Eine Labormethode zur Messung des ansteckenden Gähnens bei Ratten

Zusammenfassung

Die hier beschriebene Methode zielt darauf ab, Gähnen ansteckungskurven in Paaren vertrauter oder unbekannter männlicher Ratten zu erhalten. Käfige mit Löchern, die durch klare oder undurchsichtige Trennwände mit (oder ohne) Löchern getrennt sind, werden verwendet, um zu erkennen, ob visuelle, olfaktorische oder beide Arten von sensorischen Hinweisen die Gähnansteckung stimulieren können.

Zusammenfassung

Kommunikation ist ein wesentlicher Aspekt des gesellschaftlichen Lebens der Tiere. Tiere können sich gegenseitig beeinflussen und in Schulen, Herden und Herden zusammenkommen. Kommunikation ist auch die Art und Weise, wie Geschlechter während der Balz interagieren und wie Rivalen Streitigkeiten ohne Kampf beilegen. Es gibt jedoch einige Verhaltensmuster, für die es schwierig ist, das Vorhandensein einer kommunikativen Funktion zu testen, da wahrscheinlich mehrere Arten von sensorischen Modalitäten beteiligt sind. Zum Beispiel ist ansteckendes Gähnen ein kommunikativer Akt bei Säugetieren, der möglicherweise durch Sehen, Hören, Riechen oder eine Kombination dieser Sinne auftritt, je nachdem, ob die Tiere einander vertraut sind. Um Hypothesen über die mögliche kommunikative Rolle solcher Verhaltensweisen zu testen, ist daher eine geeignete Methode erforderlich, um die beteiligten sensorischen Modalitäten zu identifizieren.

Die hier vorgeschlagene Methode zielt darauf ab, Gähnenansteckungskurven für vertraute und unbekannte Ratten zu erhalten und die relative Beteiligung visueller und olfaktorischer sensorischer Modalitäten zu bewerten. Die Methode verwendet kostengünstige Materialien, und mit einigen geringfügigen Änderungen, kann es auch mit anderen Nagetierarten wie Mäusen verwendet werden. Insgesamt beinhaltet die Methode die Substitution von klaren Trennwänden (mit oder ohne Löcher) durch undurchsichtige Trennwände (mit oder ohne Löcher), die die Kommunikation zwischen Ratten, die in angrenzenden Käfigen platziert werden, mit Löchern in angrenzenden Seiten ermöglichen oder verhindern. Dementsprechend können vier Bedingungen getestet werden: olfaktorische Kommunikation, visuelle Kommunikation, sowohl visuelle als auch olfaktorische Kommunikation, und weder visuelle noch olfaktorische Kommunikation. Da soziale Interaktion zwischen den Ratten stattfindet, simulieren diese Testbedingungen, was in einer natürlichen Umgebung auftreten kann. In dieser Hinsicht ist die hier vorgeschlagene Methode wirksamer als herkömmliche Methoden, die sich auf Videopräsentationen stützen, deren biologische Gültigkeit Anlass zu Bedenken geben kann. Nichtsdestotrotz unterscheidet es nicht zwischen der potenziellen Rolle des Hörens und der Rolle des Geruchs und des Sehens bei der Gähnansteckung.

Einleitung

Traditionell wurde das Kommunikativverhalten aus zwei Perspektiven untersucht. Aus einer Perspektive beobachten und erfassen Ethologen das Verhalten von Tieren in natürlichen Umgebungen und versuchen, ihren adaptiven Wert¹zu erkennen. Der besondere Sinn oder die Sinne, die damit verbunden sind, waren nicht das primäre Interesse dieser Studien. Aus einer anderen Perspektive sind Physiologen mehr daran interessiert, die Mechanismen zu entwirren, mit denen Tiere kommunizieren¹; Daher haben Laborstudien Methoden zur Verfügung gestellt, um die Rolle zu adressieren, die sensorische Modalitäten in der Kommunikation^2,3spielen. Diese beiden Perspektiven ergänzen sich in der Tat, da das Wissen sowohl über den adaptiven Wert als auch über unmittelbare Mechanismen notwendig ist, um ein umfassendes Verständnis von kommunikativen Verhaltensweisen im gesellschaftlichen Leben von Tieren zu erlangen.

