测量大鼠传染性偏航的实验室方法

摘要

此处描述的方法旨在成对熟悉或不熟悉的雄性大鼠获得哈欠传染曲线。带有孔的笼子由透明或不透明的分区隔开,带(或不带)孔用于检测视觉、嗅觉或两种类型的感官提示是否可刺激哈欠传染。

摘要

沟通是动物社会生活的一个重要方面。动物可以相互影响,在学校、羊群和羊群中走到一起。沟通也是男女在求爱中互动的方式,也是对手在不打架的情况下解决争端的方式。然而,有一些行为模式,很难测试通信函数的存在,因为可能涉及几种类型的感官模式。例如,传染性打哈欠是哺乳动物的一种沟通行为,可能通过视觉、听觉、嗅觉或这些感官的组合发生,这取决于这些动物是否彼此熟悉。因此,为了检验关于这种行为可能的传播作用的假设,需要一种合适的方法来识别参与的感官模式。

这里提出的方法旨在获得熟悉和不熟悉的老鼠的哈欠传染曲线,并评估视觉和嗅觉感觉方式的相对参与。该方法使用廉价的材料,并且稍作变化,也可以与其他啮齿动物物种,如小鼠使用。总体而言,该方法涉及用不透明的分隔线(带或不带孔)替换清晰的分隔器(带或不带孔),允许或阻止放置在相邻笼子中的老鼠之间的通信,相邻两侧有孔。因此,可以测试四种情况:嗅觉沟通、视觉交流、视觉和嗅觉沟通,以及视觉和嗅觉沟通。当大鼠之间发生社会互动时,这些测试条件模拟了自然环境中可能发生的情况。在这方面,这里提出的方法比依赖视频演示的传统方法更有效,因为视频演示的生物有效性会引起关注。然而,它没有区分听力的潜在作用和嗅觉和视觉在哈欠传染中的作用。

引言

传统上,沟通行为是从两个角度来研究的。从一个角度,动物学家观察和记录动物在自然环境中的行为,并试图识别其适应性值1。所涉及的特定感觉或感官并不是这些研究的主要兴趣。从另一个角度看,生理学家更感兴趣的是解开动物交流^的机制。因此,实验室研究提供了方法,以解决感觉模式在沟通2,3的作用。这两种观点确实是互补的,因为对适应价值和直接机制的认识对于全面了解动物社会生活中的传播行为是必要的。

偏航行为是几种脊椎动物4行为中一个突出的组成部分,从鱼到灵长类动物5。它可以描述为缓慢张开口并保持其开口位置,然后更迅速地关闭口5。整个序列的持续时间取决于物种;例如,灵长类动物打哈欠的时间比非灵长类动物长6。在许多物种中,以人类为例外,男性往往比雌性7更频繁地打哈欠。此功能可能支持打哈欠的可能通信功能,尽管打哈欠的常规模式及其每日频率也可能暗示一种生理功能。在大鼠中,自发打哈欠遵循昼夜节律,高峰出现在上午和下午8、9。

打哈欠行为的一个有趣特征是,它可以是一种传染性行为(当一种行为的释放刺激恰好是另一种动物以同样的方式行为10)在几个种类的脊椎动物11,12, 13、14、15、16,包括^鸟类17只和啮^齿动物18只。此外,最近的证据表明,传染性打哈欠可能反映了沟通作用,因为一只大鼠打哈欠会影响另一只老鼠的生理状态,当暴露于嗅觉^线索19。然而,打哈欠是否具有沟通作用仍在争论中,20、21,分析传染性打哈欠是解决这一问题的第一步。

另一方面,传染性打哈欠与动物同情其他动物的观点的能力有关;因此,关系密切的个人更有可能表现出传染4。这个假说经常在实验室条件下被测试,在实验室条件下,动物在视频12,13上呈现了哈欠刺激;因此,传染只能通过视觉线索发生。其他调查已经评估了哈欠在更自然条件下使用动物组14,15。一个主要问题是,社会互动的动物经常对通过感官模式组合传递的线索和交换信号做出反应。将给定行为中涉及的实际感官与其综合效应分开并不总是一件容易的事。通常,研究人员在药理学上或手术上阻碍动物使用某种感觉,然后推断该感在相关行为2、3、18、22中的作用。幸运的是,还有其他方法,其中只使用物理障碍,以允许或阻碍动物之间的通信23,24,25,从而达到更大的生物有效性。

