환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양

요약

우리는 지구 시스템에서 미 량 영양소 bioavailability 및 매출에 기여 하는 siderophore 잠재적인 환경 샘플의 신속한 심사에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

Siderophores (저 분자 무게 금속 화합물을 킬레이트 화) 병원 체 경쟁, 식물 성장 촉진, 그리고 크로스 왕국 신호를 토양에 철 (Fe) 생물 지구 화학적 순환에서 배열 하는 다양 한 생태 현상에 중요 하다. 또한, siderophores bioleaching 및 베어링 금속 광물 및 광 석의 bioweathering에 상업적인 관심 있습니다. 양적 평가에서 복잡 한 샘플 siderophore 생산의 급속 한, 비용 효과적이 고 강력한 수단 siderophore 활동을 포함 하 여, 소설 siderophore 생산 하는 미생물의 생태 파급 효과의 중요 한 측면을 식별 하는 키입니다. 여기에 제시 된 방법 siderophore 토양 또는 식물 조직 같은 환경 샘플에서 전술에 미생물 커뮤니티의 활동을 평가 하기 위해 개발 되었다. 샘플 했다 균질 하 고 (Fe), 없이 수정 된 M9 매체에 희석 농축 문화 3 일 동안 알을 품을 했다. Siderophore 생산에 24, 48, 및 72 시간 (h) 소설 96 잘 microplate CAS (크롬 azurol 성의)를 사용 하 여 샘플에 평가 되었다-Fe agar 분석 결과, siderophore 평가의 전통적으로 지루하고 시간이 많이 걸리는 색도계 방법의 적응 활동, 개별 재배 미생물 분리에 수행입니다. 우리 밀 (Triticum aestivum L.)의 4 가지 genotypes/라인, Lewjain, PI561725, 매드 슨, 그리고 내륙 평화로운 북 서에서 일반적으로 성장 하는 PI561727를 포함 하 여 우리의 방법을 적용. Siderophore 생산은 명확 하 게 밀, 및 식물 조직 관찰의 특정 종류는 유전자 형에 의해 영향을. 우리는 성공적으로 빠르게 siderophore 생산, 지상파와 수생 생태계에 핵심 기능 식물 유전자의 영향에 대 한 화면을 우리의 방법 사용. 우리는 매우 신뢰할 수 있는 통계적 차이가 토양 및 식물 조직 내의 저조한 많은 기술 복제, 제작. 중요 한 것은, 결과 보여 빠르게 taxa 및 기능성 유전자를 확인 후 작업 보존 사회를 허용 하는 방식으로 신뢰성의 높은 학위를 가진 복잡 한 샘플에서 siderophore 생산을 검토 하는 제안 된 메서드를 사용할 수 있습니다.

서문

Siderophores는 중요 한 생체 철 chelation bioavailability, 하지만 다양 한 미생물 쿼럼 감지, 미생물 공장-호스트, 신호에서 배열 하는 지상파와 수생 생태계에 추가적인 목적에 주로 관여 식물 성장 촉진, 협력 및 복잡 한 미생물 지역 사회^1,2내 경쟁. Siderophores 분류할 수 있습니다 광범위 하 게 그들의 활성 사이트 및 구조 기능, 4 개의 기본 형식 만들기: 카복실산, hydroxamate, catecholate, 및 종류^3,4혼합. 많은 미생물 검출 한 종류 이상의 siderophore⁵ 및 복잡 한 사회, 생물 biosynthesize의 대부분에서에서 막 수용 체 siderophores^{1의 더 넓은 다양 한의 통풍 관을 허용 하도록 할 수 있다 6}. 최근 작품이 나타냅니다 siderophores는 특히 중요 한 지역 사회 수준에 남북 왕국 통신 및 생물 지구 화학적 전송^{7,,89,10에도 ,11}.

크롬 azurol 반발 (CA) 사용 되었습니다 chelating 요원으로 30 년 이상 철 (Fe)에 바인딩할 CAS Fe 복잡 한 매체에 쉽게 식별 색상 변화를 만들기의 분리에 ligands (즉, siderophores)의 추가 발생할 수 있습니다 같은 방법으로 ¹². 때에 CAS Fe와 바인딩되어, 염료 로얄 블루 색상으로 나타납니다 및 CAS Fe 복잡 한 분리, 매체 Fe¹³를 청소 하는 데 사용 하는 리간드의 종류에 따라 색상 변경. 1987 년, Schwyn 및 Neilands에 의해 설립 초기, 액체 기반 매체 미생물 대상¹⁴, 성장 습관과 제한¹⁵, 뿐만 아니라 금속 철, 외의 다양 한 변화를 수용 하기 위해 여러 가지에서 수정 되었습니다 포함 하 여 알루미늄, 망간, 코발트, 니켈 카드뮴, 리튬, 아연¹⁶, 구리¹⁷, 그리고 심지어 비소¹⁸.