Gähnverhalten ist ein auffälliger Bestandteil des Verhaltensrepertoires bei mehreren Wirbeltierarten⁴, von Fischen bis zu Primaten⁵. Es kann als eine langsame Öffnung des Mundes und die Aufrechterhaltung seiner offenen Position beschrieben werden, gefolgt von einem schnelleren Verschluss des Mundes⁵. Die Dauer der gesamten Sequenz hängt von der Art ab; zum Beispiel gähnen Primaten länger als Nicht-Primatenarten⁶. Bei vielen Arten, bei denen der Mensch die Ausnahme bildet, neigen Männchen dazu, häufiger zu gähnen als Weibchen⁷. Diese Funktion könnte die mögliche kommunikative Funktion des Gähnens untermauern, obwohl regelmäßige Muster des Gähnens und seine tägliche Frequenz auch auf eine physiologische Funktion hindeuten können. Bei Ratten folgt das spontane Gähnen einem zirkadianen Rhythmus, mit Spitzen der hohen Frequenz am Morgen und Nachmittag^8,9.

Ein interessantes Merkmal des Gähnverhaltens ist, dass es eine ansteckende Handlung sein kann (wenn der releasestimulus eines Verhaltens zufällig ein anderes Tier ist, das sich auf die gleiche Weise verhält¹⁰) bei mehreren Arten von Wirbeltieren^{11,12, 13,14,15,16}, einschließlich Vögel¹⁷ und Nagetiere¹⁸. Darüber hinaus haben jüngste Beweise gezeigt, dass ansteckendes Gähnen eine kommunikative Rolle widerspiegeln kann, weil das Gähnen einer Ratte den physiologischen Zustand einer anderen beeinflussen kann, wenn sie olfaktorischen Hinweisen ausgesetzt ist¹⁹. Allerdings ist die Frage, ob Gähnen eine kommunikative Rolle hat oder nicht, noch in der Debatte^20,21, und die Analyse ansteckenden Gähnens ist ein wesentlicher erster Schritt, um dieses Problem zu lösen.

Auf der anderen Seite wurde ansteckendes Gähnen mit der Fähigkeit eines Tieres verbunden, sich mit den Perspektiven anderer Tiere zu veranschlagen; daher sind eng verwandte Personen eher ansteckung sanieren⁴. Diese Hypothese wurde häufig unter Laborbedingungen getestet, unter denen Tiere auf Video^12,13mit Gähnreizen dargestellt werden. Daher kann eine Ansteckung nur durch visuelle Hinweise auftreten. Andere Untersuchungen haben die Ansteckung von Gähnen unter natürlicheren Bedingungen unter Verwendung von Tiergruppen^14,15bewertet. Ein großes Problem dabei ist, dass sozial interagierende Tiere oft auf Hinweise reagieren und Signale austauschen, die durch Kombinationen sensorischer Modalitäten vermittelt werden. Die eigentlichen Sinne eines bestimmten Verhaltens von ihren kombinierten Effekten zu entwirren, ist nicht immer einfach. Typischerweise behindern Forscher pharmakologisch oder chirurgisch die Verwendung eines bestimmten Sinnes durch ein Tier und leiten dann die Rolle dieses Sinnes im relevanten Verhalten^{ab 2,3,18,22}. Glücklicherweise gibt es andere Methoden, bei denen nur physikalische Barrieren verwendet werden, um die Kommunikation zwischen den Tieren^23,24,25zu ermöglichen oder zu behindern, wodurch eine größere biologische Gültigkeit erreicht wird.

Die hier vorgeschlagene Methode wurde speziell entwickelt, um ansteckendes Gähnen bei vertrauten und unbekannten Ratten in einem sozialen Umfeld zu untersuchen. Nach der einfühlsamen Hypothese sollte die erste Gruppe anfälliger für ansteckendes Gähnen sein. Die Methode erfordert nicht, dass die Tiere chirurgisch oder pharmakologisch ihrer Sinne beraubt werden. Stattdessen funktioniert es, indem die Ratten in angrenzenden Käfigen mit Löchern platziert werden und ihre Kommunikation physisch mit klaren oder undurchsichtigen Trennwänden mit oder ohne Löcher behindert wird. So können vier Prüfbedingungen untersucht werden: (1) olfaktorische Kommunikation (OC, perforierte opake Trennwand), (2) visuelle Kommunikation (VC, nicht perforierte klare Trennwand), (3) visuelle und olfaktorische Kommunikation (VOC, perforierte klare Trennwand) und (4) visuelle oder olfaktorische Kommunikation (NVOC, nicht perforierte opake Trennwand). Daher können Forscher die relativen Beiträge von olfaktorischen, visuellen und bis zu einem gewissen Grad auditiven Hinweisen bei gähnender Ansteckung vergleichen. Dieser Ansatz ist nicht neu, da ähnliche Methoden verwendet wurden, um die Sinne zu isolieren, die an bestimmten kommunikativen Verhaltensweisen bei Tieren wie Eidechsen²³ und Mäusen²⁶beteiligt sind. Tatsächlich haben Gallup und Kollegen²⁷ eine ähnliche Methode verwendet, um die Rolle visueller Hinweise beim ansteckenden Gähnen in Budgerigars zu demonstrieren. Die Hauptmerkmale dieser Methoden sind die Simulation eines sozialen Kontextes und die minimale Belastung der Tiere. Darüber hinaus erhöht die Verwendung interagierender Tiere die biologische Gültigkeit der Schlussfolgerungen.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, ansteckendes Gähnen zu messen^25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (persönliche Kommunikation, 2015) half uns numerisch eine Methode anzupassen, die zuvor von Primatologen^13,14 für eine frühere Analyse der hier verwendeten Daten verwendet wurde¹⁸. In diesem Protokoll wird eine erweiterte Version dieser Methode mit einem breiteren Anwendungsspektrum vorgestellt. Es besteht darin, die Gesamtzahl der Gähnen einer Ratte innerhalb und außerhalb eines bestimmten Zeitfensters nach dem Anteil der Beobachtungszeit zu gewichten, der den Gähnen innerhalb und außerhalb des Zeitfensters entspricht.

