Siderophore Hochdurchsatz-Screening von Umweltproben: Pflanzen, Gewebe, lose Böden und Rhizosphäre Böden

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die schnelle Screening von Umweltproben für Siderophore Potenzial zur Mikronährstoff-Bioverfügbarkeit und Umsatz in den terrestrischen Systemen.

Zusammenfassung

Siderophores (niedermolekulare Gewicht Metall chelatisierenden Verbindungen) sind in verschiedenen ökologischen Phänomen von Eisen (Fe) in Böden, für den Erreger Wettbewerb, Pflanze Wachstumsförderung und Kreuz-Königreich Signalisierung biogeochemische Radfahren wichtig. Darüber hinaus sind Siderophores auch kommerzielles Interesse an Feldversuchen und Bioweathering von Metall-Lager Mineralien und Erze. Eine schnelle, kostengünstige und robuste Mittel Siderophore Produktion in komplexen Proben quantitativ zu bewerten ist der Schlüssel zur Identifizierung von wichtigen Aspekte der ökologischen Auswirkungen von Siderophore Aktivitäten, einschließlich, neuartige Siderophore Mikroben produziert. Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um Siderophore Aktivität in Takt Microbiome Gemeinschaften in Umweltproben wie Boden- oder Gewebe zu beurteilen. Die Proben wurden homogenisiert verdünnt in einem modifizierten M9 Medium (ohne Fe) und Anreicherungskulturen waren für 3 Tage inkubiert. Siderophore Produktion wurde in Proben in 24, 48 und 72 Stunden (h) mit einem neuartigen 96-Well Mikrotestplatte CAS (Chrom Azurol Sulphonate) bewertet-Fe-Agar-Assay, eine Anpassung der die traditionell mühsam und zeitaufwändig farbmetrischen Methode zur Beurteilung der Siderophore Aktivitäten in einzelnen kultivierten mikrobielle Isolate. Unsere Methode, um 4 verschiedene Genotypen/Linien von Weizen (Triticum Aestivum L.), einschließlich Lewjain, Madsen, und PI561725 und PI561727, die häufig in der Binnenschifffahrt Pacific Northwest angebaut haben wir angewendet. Siderophore Produktion wurde das Erbgut des Weizens und in bestimmten Arten von Pflanzengewebe beobachtet deutlich beeinflusst. Wir verwendet erfolgreich unsere Methode schnell auf den Bildschirm für die Beeinflussung der Pflanze Genotyp Siderophore Produktion, eine Schlüsselfunktion in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen. Wir produziert viele technische Wiederholungen, sehr zuverlässigen statistischen Unterschiede in Böden und im Pflanzengewebe nachgeben. Wichtig ist, zeigen die Ergebnisse, dass die vorgeschlagene Methode lässt sich schnell Siderophore Produktion in komplexen Proben mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit, in einer Art und Weise zu untersuchen, die Gemeinden für die spätere Arbeit Taxa und funktionelle Gene identifizieren bewahrt werden können.

Einleitung

Siderophores sind wichtige Biomoleküle in erster Linie im Eisen-Chelat für Bioverfügbarkeit, aber mit einer Vielzahl von zusätzlichen Zwecke in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen von mikrobiellen Quorum sensing, Signalisierung, mikrobielle Pflanze-Hosts, Pflanzen Sie, Wachstumsförderung, Kooperation und Wettbewerb innerhalb komplexer mikrobieller Gemeinschaften^1,2. Siderophores können grob unterteilt werden entsprechend ihrer aktiven Zentren und Strukturmerkmale, Erstellen von vier Grundtypen: Carboxylat, Hydroxamate, Catecholate, und gemischte Typen^3,4. Viele Mikroorganismen sind in der Lage, die Ausscheidung über mehrere Typen von Siderophore⁵ und in komplexen Gemeinschaften, eine große Mehrheit der Organismen Biosynthese Membranrezeptoren um die Aufnahme eine noch breitere Palette von Siderophores^{1zu ermöglichen, 6}. Aktuelle Arbeit zeigt, dass Siderophores besonders wichtig auf Gemeinschaftsebene und sogar in Inter Königreich Kommunikations- und biogeochemischen Transfer^{7,8,9,10 ,11}.