많은 인간 병원 체, 뿐만 아니라 식물 성장 촉진 미생물 (PGPM)로 확인 되었습니다 siderophore 생산 생물^3,,1920및 중요 한 rhizosphere와 종종 테스트 endophytic PGPM 긍정적인 siderophore 생산⁴. 전통적인 철 기반 액체 방법은 결정 격리 재배 siderophore 생산²¹의 테스트에 적응 되었습니다. 그러나, 이러한 기술을 전체 (미생물), 협력에 미생물 커뮤니티의 중요성 및 토양 및 식물 시스템²²siderophore 생산의 잠재적인 규칙을 인식 하지. 그 이유로, 우리는 siderophore 생산 기반으로 전통적인 CAS 분석 결과, 하지만 복제, 측정, 안정성 및 반복성을 microplate에의 용이성, 주어진된 환경에서의 높은 처리량 커뮤니티 수준 평가 개발 분석 결과입니다.

이 연구에서는 siderophore 생산을 탐지 하기 위한 비용, 높은 처리량 CAS Fe 시험 siderophore 생산에서 복잡 한 샘플 (즉, 토양 및 식물 조직 homogenates)의 농축을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 대량, 느슨하게 연결, 그리고 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양 조건 (어떻게 토양 루트 였던) 곡물, 촬영, 및 4 개의 뚜렷한 밀 (Triticum aestivum L.) genotypes에서 루트 조직 취득 했다: Lewjain, 매드 슨, PI561725, 그리고 PI561727입니다. 그것은 밀 genotypes 근본적인 차이 모집 및 다양 한 커뮤니티를 생산 하는 siderophore에 차이가 발생할 수 있다는 가설 했다. 특정 관심의 이다 미생물 지역 사회는 관대 알루미늄 ALMT1 (Malate 전송 1 알루미늄 활성화)를가지고 있기 때문에, PI561725 isogenic 선, 연관의 차이와 비교 알루미늄 중요 한 PI561727 isogenic 선, 유전자, almt1^23,,2425,26의 비-알루미늄 반응 형태를 소유 하는. 연구의 주요 목적은 미래의 일에 대 한 문화를 유지 하면서 복잡 한 샘플 형식의 siderophore 농축 문화에서 siderophore 생산 양적 평가의 간단한, 빠른 방법 개발 했다.

프로토콜

참고: 필드 사이트의 위치: 워싱턴 주립 대학, 식물 병 리 농장 (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). 씨앗은 기계적인 화분을 사용 하 여 10 월 19 일, 2017에 뿌린 씨. 각 밀 유전자 headrows, 대략 1 미터 떨어져 루트 시스템의 중복을 피하기 위해 심은 했다. 식물 및 토양 샘플 2018 년 8 월 9 일 때 식물은 추수에 대 한 준비에 수집 되었다. 샘플 4 밀 genotypes의 3 개의 복제에서 모았다: PI561727, PI561725, 매드 슨, Lewjain.

1입니다. 수정 된 M9 매체의 준비

1. 사용 나₂포₄∙7H₂O (12.8 g/200 mL), KH₂포₄ (0.3 g/200 mL), M9 소금 솔루션 준비에 NaCl (0.5 g/200 mL), 및 NH₄Cl (1 g/20 mL) 시 약.
2. 이중 이온된 수 (ddH₂O) 100 mL에 MgSO₄∙7H₂O의 18 g를 사용 하 여 준비 0.75 M MgSO₄∙7H₂o.
3. CaCl₂∙2H₂O의 1 M ddH₂o.의 100 mL와 CaCl₂∙2H₂O의 14.7 g를 추가 하 여 확인
4. DdH₂O 감동과 156 mL으로 파이프의 6.048 g을 용 해 하 여 버퍼 솔루션을 준비 합니다. 5 M NaOH와 6.8에 pH를 조정 합니다.
5. DdH₂o.의 100 mL으로 포도 당의 20 g을 용 해 하 여 20% 포도 당 (포도 당 monohydrate)를 준비
6. 모든 압력솥 하지만 포도 당 개별적으로 솔루션을 준비 합니다. 필터 소독 압력가 마로 소독 (0.22 μ m) 후 M9 미디어에 추가 위한 포도 당 솔루션.
7. 파이프 버퍼 솔루션, M9 소금 솔루션의 40 mL, CaCl₂·2H₂O 솔루션의 20 μ의 156 mL, MgSO₄·7H₂O, 266 μ는 biosafety에 함께 20% 포도 당 솔루션의 4 mL를 혼합 하 여 수정 된 M9 매체 준비 캐비닛, 사용 무 균 기법입니다.
8. 수정 된 m 9의 보존에 대 한 컨테이너를 밀봉, 커버, 자외선 으로부터 보호 하기 위해 4 ° c.에 알루미늄 호 일