Wenn beispielsweise angenommen wird, dass Ratten A und B 12 minuten lang beobachtet werden, wird ihr Gähnen bis zur nächsten Minute aufgezeichnet, und ein Zeitfenster von 3 minuten wird so eingestellt, dass ansteckendes Gähnen gemessen wird. Als nächstes werden die folgenden Gähnsequenzen für jede dieser Ratten berücksichtigt: Ratte A (0,0,0,0,0,0,0,0,2,1) und Ratte B ( 0,1,1,1,1,0,0,0,0,0,3). Es sollte beachtet werden, dass jede Zahl (0-3) der Anzahl der Gähnen entspricht, die in jedem Min. erzielt werden. Bei Ratte A gähnt Ratte B in den Minuten 1, 10 und 11 (Zahlen in Fettschrift) nicht innerhalb der vorhergehenden 3 Minuten (das gewählte Zeitfenster) oder innerhalb dieser Minute. In diesen Minuten gähnt Ratte A insgesamt 2 Mal. Daher beträgt die Gähnrate der Ratte A ohne Gähnreiz (nicht-post-yawn gähnenRate) 2/3 (d.h., 0,67 Gähnen/min). In den verbleibenden 9 Minuten gähnt Ratte B mindestens einmal entweder in der gleichen Minute oder in den 3 vorherigen Minuten. Ratte A gähnt insgesamt viermal in diesen 9 min. Daher ist die Gähnrate der Ratte A als Reaktion auf einen Gähnreiz (post-gähnende Gähnrate) 4/9 (d.h., 0,44 Gähnen/min). Die Anwendung des gleichen Verfahrens auf Ratte B ergibt eine nicht-post-gähnende Gähnrate von 2/3 (d.h. 0,66) und eine Gähnrate nach dem Gähnen von 5/9 (0,55).

Auf der anderen Seite, wenn Gähnen auf die nächste Dezimalstelle von einer Minute aufgezeichnet wird, gähnen Ansteckung führt zu einer angepassten Post-Gähnzeit. Wenn beispielsweise die folgenden Gähnzeiten über einen Beobachtungszeitraum von 12 Minuten für Ratten A und B aufgezeichnet werden: Ratte A (2.3, 5.1, 5.8, 10.4, 10.8, 11.1) und Ratte B (1.2, 2.4, 4.5, 5.1, 11.2, 11.6, 11.8). Bei Ratte A reichen die Zeiträume, über die Ratte B nicht in den letzten 3 min gähnt, zwischen 0 und 1,2 min und von 8,1 bis 11,2 min (d.h. 3,1 min), was insgesamt 4,3 min Nicht-Post-Gähnzeit ergibt. Die Anzahl der Gähnen von Ratten A in diesen Zeiten ist drei (Zahlen in fettem Typ), so dass die Nicht-Post-Gähnen-Rate 3/4,3 (d.h., 0,69) beträgt, während die Rate nach dem Gähnen 3/7,7 (d.h. 0,38; der Nenner von 12-4,3 min) beträgt. Ebenso liegen für Ratte B die Zeiträume, über die Ratte A nicht in den letzten 3 min gähnt, zwischen 0 und 2,3 min und von 8,8 bis 10,4 min, was insgesamt 3,9 min ergibt. Die Anzahl der Gähnen von Ratte B innerhalb dieser Perioden ist eins, also ist die Nicht-Post-Gähnen-Rate 1/3,9 (d.h., 0,25). Dementsprechend beträgt die Rate nach dem Gähnen 6/8,1 (d.h., 0,74).