这里提出的方法被专门设计用于研究在社交环境中熟悉和不熟悉的老鼠的传染性打哈欠。根据同情假说,前一组应该更容易感染打哈欠。该方法不要求动物在手术或药理学上失去任何感官。相反,它的工作原理是将大鼠放在有孔的相邻笼子里,并使用带或无孔的透明或不透明分隔线物理阻碍它们的通信。因此,可以检查四个测试条件:(1) 嗅觉通信(OC,穿孔不透明分频器),(2) 视觉通信(VC,非穿孔清除分频器),(3) 视觉和嗅觉通信(VOC,穿孔清除分频器),和(4) 两者均视觉或嗅觉通信(NVOC,非穿孔不透明分频器)。因此,研究人员可以比较嗅觉、视觉和听觉暗示在打哈欠传染中的相对贡献。这种方法并不新鲜,因为类似的方法已经被用来分离某些动物,如^蜥蜴23和^小鼠26的感官。事实上,盖洛普^和27号同事也用类似的方法来证明视觉线索在发芽打哈欠中传染性打哈欠的作用。这些方法的主要特点是模拟社会背景和对动物造成的压力最小。此外,使用相互作用的动物增加了结论的生物有效性。

有几种方法可以测量传染性打哈欠25,28。Stephen E. G. Lea博士(个人交流,2015年)帮助我们在数值上适应了灵长类动物学家13、14以前采用的方法,以便对这里使用的数据进行早期分析。该协议中介绍的是此方法的增强版本,具有更广泛的应用程序范围。它包括按与时间窗口内外的观测时间比例对大鼠在给定时间窗口内外的哈欠总数进行加权。

例如,如果假定观察到大鼠 A 和 B 12 分钟,则其打哈欠记录到最接近的分钟,并设置 3 分钟时间窗口以测量传染性打哈欠。接下来,考虑每个大鼠的以下打哈欠序列:大鼠A(0,0,0,1,0,0,2,0,0,2,1)和大鼠B(0,1,1,1,1,0,0,0,0,3)。需要注意的是,每个数字 (0-3) 对应于每分钟打的哈欠数。对于大鼠 A,在第 1 分钟、10 分钟和第 11 分钟(粗体字数字)期间,大鼠 B 不会在前 3 分钟(所选时间窗口)或该分钟内打哈欠。在这几分钟里,老鼠A总共打哈欠2次。因此,没有任何哈欠刺激(非打哈欠后打哈欠率)的大鼠 A 的哈欠率为 2/3(即 0.67 打哈欠/分钟)。在剩下的9分钟内,大鼠B在同一分钟或前3分钟内至少打哈欠一次。老鼠A在这9分钟内总共打哈欠4次。因此,大鼠 A 响应打哈欠刺激(打哈后打哈欠率)的哈欠率为 4/9(即 0.44 打哈欠/分钟)。对大鼠 B 应用相同的程序会产生 2/3(即 0.66)的非后哈欠打哈欠率和5/9(0.55)的后打哈欠率。

另一方面,如果打哈欠记录到最接近的十进制一分钟,打哈欠传染将导致调整后的打哈欠时间。例如,如果记录大鼠A和B在12分钟的观察期内的以下打哈欠时间:大鼠A(2.3、5.1、5.8、10.4、10.8、11.1)和大鼠B(1.2、2.4、4.5、5.1、11.2、11.6、11.8)。 对于大鼠 A,大鼠 B 在过去 3 分钟内不打哈欠的时间段范围为 0 到 1.2 分钟,从 8.1 到 11.2 分钟(即 3.1 分钟),总共产生 4.3 分钟的非节后时间。大鼠 A 在这段时间内打哈欠的次数是 3(粗体字数字),因此非哈欠后打哈欠率为 3/4.3(即 0.69),而后哈欠打哈欠率为 3/7.7(即 0.38;分母为 12-4.3 分钟)。同样,对于大鼠 B,大鼠 A 在过去 3 分钟内不打哈欠的时间段范围为 0 到 2.3 分钟和 8.8 到 10.4 分钟,总共产生 3.9 分钟。大鼠 B 打哈欠的次数是 1,因此非后哈欠打哈欠率为 1/3.9(即 0.25)。因此,打哈欠后打哈欠率为 6/8.1(即 0.74)。