2. CA-Fe-한 천 매체의 준비

1. 산은 CAS 분석 결과 활용 이전 2 h의 최소 100 m m HCl/100 m m HNO₃ 모든 유리 세척.
2. 알루미늄 베이킹 팬을 실험실 급료 모래 가득 준비와 알루미늄 호 일로 다룹니다. 30 분을 정해 121 ° C에 고압.
3. 20 mL ddH₂O 0.0365 g을 추가 하 여 HDTMA (hexadecyltrimethylammonium 브 로마 이드)를 준비 하 고 가용 화를 촉진 하는 37 ° C에서 솔루션을 배치.
4. 10 m m HCl을 준비 하 고 1mm FeCl₃·6H₂O 10 m m HCl 용 매로 사용 하 여 생성. 메 마른 자기 볶음 바도 부드럽게 저 어 하는 동안 CA의 0.0302 g ddH₂O 25 mL를 추가 합니다. 계속 부드럽게 (어두운 붉은 검은 색으로 솔루션 회전)을 저 어 하는 동안 CA 솔루션의 25 mL를 1 m m FeCl₃·6H₂O (10 m m HCl)의 5 mL를 추가 합니다.
5. 천천히 부드럽게 교 반 (이 어두운 블루 솔루션 생성) Fe-CA 솔루션으로 하는 동안 HDTMA 솔루션의 20 mL를 추가 합니다.
6. 375 mL ddH₂O, 부드러운 교 반으로 파이프의 15.12 g을 용 해 하 여 버퍼 솔루션을 준비 합니다. 5 M NaOH와 6.8에 pH를 조정 합니다. 450 mL를 볼륨을가지고 물을 추가 합니다. Agarose의 5 g을 솔루션에 추가 합니다. 고압 파이프 솔루션 및 CAS Fe 솔루션 30 분 동안 121 ° C에서 버퍼.
7. 신중 하 게 그들의 각각은 압력가 마로 소독 후 CA Fe 솔루션의 전체 biosafety 내각에서 파이프 버퍼의 전체에 추가 합니다.
8. 50 ° c.에 물 욕조에 혼합된 솔루션 배치
   참고: 갓 응고 매체에 CAS-Fe, 복잡 하 고 냉각 결과의 강 수에서 50 ° C 결과에 장기 저장으로 각 시험 전에 CAS-Fe-한 천 매체에서 모든 시 약을 준비 합니다.
9. Biosafety 내각에서 메 마른 모래와 50 ° c 열 멸 균 시 보트를 배치 보트, 분명, 평면-바닥, 살 균 96 잘 microplate에 각 음을 신속 하 게 aliquot 100 µ L를 CA-Fe-Agar를 전송 합니다.