Während ein nahezu zeitgleiches Verhalten ein ideales Kriterium ist, um das Vorhandensein einer Ansteckung zu demonstrieren, sind Aspekte wie die Einschränkungen dessen, was eine Person betreut, die Reaktionszeit auf einen Stimulus, die Verteilung des Verhaltens im Laufe der Zeit (z. B. Gähnen kann in Episoden auftreten), und Zeit, sich an die experimentelle Einstellung zu gewöhnen, führen alle zu Artenunterschieden, was es schwierig macht, ein einzigartiges Zeitfenster zu verwenden. Dies kann der Grund sein, warum Forscher Zeitfenster verwendet haben, die von Sekunden⁵ bis zu mehreren Minuten¹¹variieren, was Probleme beim Vergleich der Ergebnisse²⁸schafft. Aus diesem Grund wird vorgeschlagen, das oben beschriebene Verfahren für einen Bereich von Zeitfenstern zu wiederholen, um Gähnungskurven zu erhalten und die Gähnansteckungskurven zwischen den Arten zu vergleichen.

Äquivalente Gähnenansteckungskurven können verglichen werden, indem die Anzahl der gähnenden Gähnen, die für jede Ratte während des Beobachtungszeitraums beobachtet wurden, nach dem Zufallsprinzip verteilt werden. So bietet die vorgeschlagene Methode zur Messung der Gähnansteckung zwei Arten von Kontrollen: die (1) Gähnrate, die außerhalb des Zeitfensters auftritt (nicht nach dem Gähnen) und (2) künstliche Gähnansteckungskurve, die aus der zufälligen Verteilung der Anzahl der Gähnen gewonnen wird. Daher ist dieser Ansatz zur Analyse der Gähnenansteckung ein Schritt vorwärts von anderen Verfahren, wie z. B. dem Vergleich des Prozentsatzes oder der Häufigkeit des Gähnens innerhalb eines einzigen Zeitfensters mit dem, das außerhalb dieses Fensters²⁵auftritt, ohne die tatsächliche Zeiten Rahmen. Ergänzt wird die Methode durch ein R-basiertes Programm^29, um die Wahrscheinlichkeit des ansteckenden Gähnens für ein oder mehrere Zeitfenster bequem und objektiv zu berechnen.

Um die Nützlichkeit dieser Methode und die Vorteile des R-basierten Programms zu veranschaulichen, wird ein Datensatz aus einer zuvor veröffentlichten Studie¹⁸ verwendet. Der experimentelle Zustand bestand aus 144 männlichen Ratten, die entweder einem vertrauten oder einem unbekannten Zustand zugeordnet waren. Die Ratten in jedem Versuchszustand wurden in vier Untergruppen mit neun Paaren unterteilt und einer der vier oben beschriebenen Testsituationen ausgesetzt. Das Gähnverhalten der Ratten in jedem Versuchszustand und jeder Testsituation wurde dann über einen Zeitraum von 60 min aufgezeichnet.

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Protokoll

Die Versuchsprotokolle und die Tierhaltung wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Leitlinien durchgeführt.

