 等人的方法.
4. 将所有样品 (谷物、芽、散装土壤和根球) 直接放在单独的袋子里, 保持在 4°c, 直到样品被加工成用于基体生产分析。
5. 将根系相关土壤样本分解为块状、松散的根际土壤和紧密结合的根际土壤。
   1. 把根球从袋子里拿出来。轻轻甩掉根球的土壤。脱落的土壤, 以及留在袋子中的土壤包括 "散装" 土壤。
   2. 使用橡胶木棍进一步去除根球的土壤。这是松散的根际土壤。
   3. 通过与紧固样品的根部并将其放入离心管中, 产生紧密结合的根际土壤。加入30毫升_的ddh2o, 并将其涡旋2-3分钟。去除根系, 得到紧密结合的根际土壤泥浆稀释。

5. 菌落富集培养物的制备及 cas-fe 异种菌的生产试验

注: 所有玻璃器皿应在开始检测前进行酸洗。

1. 土壤样品制备 (针对三种土壤样品类型中的每一种)
   1. 通过在不打开样品袋的情况下尽可能地混合和转动土壤, 使样品袋中的每个土壤样品同质化。
      注: 这有助于减少土壤的自然空间变异性, 并与正常的土壤取样程序保持一致。根据实验设计, 可酌情采用其他方法对环境样品进行均质化。
   2. 在每个样品经过彻底混合后, 在修改后的 mL 介质中, 每个土壤都有2.0 克和悬挂 2.0 g, 然后在无菌 50 毫升的离心管中稀释10-3 至总体积为20毫升, 并配有无菌泡沫塞, 允许曝气。
   3. 对于紧密结合的根际样品, 将根际土壤泥浆的2毫升添加到改性 mL 介质的20毫升中, 然后在无菌的50毫升离心管中稀释10-3 毫升, 并使用无菌泡沫塞进行曝气。
2. 组织样本 (根、芽和谷物) 制备
   1. 用70% 乙醇对样品进行表面消毒。macerate 2.0 g 新鲜组织在20毫升的改性 mL 培养基中使用高的搅拌机30秒。将样品转移到无菌的50毫升离心管中, 然后在无菌的50毫升离心管中稀释10-3 至总体积为20毫升, 并配有无菌泡沫塞, 以便曝气。
3. 铁含量限制对细粒生物生产的富集
   1. 在室温下培养50毫升离心管, 在160转/分时摇晃。

6. 用于检测环境样品中的硅粉生产的 cas-fefe 琼脂检测

1. 在24小时、48小时和72小时启动浓缩培养后, 使用无菌技术从浓缩管中取出1毫升的子样品, 并在2毫升离心管中以 10, 000 x g 离心剂 1分钟, 将细胞造成颗粒。
2. 收集分离的上清液。采用无菌技术, 将上清液100μl 加入到 cas-fe-agar 的100μl 溶液中, 在微板中一式两份或三份。也加入100μl 的无菌 m9 培养基 (作为空白)。然后在28°c 下孵育板。
3. 将每个样品剩余的上清液和颗粒 (未添加到微滴板) 悬浮到其自己的无菌2毫升离心管中。在每个样品上清液管中加入400μl 的无菌甘油, 并重新悬浮颗粒以创建甘油库存。将库存冻结在-80°c, 以便以后进行分析。
   注: 此步骤可以修改, 以生成甘油库存根据任何首选的内部协议。
4. 测量6、24、48和72小时的吸收率, 波长为420纳米。
5. 使用由吡咯烷或 edta 生成的标准曲线, 用吡咯烷酮当量来解释样品吸收率测量。
   注: 吡咯烷酮被确定为一个优越的标准相比 edta (vide infra), 所以 edta 没有被用来解释目前的研究结果。

结果

用荧光假单胞菌法生物合成的吡咯烷酮混合物作为解释和量化样品吸收率 (在420纳米) 的标准, 以μm 中的吡咯丁酮当量计算. 图1显示了吸收率之间的关系 (420nm) 和吡咯烷酮的起始浓度 (以μm_为1) 记录10摩尔)。edta 没有提供足够的标准, 因为样品的吸收率测量比除虫白都丁所能达到的要高, 而 r²的含量更低 (图 2

讨论

这项工作的主要成果是生产了一种新的方法, 可用于快速丰富生产的微生物, 同时定量测量环境样品中的亲菌生产活性。该方法快速、简单且具有成本效益, 结果表明, 该方法可用于检测复杂和新颖的样本类型 (如土壤和植物组织) 中的虹吸剂活性. 该协议还产生了浓缩培养物中的甘油库存, 通过 dna 或 rna 技术, 可以很容易地通过时间来适应对缺铁期间微生物群落结构和功能变化的研究.那些有?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Apex	LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular	Fiesher Scientific	152315A
Autoclave and Sterilizer	Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate	Fiesher Scientific	171428
CAS (Chrome Azurol S)	Chem-Impex Int'l Inc)	000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder	Fiesher Scientific	1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal	J.T.Baker	JI2476
Glycerol, Anhydrous	Baker Analyzed	C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide	Reagent World	FZ0941
Hydrochloride acid	ACROS Organic	B0756767
Infinite M200 PRO plate reader	TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99%	ACROS Organic	A0342179
Laboratory Fume Hood	Thermo Scientific
Laboratory Incubator	VWR Scientific
Magnesium Sulfate	Fiesher Scientific	27855
Niric Acid, (69-70)%	J.T.Baker	72287
PIPES buffer, 98.5%	ACROS Organic	A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder	J.T.Baker	J48594
Pyoverdine	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
Sand
SI-600R Shaker	Lab Companion
Sodium chloride, granular	Fiesher Scientific	136539
Sodium hydroxide, pellets	J.T.Baker	G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%	ACROS Organic	A0371705