虽然行为上的接近同时期匹配是证明传染存在的理想标准,但诸如个人关注内容的限制、对刺激的反应时间、行为随时间分布(例如打哈欠)等方面可能发生在情节),时间适应实验设置都导致物种差异,使其难以使用独特的时间窗口。这可能是为什么研究人员使用的时间窗口从秒5到几分11,这在比较^结果28时产生问题的原因。因此,建议在一系列时间窗口中重复上述过程,以获得哈欠传染曲线,并比较物种之间的哈欠传染曲线。

通过随机分布观察期内每只大鼠观察到的哈欠数,可以比较等效的哈欠传染曲线。因此,建议的测量哈欠传染的方法提供了两种类型的控制:(1) 在时间窗口之外发生的打哈欠速率(非打哈欠时间)和 (2) 从哈欠数的随机分布中获得的人工打哈欠传染曲线。因此,分析哈欠传染的方法是从其他程序(例如,将单个时间窗口内打哈欠的百分比或频率与在此窗口²⁵之外发生的操作相比)的一个步骤,而不考虑实际时间帧。该方法辅以基于 R 的程序^29,方便和客观地计算一个或多个时间窗口的传染性打哈欠概率。

为了说明此方法的有用性以及基于 R 的程序的优点,使用了以前发布的研究¹⁸中的数据集。实验条件包括144只雄性大鼠被分配到一个熟悉或不熟悉的条件。在每个实验条件下的大鼠被分成四组,共九对,并暴露于上述四种测试情况中的任何一个。大鼠在每次实验条件和试验情况中的打哈欠行为,然后记录在60分钟的周期内。

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研究方案

实验规程和畜牧业是按照体制准则进行的。

1. 材料

1. 在"材料表"中查找用于实现该方法的材料的完整列表。使用图 1并寻求专家建议构建倒置 T 形桌子、观察保持架和保持架分隔线。请遵循安全指示,以便使用锋利的工具和潜在危险材料。
2. 将两根类似栏杆的木条(45 厘米长,彼此分开 0.6 厘米)胶合在顶部和一块木头中间(100 厘米 x 45 厘米 x 1.5 厘米),制作一个倒置的 T 形桌子。然后,将第二块木材(50 厘米 x 45 厘米 x 0.6 厘米)垂直放置在类似栏杆的杆之间。确保第二块木头防止一侧的一对大鼠看到另一侧的另一对(图1)。
3. 使用玻璃和丙烯酸创建八个观察笼。确保每个保持架(19 厘米宽、19 厘米长、10 厘米高、3 毫米厚)在其一侧中间排列 24 个等距孔(直径 5 毫米)。使丙烯酸的这一侧(3毫米厚)和缩短对一侧的高度0.7厘米,让老鼠呼吸。
   1. 确保每个观察笼都有一个丙烯酸制成的滑动盖,以防止大鼠在60分钟的观察期间饲养和分散自身注意力。
4. 制作四个丙烯酸分压器(19 厘米宽,30 厘米高,3 毫米厚)。钻24个孔(直径5毫米),与观察笼中的孔匹配,每个孔位于一个清晰的分隔器和一个不透明的分隔器中。
5. 提前准备数据表,以记录打哈欠的发生。在每个数据表的标题中,包括观察者的姓名、实验条件(即熟悉或不熟悉的大鼠)、相关的测试情况(OC、VC、VOC、NVOC)、观察的日期以及初始和最后时间。将数据表的其余部分分成两列,每列的上半部分都写有大鼠的数量,以记录大鼠的打哈行为。