1. Materialien

1. Eine vollständige Liste der Materialien, die zum Implementieren der Methode verwendet werden, finden Sie in der Tabelle der Materialien. Verwenden Sie Abbildung 1, und suchen Sie expertenfreundliche Beratung, um einen invertierten T-förmigen Tisch, Beobachtungskäfige und Käfigteiler zu konstruieren. Befolgen Sie die Sicherheitshinweise für den Einsatz von scharfen Werkzeugen und potenziell gefährlichen Materialien.
2. Machen Sie einen invertierten T-förmigen Tisch, indem Sie zwei schienenartige Holzstäbe (45 cm Länge, getrennt 0,6 cm voneinander) auf die Oberseite und in der Mitte eines Holzstücks (100 cm x 45 cm x 1,5 cm) kleben. Dann legen Sie ein zweites Stück Holz (50 cm x 45 cm x 0,6 cm) vertikal zwischen die schienenförmigen Stangen. Stellen Sie sicher, dass dieses zweite Stück Holz verhindert, dass das Rattenpaar auf der einen Seite das andere Paar auf der gegenüberliegenden Seite sieht (Abbildung 1).
3. Verwenden Sie Glas und Acryl, um acht Beobachtungskäfige zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass jeder Käfig (19 cm breit, 19 cm lang, 10 cm hoch, 3 mm dick) 24 äquidistante Löcher (5 mm Durchmesser) in drei Reihen in der Mitte einer Seite angeordnet hat. Machen Sie diese Seite aus Acryl (3 mm dick) und verkürzen Sie die Höhe der gegenüberliegenden Seite um 0,7 cm, damit die Ratte atmen kann.
   1. Stellen Sie sicher, dass jeder Beobachtungskäfig einen Schiebedeckel aus Acryl hat, um zu verhindern, dass die Ratte während der 60-min-Beobachtungszeit aufzieht und sich ablenkt.
4. Machen Sie vier Trennwände aus Acryl (19 cm breit, 30 cm hoch, 3 mm dick). Bohren Sie 24 Löcher (5 mm Durchmesser), die denen in den Beobachtungskäfigen entsprechen, jeweils in einem klaren Teiler und einem undurchsichtigen Teiler.
5. Bereiten Sie Datenblätter im Voraus vor, um das Auftreten von Gähnen aufzuzeichnen. In der Überschrift jedes Datenblatts den Namen des Beobachters, den Versuchszustand (d. h. bekannte oder unbekannte Ratten), die relevante Testsituation (OC, VC, VOC, NVOC), das Datum sowie die Anfangs- und Endzeiten der Beobachtung einschließen. Teilen Sie den Rest des Datenblatts in zwei Spalten auf, jede mit der Nummer der Ratte, die im oberen Teil geschrieben ist, um das Gähnverhalten der Ratten aufzuzeichnen.