3. Pyoverdine/EDTA 표준 준비

1. Pyoverdine 준비
   1. 800 μ M pyoverdine 표준 준비 (호박 산, 2-hydroxy glutaramide, 및 pyoverdine-succinaminde 형태의 혼합 재료의 표참조), 이전 준비 수정된 M9 매체에.
   2. 400, 200, 100, 50, 25, 12.5에이 솔루션 및 6.25 μ M 솔루션을 희석.
2. EDTA 표준 준비
   1. Disodium ethylenediaminetetraacetic 산의 0.594 g 추가 (EDTA: C₁₀H₁₄N₂나₂O₈.2H₂O), 3200 μ M EDTA 표준 준비 이전 준비 수정된 M9 매체의 500 ml.
   2. 1600에이 솔루션을 희석 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 그리고 6.25 μ M 솔루션.
3. 표준 곡선 생성
   1. Pyoverdine 및 CAS 철 한 천 매체의 100 μ를 포함 하는 96-잘 microplate의 우물을 EDTA의 각 농도의 100 μ를 추가 합니다. 각 농도의 중복 기술 복제를 확인 합니다. 또한, 추가 M9와 빈 우물 (EDTA 또는 pyoverdine).
   2. Microplate 리더를 사용 하 여, 흡 광도 측정 (420에 nm, 665 nm) 22 ° C, 및 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 흡 광도 측정에서 1, 6, 및 24 시간 보육 후.
      참고: 420 nm 측정, pyoverdine 또는 EDTA 포함 하 웰 스의 흡 광도에서 흡 광도를 감 하십시오. 665 대 한 nm, pyoverdine 또는 우물의 흡 광도에서 포함 된 EDTA의 흡 광도 뺍니다. 그런 다음 로그₁₀µ M pyoverdine (EDTA) 흡 광도 측정에 대 한 역행 이다. 샘플 결과 해석의 용이성에 대 한 흡 광도 사용 하 여 x 축으로 하 고 y 축으로₁₀µ M pyoverdine (EDTA) 로그.

4. 환경 샘플의 수집: 토양 및 식물 조직

1. 0.22 μ m 필터링 ddH₂O 70% 에탄올, 다음 샘플링 장비 (삽과가 위)를 세척 하 고 샘플링 하기 전에 살 균 기술을 유지 하 고 감소를 샘플 사이 종이 타월로 닦아 교차 오염을.
2. 삭제할 필드, 식물에서 식물 조직 (곡물 및 촬영) 하 고 쉽게 원하는 토양 및 루트 샘플을 혼돈으로 몰아 위해 충분 한 촬영 수염을 떠나 레이블이 플라스틱 스토리지 가방에 넣어.
3. 깊은 작은 루트 공 약 15 cm와 23 c m excavate를 실험실 환경에서 샘플 준비를 위한 별도, 레이블이 지정 된 비닐 봉지에 넣습니다. 이 단계는 맥 퍼 슨 외.²⁷의 방법에 비슷합니다.
4. 얼음에 직접 모든 샘플 (곡물, 촬영, 대량 토양, 그리고 별도 가방에 루트 공)을 놓고 샘플 siderophore 생산 분석 결과 대 한 처리는 될 때까지 4 ° C에서 유지 합니다.
5. 별도 루트는 대량, 느슨하게 연결 rhizosphere 토양과 밀접 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양으로 토양 샘플을 관련.
   1. 가방에서 루트 볼을 걸릴. 루트 볼에서 토양을 부드럽게 흔들어. 토양, 떨어져 동요는 토양 함께 가방에 왼쪽 "대량" 토양 구성.
   2. 고무 망치를 사용 하 여 추가 루트 공을에서 토양을 제거. 이것은 느슨하게 연결 rhizosphere 토양 이다.
   3. 엄격 하 게 바인딩된 샘플 뿌리를 복용 하 고 원심 분리기 튜브에 넣고 단단히 바인딩된 rhizosphere 토양을 생성 합니다. 30 mL ddH₂O와 소용돌이의 추가 2-3 분 위해 그것. 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 토양 슬러리 희석을 뿌리를 제거 합니다.

5. siderophore 농축 문화와 CAS Fe siderophore 생산 분석 결과의 준비

참고: 모든 유리 산은 분석 실험을 시작 하기 전에 세척 되어야 합니다.

1. (각 3 개의 토양 샘플 형식)에 대 한 토양 시료 준비
   1. 혼합 한 토양 가능한 가방을 열지 않고 샘플 가방 안에 각 토양 샘플을 균질.
      참고:이 자연 토양 공간 가변성을 줄이는 데 도움이 됩니다 및 일반 토양 샘플링 절차에 맞춥니다. 다른 방법 환경 샘플, 적절 한, 그리고 실험 설계에 따라 균질에 활용 될 수 있습니다.
   2. 후 각 샘플 철저 하 게 혼합, aliquot 및 수정 된 M9 매체의 20 mL에 각 토양의 2.0 g를 일시 중단, 다음 10^-3 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 희석.
   3. 엄격 하 게 바인딩된 rhizosphere 샘플에 대 한 수정 된 M9 매체의 20 ml rhizosphere 토양 슬러리의 2 개 mL를 추가 후 희석 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 10^-3 .
2. 조직 샘플 (루트, 촬영 및 곡물) 준비
   1. 표면 샘플 70% 에탄올으로 소독. 30 초 동안 높은에 믹서 기를 사용 하 여 수정 된 M9 매체의 20 ml에서 신선한 조직의 2.0 g macerate 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브 샘플 전송 다음 희석 폭 기를 수 있도록 메 마른 거품 플러그와 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 20 mL의 총 볼륨을 10^-3 .
3. Fe 제한을 통해 Siderophore 생산의 농축
   1. 실 온에서 50 mL 원심 분리기 튜브를 품 어 고 160 rpm에 흔들.