2. 程序

1. 在塑料笼(家庭笼子)中,有144只雄性大鼠,从关从手到成年2.5个月。不要使用雌性大鼠,因为它们往往表现出更大的行为变异,由于荷尔蒙周期,这可能与测试情况的影响混淆。确保每个笼子里的老鼠不是兄弟姐妹。
   注:可能很难将所有大鼠放在一起。在这种情况下,创建至少8个熟悉的大鼠和8个不熟悉的老鼠块,以便每个测试情况在每个实验^条件30中代表一次。
2. 要识别大鼠,请使用商业标记在尾部用符号编号标记它们。例如,通过组合点和线来表示数字 1 到 4(例如,数字 1 的一个点和数字 4 的一行)。使用不同的颜色识别熟悉和不熟悉的老鼠。
   注:按照动物设施工作人员提供的安全指示处理大鼠,并遵守有关在进行实验的机构正确使用实验动物的建议。
3. 随机选择哪些家庭笼子将容纳一组熟悉的老鼠,哪些将容纳不熟悉的群体。例如,假设有 16 只可用的大鼠生活在四个家庭笼子里:将家庭笼子编号为 1 到 4,然后使用 R(在 http://cran.r-project.org/下载),如下所示 [在提示后 (>)]:
   > 样品 (4,4)
   [1] 4 3 2 1
   1. 将家中笼子里的熟悉(或不熟悉)大鼠分组4和3,将不熟悉(或熟悉)的老鼠分组到家庭笼子2和1。确保动物设施工作人员保持每个笼子的身份,并像动物设施中所有其他大鼠一样处理老鼠。
   2. 再次使用R程序,并随机选择大鼠在每个实验条件下形成每对。确保每对熟悉大鼠中的大鼠来自同一个家庭笼子,并确保不熟悉的组对的对子的情况相反。在每个实验条件下,随机选择对大鼠的每种测试情况。
4. 每天执行两次测试会话,每个测试会话(即 60 分钟的观察期)在八种可能的测试情况中执行两个(每个熟悉和不熟悉的大鼠 4 个)。在 3 小时内连续进行两个测试会话。
   注意:确保在上午或下午进行所有测试(每天四对大鼠),以避免任何混淆因素。在连续两天运行实验的完整复制(八种测试情况)。
   1. 确保对实验的每个复制都使用随机序列中的测试情况。例如,使用数字 1 到 8 来标识每个测试情况,然后使用 R,如下所示:
      > 样品(8,8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. 将测试情况 8 和 7 分配给测试会话 1,测试情况 4 和 6 以测试会话 2,等等。然后,随机选择倒置 T 形表的一侧,其中将放置每对大鼠(测试情况)。
5. 对实验的第二次复制(即块)重复相同的过程(步骤 2.3 到 2.4.2)。
   注:如果研究的目的是测试社会状况(即两只相互作用的老鼠)对打哈欠频率的影响,则使用一只放置在空观察笼旁的观察笼中的大鼠作为四种测试情况中的每一种控制。对一组由8只大鼠组成的对照组,针对每个测试情况执行此实验2次。
6. 通过将前四只大鼠从动物设施转移到观察室,设置测试会话,在那里它们将停留 15 分钟以适应新的环境。将大鼠单独运送到单独的笼子里,并在运输过程中和观察室中将它们分开。
   注:按照动物设施工作人员提供的安全说明运输动物,并使用指示的衣服在实验室中与动物一起工作。老鼠在观察室时无法获得食物和水。
7. 适应期过后,将倒型 T 形表放在较大的矩形表上。在进行观察时,确保有一个足以照亮房间的吊灯。
8. 将滤纸放在每个观察笼的底部,并将笼子成对放在倒置 T 形桌子的两侧。将相应的分隔线放置在每对保持架之间。
   注:滤纸使清洁笼子更容易,并提供粗糙的表面,大鼠可以移动而不打滑。
9. 战略性地放置两个数字摄像机,以便每个摄像机记录每对大鼠的打哈欠行为。确保摄像机安全地固定在三脚架上,并正确定向到观察笼。将摄像机连接到台式计算机,同时监控大鼠的行为。
   注:将数字信息存储在闪存驱动器上,以永久存档实验会话。使用存储容量高的闪存驱动器。
10. 适应期后,按照先前确定的分配,将大鼠放入观察笼中。设置摄像机的自动对焦,并同时使用秒表开始视频录制。在 60 分钟观察期结束时停止视频录制。
    注:虽然实验者在测试期间可能处于房间外并远程观察,但建议一个人在观察室(尽可能远离实验环境),同时监测大鼠的行为,确保测试会话不中断。
11. 观察结束后,将老鼠送回动物设施中的家中笼子。要求动物设施的工作人员确保老鼠再次获得食物和水。使用无毒洗涤剂彻底清洁观察笼,并准备实验设置,以执行当天的第二次也是最后一次测试。
    注:清洁木材,去除大鼠放入观察笼时留下的任何气味,这可能会影响下一对被测试的老鼠的行为。
12. 训练一到两名部分失明的志愿者使用全事件采样方法识别和记录打哈欠。确保观察者使用简介部分中描述的打哈欠的定义。
13. 使用任何标准播放系统在计算机屏幕上播放和投影每个视频。要求观察者查看每个视频,并使用先前准备的数据表观察和记录打哈欠行为,然后允许他/她以较慢的速度查看视频,以提高观察和测量打哈欠的能力。
    1. 要求观察者使用类似于以下内容的记号系统打分:使用以分钟书写的垂直行表示打哈欠的发生(例如, |³ |⁶ |^9,表示第 3 分钟打哈欠 1 次,第 6 分钟打两次哈欠,第 9 分钟打一次哈欠。打打哈欠作为序列(例如,1.2、2.2、3.2、5.0、5.8)进行打哈欠,以更精确地记录它(分钟四舍五入到小数点后一位)。
    2. 或者,使用标准数据收集程序将视频数据直接输入计算机。确保观察者熟悉此类程序。
       注: 如有必要,允许观察者在多个会话中查看每个视频。确保一个观察者查看与一个实验块对应的所有视频。如果两个不同的观察者观看了这些视频,他们观察和记录打哈欠的能力差异可能会混淆测试情况的影响。在 10%-20% 的视频中对不同观察者之间的观察者内部可靠性进行评分非常重要,以确保以相同的方式对打哈欠进行批号。