2. Verfahren

1. Haus 144 männliche Ratten in Gruppen von vier in Plastikkäfigen (Hauskäfige) von der Entwöhnung bis sie 2,5 Monate alt werden. Verwenden Sie keine weiblichen Ratten, weil sie dazu neigen, größere Variation im Verhalten aufgrund von hormonellen Zyklen zu zeigen, die mit den Auswirkungen der Testsituation verwechselt werden können. Stellen Sie sicher, dass die Ratten in jedem Käfig keine Geschwister sind.
   HINWEIS: Es kann schwierig sein, alle Ratten zusammen zu bekommen. Erstellen Sie in diesem Fall Blöcke von mindestens 8 vertrauten Ratten und 8 unbekannten Ratten, so dass jede Testsituation einmal in jedem Versuchszustand³⁰dargestellt wird.
2. Um die Ratten zu identifizieren, markieren Sie sie mit symbolischen Zahlen auf den Schwänzen mit einem kommerziellen Marker. Stellen Sie beispielsweise die Zahlen 1 bis 4 dar, indem Sie Punkte und Linien kombinieren (z. B. einen Punkt für Die Zahl 1 und eine Zeile für Die Zahl 4). Identifizieren Sie vertraute und unbekannte Ratten mit verschiedenen Farben.
   HINWEIS: Behandeln Sie die Ratten gemäß den Sicherheitshinweisen des Personals der Tiereinrichtung und halten Sie sich an Empfehlungen bezüglich der korrekten Verwendung von Labortieren in der Einrichtung, in der Dieversuche durchgeführt werden.
3. Wählen Sie zufällig aus, welche Hauskäfige die Gruppe der vertrauten Ratten beherbergen und welche die unbekannte Gruppe beherbergen wird. Angenommen, es gibt 16 verfügbare Ratten, die in vier Heimkäfigen leben: Nummerieren Sie die Hauskäfige 1 bis 4, verwenden Sie dann R (Download bei http://cran.r-project.org/) wie folgt [nach der Eingabeaufforderung (>)]:
   > Probe(4,4)
   [1] 4 3 2 1
   1. Gruppieren Sie die vertrauten (oder unbekannten) Ratten in den Hauskäfigen 4 und 3 und gruppieren Sie die unbekannten (oder vertrauten) Ratten in den Hauskäfigen 2 und 1. Stellen Sie sicher, dass das Personal der Tiereinrichtung die Identität jedes Käfigs behält und die Ratten auf die gleiche Weise wie alle anderen Ratten in der Tieranlage behandelt.
   2. Verwenden Sie das R-Programm erneut und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip Ratten aus, um jedes Paar in jeder experimentellen Bedingung zu bilden. Stellen Sie sicher, dass die Ratten in jedem Paar vertrauter Ratten aus demselben Hauskäfig stammen, und stellen Sie sicher, dass das Gegenteil für die Paare in der unbekannten Gruppe gilt. Wählen Sie zufällig Rattenpaare für jede Testsituation in jedem Versuchszustand aus.
4. Führen Sie zwei Testsitzungen pro Tag mit zwei der acht möglichen Testsituationen (vier für jede vertraute und unbekannte Ratte) pro Testsitzung (d. h. 60 min Beobachtungszeit) durch. Führen Sie die beiden Testsitzungen nacheinander innerhalb von 3 h durch.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie alle Testsitzungen (vier Rattenpaare pro Tag) entweder morgens oder nachmittags durchführen, um verwirrende Faktoren zu vermeiden. Führen Sie eine vollständige Replikation (acht Testsituationen) des Experiments an zwei aufeinanderfolgenden Tagen aus.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Testsituationen in einer zufälligen Reihenfolge für jede Replikation des Experiments verwendet werden. Verwenden Sie beispielsweise die Nummern 1 bis 8, um jede Testsituation zu identifizieren, und verwenden Sie dann R wie folgt:
      >Probe(8,8)
      [1] 8 7 4 6 5 1 2 3
   2. Weisen Sie die Testsituationen 8 und 7 testsitzung 1, Testsituationen 4 und 6 für Testsitzung 2 usw. zu. Wählen Sie dann nach dem Zufallsprinzip die Seite des invertierten T-förmigen Tisches aus, auf dem jedes Rattenpaar (Testsituation) platziert wird.
5. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren (Schritte 2.3 bis 2.4.2) für eine zweite Replikation (d.h. Block) des Experiments.
   HINWEIS: Wenn das Ziel der Studie darin besteht, die Auswirkungen einer sozialen Erkrankung (d. h. zwei interagierende Ratten) auf die Gähnhäufigkeit zu testen, verwenden Sie eine Ratte, die in einem Beobachtungskäfig neben einem leeren Beobachtungskäfig platziert ist, als Kontrolle für jede der vier Testsituationen. Führen Sie dieses Experiment 2x für jede Testsituation für eine Kontrollgruppe von acht Ratten durch.
6. Richten Sie die Testsitzung ein, indem Sie die ersten vier Ratten von der Tieranlage in den Beobachtungsraum bringen, wo sie 15 Min. bleiben, um sich an die neue Umgebung zu akklimatisieren. Transportieren Sie die Ratten in einzelnen Käfigen und halten Sie sie während des Transports und im Beobachtungsraum voneinander getrennt.
   HINWEIS: Befolgen Sie die Sicherheitshinweise für den Transport von Tieren, die vom Personal der Tiereinrichtung zur Verfügung gestellt werden, und verwenden Sie die angegebene Kleidung, um mit Tieren im Labor zu arbeiten. Die Ratten haben keinen Zugang zu Nahrung und Wasser, während sie sich im Beobachtungsraum befinden.