Chrom Azurol Sulphonate (CAS) hat seit über 30 Jahren als ein Chelatbildner verwendet worden, um Eisen (Fe) zu binden dergestalt, dass Zusatz von Liganden (z. B. Siderophores) Dissoziation des CAS-Fe-komplexes, erstellen eine leicht erkennbare Farbe Veränderung in das Medium führen kann ¹². wenn die CAS mit Fe gebunden ist, der Farbstoff erscheint als eine Farbe Königsblau und wie der CAS-Fe-Komplex dissoziiert, das Medium verfärbt sich nach der Art der Liganden verwendet, um die Fe-¹³aufräumen. Das anfängliche, Liquid-basierter Medium von Schwyn und Neilands gegründet 1987, modifiziert, in vielerlei Hinsicht zu beherbergen, wechselnde mikrobielle Ziele¹⁴, Wachstum Gewohnheiten und Einschränkungen¹⁵sowie einer Vielzahl von Metallen neben Fe, einschließlich Aluminium, Mangan, Kobalt, Nickel Cadmium, Lithium, Zink¹⁶, Kupfer¹⁷und sogar Arsen¹⁸.

Viele menschliche Krankheitserreger, sowie als Wachstum fördert Mikroorganismen (PGPM) Pflanzen wurden identifiziert als Siderophore produzierenden Organismen^3,19,20, und wichtige Rhizosphäre und endophytische PGPM oft testen positiv für die Siderophore-Produktion⁴. Die traditionelle Fe-basierte Flüssigkeit Methode wurde angepasst Mikrotiter-Isolate in der Bearbeitung für Siderophore Produktion²¹testen. Aber nicht diese Techniken, die Bedeutung der mikrobiellen Gemeinschaft als Ganzes (das Mikrobiom), in Zusammenarbeit und mögliche Regulierung der Siderophore Produktion in Böden und Pflanzen Systeme²²zu erkennen. Aus diesem Grund haben wir eine Hochdurchsatz-Gemeinschaftsebene Bewertung der Siderophore Produktion von einer bestimmten Umgebung, basierend auf der traditionellen CAS-Assay, aber mit Replikation, Benutzerfreundlichkeit, Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit in einer Mikrotestplatte entwickelt. Assay.

In dieser Studie wird ein kostengünstiger, Hochdurchsatz-CAS-Fe-Assay zur Erkennung von Siderophore Produktion präsentiert, um die Bereicherung der Siderophore Produktion von komplexen Proben (z.B. Boden und Pflanze Gewebe Homogenates) zu bewerten. Bulk, locker gebunden und fest gebundene Rhizosphäre Boden (in Bezug auf wie der Boden um den Stamm gebunden war) wurden zusammen mit Korn, schießen und Wurzel Gewebe aus vier unterschiedlichen Weizen (Triticum Aestivum L.) Genotypen erhalten: Lewjain, Madsen, PI561725, und PI561727. Es wurde vermutet, dass grundlegende Unterschiede in der Weizen-Genotypen zu Unterschieden bei der Rekrutierung und Auswahl von Siderophore produzieren Gemeinschaften führen könnte. Von besonderem Interesse ist der Unterschied zwischen mikrobieller Gemeinschaften verbunden mit der PI561725 isogene Linie Aluminium tolerant, ist da sie ALMT1 (Aluminium-aktivierte Malat Transporter 1) besitzt, mit dem Aluminium im Vergleich empfindliche PI561727 isogenen Linie, die eine nicht-Aluminium ansprechende Form des Gens, almt1^23,24,25,26besitzt. Das Hauptziel der Studie war es, eine einfache und schnelle Methode quantitativ bewerten Siderophore Produktion in Siderophore Anreicherungskulturen von komplexen Probentypen unter Beibehaltung der Kulturen für die künftige Arbeit zu entwickeln.