3. 数据处理

1. 将每个大鼠的打哈欠的时间顺序从数据表转录到电子表格。确保每只大鼠有一个短标题的列(例如,fr1.l 和 fr1.r,分别指示左右两侧的第一对熟悉的大鼠)。 通过用 0 或 NA 填充空单元格,确保所有列的长度相同(见下文)。
   注:使用作为补充文档提供的一般指南,充分理解处理数据、测量传染性打哈欠和获得传染性打哈欠曲线的步骤。
   1. 如果打哈欠记录到最近的分钟,请在每个相关分钟键入打哈欠数,并在给定分钟内未发生打哈欠时使用 0(无打哈欠)填充单元格。将工作表另存为文本文件 (.txt)。
   2. 如果打哈欠记录到最接近十进制一分钟,请自上而下键入序列并使用"NA"来填充列(大鼠)的空白空间,其中哈欠(行)的数量低于列的数量(行),其中记录为 r 的最大哈欠数(行)数为 r在。将工作表另存为文本文件 (.txt)。
      注: 由于 R 能够处理空单元格,因此工作表可以保存为不同长度的列。使用 R 提供的帮助选项来处理丢失的数据。
2. 启动 R. 从以前所在的文件中导入数据。
3. 使用扩展程序代码保存"。R"(作为补充材料提供),然后下载特定的程序代码(见一般指南),具体取决于是将哈欠记录为整数还是小数。为每对大鼠和所需时间范围运行程序。
   1. 再次运行程序,现在使用每个大鼠的哈欠数的随机分布(见一般指南)。对于所有实验条件(即熟悉和不熟悉的大鼠)和/或所有测试情况,请遵循相同的步骤(步骤 3.3 到 3.3.1)。按照常规指南中所述继续,并将结果导出到 Excel。
      注意:不要像上面建议的那样导入以前保存的程序,而是复制该程序并将其直接粘贴到 R 的工作区中。
4. 要创建哈欠传染曲线,请使用以前保存在电子表格中的数据。从每对大鼠的传染率、时间窗口和测试情况中减去非传染率。分离观测数据和人工(随机分布)数据的分析。
   1. 接下来,使用引导过程计算每个时间窗口和测试情况的置信区间 (CI)(请参阅常规指南)。分离对熟悉和不熟悉的老鼠的分析。然后,结合每个实验条件的四个测试情况的人工数据,并使用引导过程计算每个时间窗口的 CI。
   2. 接下来,为每个测试情况和实验条件创建绘图(参见图 2和图 3)。最后,执行多重回归分析,以比较测试情况之间的哈欠传染强度(见下文)。

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结果

这些大鼠是从先前生产的斯普拉格-道利大鼠的子系中挑选出来的,这些子系被选作频繁打哈欠(大约每小时22个打哈^欠31)。然而,每组测试情况使用的9对陌生大鼠和9对熟悉的雄性大鼠(年龄在2.5至3个月之间)每小时打哈欠约12次,^平均为18次。因此,测试情况测量打哈欠传染部分抑制了打哈欠行为。

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讨论

为了获得成功的结果,该方法中应考虑一些关键步骤。熟悉的老鼠在两次骨后和进行实验之前,必须共用家庭笼子至少1.5个月。然而,不熟悉的老鼠必须住在单独的家庭笼子里。在这两种情况下,对大鼠必须来自不同的垃圾,但年龄尽可能相似。关于观察笼,它们的孔应该与分频器中的孔匹配,因为这是保证大鼠之间嗅觉接触的唯一方法。另一方面,分隔线应足够清晰,以确保视觉接触或不透明,以确保没有视...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.