7. Legen Sie nach Ablauf der Akklimatisierungsphase den invertierten T-förmigen Tisch auf einen größeren rechteckigen Tisch. Stellen Sie sicher, dass es eine Deckenlampe gibt, die den Raum ausreichend beleuchtet, wenn Sie Beobachtungen machen.
8. Legen Sie Filterpapier auf die Unterseite jedes Beobachtungskäfigs und legen Sie die Käfige paarweise auf jeder Seite des invertierten T-förmigen Tisches. Positionieren Sie den entsprechenden Teiler zwischen jedem Käfigpaar.
   HINWEIS: Das Filterpapier erleichtert die Reinigung der Käfige und bietet eine raue Oberfläche, auf der sich die Ratten bewegen können, ohne zu rutschen.
9. Platzieren Sie strategisch zwei digitale Camcorder, so dass jeder das gähnende Verhalten jedes Rattenpaares aufzeichnet. Stellen Sie sicher, dass die Camcorder sicher an Stativen befestigt und korrekt an den Beobachtungskäfigen orientiert sind. Verbinden Sie die Camcorder mit einem Desktop-Computer, um gleichzeitig das Verhalten der Ratten zu überwachen.
   HINWEIS: Speichern Sie die digitalen Informationen auf Flash-Laufwerken, um die experimentellen Sitzungen dauerhaft zu archivieren. Verwenden Sie Flash-Laufwerke mit hoher Speicherkapazität.
10. Legen Sie die Ratten nach der Akklimatisierungsphase entsprechend der zuvor ermittelten Zuteilung in die Beobachtungskäfige. Stellen Sie den automatischen Fokus des Camcorders ein und starten Sie die Videoaufzeichnung gleichzeitig mit einer Stoppuhr. Beenden Sie die Videoaufzeichnung am Ende des 60-min-Beobachtungszeitraums.
    ANMERKUNG: Während sich die Experimentatoren während der Testsitzung außerhalb des Raumes befinden und aus der Ferne beobachten, wird empfohlen, dass sich eine Person im Beobachtungsraum befindet (so weit wie möglich von der experimentellen Einstellung entfernt), während sie das Verhalten der Ratten stellen Sie sicher, dass die Testsitzung ohne Unterbrechung fortgesetzt wird.
11. Wenn die Beobachtung vorbei ist, bringen Sie die Ratten in ihre Heimischen Käfige in der Tieranlage zurück. Bitten Sie das Personal der Tiereinrichtung, dafür zu sorgen, dass die Ratten wieder Zugang zu Nahrung und Wasser haben. Reinigen Sie die Beobachtungskäfige gründlich mit einem ungiftigen Reinigungsmittel und bereiten Sie den Versuchsaufbau vor, um die zweite und letzte Probe des Tages durchzuführen.
    HINWEIS: Reinigen Sie das Holz, um alle Düfte zu entfernen, die von den Ratten hinterlassen werden, wenn sie in den Beobachtungskäfigen platziert werden, was das Verhalten des nächsten getesteten Rattenpaares beeinflussen könnte.
12. Trainieren Sie ein bis zwei Freiwillige, die teilweise blind für die zugewiesenen Behandlungen sind, um Gähnen mit einer All-Occurrence-Sampling-Methode zu identifizieren und aufzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Beobachter die definition des Gähnens verwenden, die im Einführungsabschnitt beschrieben wird.
13. Wiedergeben und projizieren Sie jedes Video auf einem Computerbildschirm mit einem beliebigen Standard-Wiedergabesystem. Bitten Sie den Beobachter, jedes Video anzusehen und das Gähnverhalten mithilfe der zuvor erstellten Datenblätter zu beobachten und aufzuzeichnen, und erlauben Sie ihm dann, die Videos mit langsameren Geschwindigkeiten zu überprüfen, um die Fähigkeit zu beobachten und zu messen, gähnen zu können.
    1. Bitten Sie die Beobachter, mit einem Notensystem ähnlich dem folgenden zu punkten: Verwenden Sie vertikale Linien mit der Minute, die als Hochschrift geschrieben ist, um das Auftreten eines Gähnens darzustellen (z. B.., | ³ || ⁶ | ⁹, was auf ein Gähnen in Minute 3, zwei Gähnen in Minute 6 und ein Gähnen in Minute 9 hindeutet). Notieren Sie gähnen Als Sequenz (z. B. 1.2, 2.2, 3.2, 5.0, 5.8), um es mit größerer Genauigkeit aufzuzeichnen (Minuten auf eine Dezimalstelle gerundet).
    2. Alternativ können Sie daten aus den Videos auch direkt mit Standarddatenerfassungsprogrammen in einen Computer eingeben. Stellen Sie sicher, dass der Beobachter mit solchen Programmen vertraut ist.
       HINWEIS: Erlauben Sie dem Beobachter, jedes Video bei Bedarf in mehr als einer Sitzung anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass ein Beobachter alle Videos anzeigt, die einem Versuchsblock entsprechen. Wenn zwei verschiedene Beobachter diese Videos angesehen haben, besteht die Gefahr, dass Unterschiede in ihren Fähigkeiten, Gähnen zu beobachten und aufzuzeichnen, die Auswirkungen der Testsituationen verwirren. Es ist wichtig, die Intra-Beobachter-Zuverlässigkeit zwischen verschiedenen Beobachtern auf 10%-20% der Videos zu bewerten, um sicherzustellen, dass das Gähnen auf die gleiche Weise kommentiert wird.