Protokoll

Hinweis: Speicherort der Wiese: Washington State University, Pflanze Pathologie Bauernhof (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Die Aussaat der Samen wurden mit einem mechanischen Pflanzer auf 19. Oktober 2017. Jedes Weizen Genotyp wurde in Headrows, ca. 1 Meter auseinander, vermeiden überlappende Wurzelsystem gepflanzt. Pflanzen-und Bodenproben wurden am 9. August 2018, gesammelt als Pflanzen zur Ernte bereit waren. Proben wurden von drei Wiederholungen von vier Weizen Genotypen gesammelt: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.

1. Vorbereitung des modifizierten M9 medium

1. Verwendung Na₂PO₄∙7H₂O (12,8 g/200 mL), KH₂PO₄ (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) und NH₄Cl (1 g/20 mL) Reagenzien, die M9 Salzlösung vorzubereiten.
2. Verwenden Sie 18 g MgSO₄∙7H₂O in 100 mL doppelte entionisiertem Wasser (DdH₂O), um 0,75 M MgSO₄∙7H₂O. vorbereiten
3. Machen Sie 1 M CaCl₂∙2H₂O durch Zugabe von 14,7 g CaCl₂∙2H₂O 100 ml DdH₂O.
4. Vorbereiten der Pufferlösung durch 6,048 g von Rohren in 156 mL DdH₂O unter Rühren auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 M NaOH.
5. Bereiten Sie 20 % Glukose (Traubenzucker-Monohydrat vor) durch Auflösen von 20 g Glucose in 100 mL DdH₂O.
6. Bereiten Sie Lösungen und individuell Autoklav alle aber die Glukose. Filter zu sterilisieren die Glukoselösung für zusätzlich zu den M9-Medien nach dem Autoklavieren (0,22 µm).
7. Bereiten Sie das modifizierte M9 Medium durch Mischen 156 mL Pufferlösung Rohre, 40 mL der M9 Salze Lösung, 20 μL CaCl₂·2H₂O Lösung, 266 μL MgSO₄·7H₂O und 4 mL 20 % Glukose-Lösungen zusammen in die biologische Sicherheit Schrank, mit steriler Technik.
8. Für die Erhaltung der modifizierten M9 Verschließen der Behälter, Deckel mit Alu-Folie zum Schutz vor UV, und platzieren Sie bei 4 ° c

2. Vorbereitung des CAS-Fe-Agar medium

1. Säure waschen alle Glaswaren in 100 mM HCl/100 mM Druckaufschluss₃ für mindestens 2 Stunden vor der Verwendung in der CAS-Assay.
2. Bereiten Sie eine Aluminium-Backform mit Labor Grade Sand gefüllt und mit Alufolie abdecken. Autoklaven bei 121 ° C für 30 min und beiseite.
3. Bereiten Sie HDTMA (Hexadecyltrimethylammonium Bromid vor), indem Sie 20 mL DdH₂O 0,0365 g hinzufügen und legen Sie die Lösung bei 37 ° C, Solubilisierung zu fördern.
4. Bereiten Sie 10 mM HCl und generieren Sie 1 mM FeCl₃·6H₂O mit 10 mM HCl als Lösungsmittel zu. 25 mL DdH₂O fügen Sie 0,0302 g CAS Rühren sanft mit einem sterilen magnetische Rühren hinzu. Fügen Sie 5 mL 1 mm FeCl₃·6H₂O (in 10 mM HCl) auf 25 mL CAS-Lösung, während Sie weiterhin vorsichtig umrühren (die Lösung verwandelt sich in dunkle rötliche Farbe schwarz).
5. Fügen Sie 20 mL HDTMA Lösung langsam unter Rühren sanft in die Fe-CAS-Lösung (Dies ergibt eine dunkele blaue Lösung hinzu)
6. Vorbereiten der Pufferlösung durch 15,12 g von Rohren in 375 mL DdH₂O, mit sanften Rühren auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 5 M NaOH. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Volumen zu 450 mL bringen. 5 g Agarose der Projektmappe hinzufügen. Autoklaven der Rohre Puffer Lösung und die CAS-Fe-Lösung bei 121 ° C für 30 Minuten.
7. Fügen Sie die Gesamtheit der CAS-Fe-Lösung sorgfältig nach jeder von ihnen autoklaviert ist auf die Gesamtheit des Puffers Rohre in die Biosicherheit Schrank hinzu.
8. Legen Sie die gemischte Lösung in einem Wasserbad bei 50 ° C.
   Hinweis: Frisch bereiten Sie alle Reagenzien im CAS-Fe-Agar Medium vor jedem Assay als langfristige Lagerung bei 50 ° C Ergebnisse der Niederschläge der CAS-Fe komplex und Kühlung führt zu erstarrten Medium.
9. Legen Sie eine sterile Reagenz-Boot in der sterilen Sand in die Biosicherheit Kabinett und Hitze bis 50 ° C. Übertragen Sie die CAS-Fe-Agar auf das Boot dann schnell aliquoten 100 µL in jede Vertiefung in einer klaren, flach-Boden, sterile 96-Well Mikrotestplatte.