6. CAS-Fe agar 분석 siderophore 생산 환경 샘플에서의 검출

1. 24, 48, 및 72 h 농축 문화를 시작한 후, 1 mL 샘플이 농축 튜브를 사용 하 여 메 마른 기술 및 원심 분리기 10000 x g에서 2 mL 원심 분리기 튜브에 1 분 동안 이용할 셀에서 제거 합니다.
2. 분리 된 상쾌한을 수집 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여, 중복 또는 microplate에 3 중 CA-Fe-Agar의 100 μ 솔루션에는 상쾌한의 100 μ를 추가 합니다. 또한 (공백)로 살 균 M9 매체의 100 µ L를 추가 합니다. 28 ° c.에 접시를 품 어
3. 자체 살 균 2 mL 원심 분리기 관으로 나머지 상쾌한 고 각 샘플 (결정 접시에는 추가 되지 않습니다)에 대 한 펠 릿을 일시 중단 합니다. 각 샘플 상쾌한 튜브에 살 균 글리세롤의 400 μ를 추가 하 고 글리세롤 주식을 만드는 펠 릿을 resuspend. 나중 분석-80 ° C에서 재고를 고정 합니다.
   참고:이 단계는 어떤 선호 사내 프로토콜에 따라 글리세롤 주식을 생성 하 수정할 수 있습니다.
4. 6, 24, 48, 및 72 h 420 nm 파장에서 흡 광도 측정 한다.
5. 표준 곡선에서 생성 pyoverdine 또는 EDTA를 사용 하 여 pyoverdine 해당 측면에서 흡 광도 측정 한 샘플을 해석 하는.
   참고: Pyoverdine EDTA에 비해 우수한 표준 결정 했다 (아래를 보라), 그래서 EDTA 현재 연구에서 결과 해석에 사용 되지 않았습니다.

결과

슈 도모 나 스 fluorescens 에 의해 pyoverdine 혼합물 biosynthesized 해석 하 고 흡 광도 측정 하는 표준으로 사용 되었다 (에서 420 nm) µ M. pyoverdine 해당 점에서 샘플의 그림 1 흡 광도 (420 사이 관계를 보여 줍니다. nm) 및 pyoverdine (µ M에서 로그₁₀ 몰)의 농도 시작. EDTA 샘플 전시 큰 흡 광도 측정 보다 R² 와 pyoverdine, 달성 했다 (

토론

이 작품의 기본 결과 양적 siderophore 생산/환경 샘플에서 활동을 측정 하는 동안 미생물을 생산 하는 siderophore에 대 한 신속 하 게 풍부 하 게 사용할 수 있는 새로운 방법론의 생산 이다. 방법론은 빠르고, 단순 하 고 비용 효율적인, 그리고 결과 사용 하 수 있는 복잡 하 고 소설 샘플 형식에서 siderophore 활동을 탐지 하는 방법을 보여 줍니다 (예를 들어., 토양 및 식물 조직). 프로토콜 또한 농?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Apex	LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular	Fiesher Scientific	152315A
Autoclave and Sterilizer	Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate	Fiesher Scientific	171428
CAS (Chrome Azurol S)	Chem-Impex Int'l Inc)	000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder	Fiesher Scientific	1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal	J.T.Baker	JI2476
Glycerol, Anhydrous	Baker Analyzed	C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide	Reagent World	FZ0941
Hydrochloride acid	ACROS Organic	B0756767
Infinite M200 PRO plate reader	TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99%	ACROS Organic	A0342179
Laboratory Fume Hood	Thermo Scientific
Laboratory Incubator	VWR Scientific
Magnesium Sulfate	Fiesher Scientific	27855
Niric Acid, (69-70)%	J.T.Baker	72287
PIPES buffer, 98.5%	ACROS Organic	A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder	J.T.Baker	J48594
Pyoverdine	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
Sand
SI-600R Shaker	Lab Companion
Sodium chloride, granular	Fiesher Scientific	136539
Sodium hydroxide, pellets	J.T.Baker	G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%	ACROS Organic	A0371705