3. Datenverarbeitung

1. Transkribieren Sie die zeitliche Abfolge von Gähnen in jeder Ratte aus den Datenblättern in eine Kalkulationstabelle. Stellen Sie sicher, dass es für jede Ratte eine Spalte mit einer kurzen Überschrift gibt (z.B. fr1.l und fr1.r, um das erste Paar vertrauter Ratten auf der linken bzw. rechten Seite anzugeben). Stellen Sie sicher, dass alle Spalten die gleiche Länge haben, indem Sie die leeren Zellen entweder mit 0 oder NA füllen (siehe unten).
   HINWEIS: Verwenden Sie die allgemeine Anleitung als ergänzendes Dokument, um die folgenden Schritte vollständig zu verstehen, um die Daten zu verarbeiten, ansteckendes Gähnen zu messen und ansteckende Gähnkurven zu erhalten.
   1. Wenn das Gähnen bis zur nächsten Minute aufgezeichnet wurde, geben Sie die Anzahl der Gähnen in jeder relevanten Minute ein und verwenden Sie 0 (kein Gähnen), um die Zellen auszufüllen, wenn in einer bestimmten Minute kein Gähnen aufgetreten ist. Speichern Sie das Arbeitsblatt als Textdatei (.txt).
   2. Wenn das Gähnen auf die nächste Dezimalzahl einer Minute aufgezeichnet wurde, geben Sie die Sequenz oben nach unten ein, und füllen Sie mit "NA" die leeren Leerzeichen von Spalten (Ratten) aus, in denen die Anzahl der Gähnen (Zeilen) niedriger ist als die anzahl der Gähnen (Zeilen) mit der maximalen Anzahl (Zeilen) der Gähnen, die für ein r aufgezeichnet wurden. an. Speichern Sie das Arbeitsblatt als Textdatei (.txt).
      HINWEIS: Da R die Möglichkeit hat, mit leeren Zellen zu arbeiten, kann das Arbeitsblatt mit Spalten unterschiedlicher Länge gespeichert werden. Verwenden Sie die von R bereitgestellten Hilfeoptionen, um fehlende Daten zu verarbeiten.
2. Initiieren Sie R. Importieren Sie die Daten aus der Datei, in der sie sich zuvor befanden.
3. Speichern Sie die Programmcodes mit der Erweiterung ". R" (als Zusatzmaterial zur Verfügung gestellt) laden Sie dann den spezifischen Programmcode herunter (siehe allgemeine Anleitung), je nachdem, ob Gähnen als ganze Zahlen oder Bruchzahlen aufgezeichnet wurden. Führen Sie das Programm für jedes Rattenpaar und die gewünschte Anzahl von Zeitrahmen aus.
   1. Führen Sie das Programm erneut aus, und verwenden Sie nun eine zufällige Verteilung der Anzahl der Gähnen von jeder Ratte (siehe allgemeine Anleitung). Führen Sie die gleichen Schritte (Schritte 3.3 bis 3.3.1) für alle experimentellen Bedingungen (d. h. vertraute und unbekannte Ratten) und/oder alle Testsituationen aus. Gehen Sie wie im allgemeinen Handbuch angegeben und exportieren Sie die Ergebnisse nach Excel.
      HINWEIS: Anstatt ein zuvor gespeichertes Programm zu importieren, wie oben vorgeschlagen, kopieren Sie das Programm mit einem Texteditor und fügen Sie es direkt in den Arbeitsbereich von R ein.
4. Um Gähnungskurven zu erstellen, verwenden Sie die zuvor in einer Kalkulationstabelle gespeicherten Daten. Subtrahieren Sie die Nichtansteckungsraten von den Ansteckungsraten für jedes Rattenpaar, Zeitfenster und Testsituation. Trennen Sie die Analysen der beobachteten Daten und künstlichen (zufällig verteilten) Daten.
   1. Berechnen Sie als Nächstes konfiszierbare Intervalle (CI) für jedes Zeitfenster und jede Testsituation mithilfe eines Bootstrap-Verfahrens (siehe allgemeine Anleitung). Trennen Sie die Analysen für vertraute und unbekannte Ratten. Kombinieren Sie dann die künstlichen Daten aus den vier Testsituationen für jede Versuchsbedingung und berechnen sie das CI für jedes Zeitfenster mit einem Bootstrap-Verfahren.
   2. Erstellen Sie als Nächstes Diagramme für jede Testsituation und jeden Versuchszustand (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). Führen Sie schließlich eine mehrfache Regressionsanalyse durch, um die Intensität der Gähnansteckung zwischen Testsituationen zu vergleichen (siehe unten).

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Ergebnisse

Die Ratten wurden aus einer zuvor produzierten Unterlinie von Sprague-Dawley-Ratten ausgewählt, die für häufiges Gähnen ausgewählt wurden (ungefähr 22 Gähnen pro Stunde³¹). Allerdings gähnten die neun Paare von unbekannten und neun Paaren vertrauter männlicher Ratten (zwischen 2,5 und 3 Monaten) pro Testsituation etwa 12 Mal pro Stunde, im Durchschnitt¹⁸. Daher hemmten die Testsituationen zur Messung der Gähnansteckung teilweise da...

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Diskussion

Es gibt kritische Schritte in der Methode, die berücksichtigt werden sollten, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Vertraute Ratten müssen sich nach der Entwöhnung und vor der Durchführung der Experimente mindestens 1,5 Monate lang Hauskäfige teilen. Unbekannte Ratten müssen jedoch in getrennten Heimkäfigen leben. In beiden Fällen müssen die Rattenpaare aus unterschiedlichen Würfen stammen, aber im Alter so ähnlich wie möglich sein. Was die Beobachtungskäfige betrifft, so sollten ihre Löcher mit denen in...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.