(3) Pyoverdine/EDTA standard Vorbereitung

1. Pyoverdine Vorbereitung
   1. Bereiten Sie 800 μM Pyoverdine Standard (Mischung von Bernsteinsäure, 2-hydroxy-Glutaramide und Succinaminde Formen der Pyoverdine – siehe Tabelle der Materialien), in vorbereitete modifizierte M9 Medium.
   2. Verdünnen Sie diese Lösung in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 μM Lösungen.
2. EDTA-standard-Vorbereitung
   1. Fügen Sie 0,594 g Binatrium Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA: C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2h₂O), bis 500 mL vorbereitete modifizierte M9 Mittel-bis 3200 μM EDTA Standard vorbereiten.
   2. Verdünnen Sie diese Lösung in 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 μM Lösungen.
3. Standardkurve generation
   1. Fügen Sie 100 μL jeder Konzentration von Pyoverdine und EDTA, Brunnen von einer 96-Well Mikrotestplatte mit 100 μL der CAS-Fe Agar Medium zu trennen. Doppelte technische Replikationen von jeder Konzentration zu machen. Auch fügen Sie leere Brunnen mit nur M9 (kein EDTA oder Pyoverdine).
   2. Messen Sie mit einer Mikrotestplatte Leser, Extinktion (bei 420 nm und 665 nm) nach 1, 6 und 24 h Inkubation bei 22 ° C und Nutzung Extinktion Messungen Standardkurven zu generieren.
      Hinweis: Bei 420 nm Messungen, subtrahieren Sie Extinktion der Rohlinge aus der Absorption von Pyoverdine oder EDTA mit Brunnen. Für 665 nm, subtrahieren Extinktion von Pyoverdine oder EDTA mit Brunnen aus Absorption von Rohlingen. Dann ist Log₁₀(µM Pyoverdine oder EDTA) gegen die Absorption Maße zurückgebildet. Zur Vereinfachung der Probenergebnisse zu interpretieren verwenden Sie Extinktion als x-Achse und melden Sie₁₀(µM Pyoverdine oder EDTA) als die y-Achse.

4. Erhebung von Umweltproben: Boden und pflanzlichen Geweben

1. Waschen Sie Probenahmegeräte (Schaufeln und Schere) mit 0,22 µm filtriert DdH₂O gefolgt von 70 % igem Ethanol und wischen Sie mit Papierhandtücher vor der Probenahme und dazwischen Proben zu pflegen sterilen Technik und reduzieren Cross-Kontamination.
2. Verbrauchsteuern Sie Pflanzengewebe (Körner und Triebe) von Pflanzen auf dem Feld, und legen Sie sie in einer beschrifteten Kunststoff Aufbewahrungstasche, genug schießen Stoppeln zur einfachen Entwurzelung der gewünschten Boden und Wurzel Proben zu verlassen.
3. Graben Sie, eine kleine Wurzel Kugel ca. 15 cm tief und 23 cm breit und legen Sie sie in einer separaten, beschriftete Plastiktüte für die Probenvorbereitung in der Laborumgebung. Dieser Schritt ist ähnlich wie die Methoden der McPherson Et Al.²⁷.
4. Alle Proben (Getreide, Triebe, loser Schüttung Boden und Wurzelballen in getrennten Beuteln) direkt auf dem Eis und bei 4 ° C bis Proben für die Siderophore Produktion Assay verarbeitet werden.
5. Separate Wurzel verbundenen Bodenproben in loser Schüttung, locker gebundenen Rhizosphäre Boden und fest gebundene Rhizosphäre Boden.
   1. Nehmen Sie die Wurzelballen aus den Taschen. Sanft schüttelt Erde aus dem Wurzelballen. Abgeschüttelt Boden, zusammen mit der Erde umfasst Links in der Tasche "Bulk" Boden.
   2. Verwenden Sie einen Gummihammer, um weitere Erde aus dem Wurzelballen zu entfernen. Dies ist der Boden locker gebundenen Rhizosphäre.
   3. Fest gebundene Rhizosphäre Boden durch die Wurzeln mit der Probe fest gebunden und setzen sie in ein Zentrifugenröhrchen zu generieren. Geben Sie 30 mL DdH₂O und Wirbel es für 2-3 Minuten. Entfernen Sie die Wurzeln um die eng gebundenen Rhizosphäre Boden Gülle Verdünnung zu erhalten.

5. Vorbereitung der Siderophore Anreicherungskulturen und CAS-Fe Siderophore Produktion assay

Hinweis: Alle Gläser sollte Säure gewaschen vor Beginn der Tests.

1. Boden-Probenvorbereitung (für jede der drei Bodenarten Probe)
   1. Jeder Bodenprobe innerhalb der Beutel durch das Mischen und drehen den Boden so weit wie möglich ohne Öffnen des Beutels zu homogenisieren.
      Hinweis: Dies verringert die natürliche Erde räumliche Variabilität und deckt sich mit normalen Boden Stichprobenverfahren. Andere Methoden können genutzt werden, um Umweltproben, je nach Bedarf und je nach Versuchsanordnung zu homogenisieren.
   2. Nach jeder Probe wurde gründlich gemischt, aliquoten und 2,0 g von jeder Boden in 20 mL modifizierte M9 Medium aussetzen, dann verdünnen Sie 10^-3 auf ein Gesamtvolumen von 20 mL in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Schaum-Stecker zur Belüftung zu ermöglichen.
   3. Für eng gebundenen Rhizosphäre Proben 20 mL modifizierte M9 Medium fügen Sie 2 mL der Rhizosphäre Boden Brei hinzu, dann verdünnen Sie 10^-3 auf ein Gesamtvolumen von 20 mL in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Schaum-Stecker zur Belüftung zu ermöglichen.
2. Vorbereitung der Gewebe-Probe (Wurzel, schießen und Korn)
   1. Oberfläche die Probe mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Mazerat 2,0 g des frischen Gewebe in 20 mL modifizierte M9 Medium mit einem Mixer auf hoch für 30 Sekunden. Übertragen Sie die Probe auf einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen, dann verdünnen Sie 10^-3 auf ein Gesamtvolumen von 20 mL in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Schaum-Stecker zur Belüftung zu ermöglichen.
3. Bereicherung der Siderophore Produktion durch Fe-Beschränkung
   1. 50 mL Zentrifuge Rohre bei Raumtemperatur inkubieren und bei 160 u/min schütteln.

(6) CAS-Fe-Agar-Assays für die Erkennung der Siderophore Produktion in Umweltproben

1. 1 mL Teilproben Entferne am 24, 48 und 72 h nach der Einleitung der Bereicherung Kultur aus der Anreicherung Rohre mit steriler Technik und Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min in 2 mL Zentrifuge Röhren um die Zellen zu granulieren.
2. Sammeln Sie die getrennten überstand. Mit steriler Technik 100 μl des Überstands zu 100 μl Lösung von CAS-Fe-Agar in doppelt oder dreifach in die Mikrotestplatte hinzufügen. Auch Agrega 100 µL steriler M9 Medium (Leerzeichen). Dann die Platte bei 28 ° c inkubieren
3. Aussetzen Sie die restlichen überstand und Pellet für jede Probe (nicht hinzugefügt Mikrotiterplatte) in eine eigene, steril 2 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 400 μl steriler Glycerin in jeder Probe überstand Rohr und Aufschwemmen der Pellet um Glycerin Bestände zu erstellen. Frieren Sie die Aktie bei-80 ° C für spätere Analysen.
   Hinweis: Dieser Schritt kann geändert werden, um Glycerin Vorräte nach bevorzugte interne Protokoll zu generieren.
4. Messung der Extinktion bei 6, 24, 48 und 72 h bei 420 nm Wellenlänge.
5. Verwenden Sie Standardkurven erstellt von Pyoverdine oder EDTA Extinktion Probemessungen in Form von Pyoverdine äquivalenten zu interpretieren.
   Hinweis: Pyoverdine war entschlossen, einen gehobenen Standard im Vergleich mit EDTA (vide infra), so dass EDTA nicht verwendet wurde, um die Ergebnisse in der aktuellen Studie zu interpretieren.

Ergebnisse

Eine Pyoverdine Mischung Biosynthesized durch Pseudomonas Fluorescens diente als Standard zu interpretieren und zu quantifizieren, Extinktion (bei 420 nm) der Proben in Form von Pyoverdine äquivalenten in µM. Abbildung 1 zeigt den Zusammenhang zwischen Extinktion (420 nm) und Konzentration der Pyoverdine (Log₁₀ Molarity in µM) ab. EDTA hat keinen angemessenen Standard bereitgestellt, da Proben ausgestellten größere Absorption Messunge...

Diskussion

Das primäre Ergebnis dieser Arbeit ist die Herstellung einer neuen Methodik, die schnell zu bereichern für Siderophore produzieren Mikroben während der Messung quantitativ Siderophore/Produktionstätigkeit in der Umwelt Probe verwendet werden können. Die Methode ist schnell, einfach und kostengünstig, und die Ergebnisse zeigen, wie sie verwendet werden, um Siderophore Aktivität von komplexen und neuartige Probentypen erkennen (z. B.., Boden und Pflanze Gewebe). Das Protokoll führt auch bei der Herstellung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Apex	LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular	Fiesher Scientific	152315A
Autoclave and Sterilizer	Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate	Fiesher Scientific	171428
CAS (Chrome Azurol S)	Chem-Impex Int'l Inc)	000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder	Fiesher Scientific	1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal	J.T.Baker	JI2476
Glycerol, Anhydrous	Baker Analyzed	C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide	Reagent World	FZ0941
Hydrochloride acid	ACROS Organic	B0756767
Infinite M200 PRO plate reader	TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99%	ACROS Organic	A0342179
Laboratory Fume Hood	Thermo Scientific
Laboratory Incubator	VWR Scientific
Magnesium Sulfate	Fiesher Scientific	27855
Niric Acid, (69-70)%	J.T.Baker	72287
PIPES buffer, 98.5%	ACROS Organic	A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder	J.T.Baker	J48594
Pyoverdine	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
Sand
SI-600R Shaker	Lab Companion
Sodium chloride, granular	Fiesher Scientific	136539
Sodium hydroxide, pellets	J.T.Baker	G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%	ACROS Organic	A0371705